本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn)基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。

豆科植物不僅是人類食物中蛋白質(zhì)的主要來源，也是重要的飼料和油料作物。豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮系統(tǒng)是生物圈中氮循環(huán)的一個(gè)主要氮源。另外，豆科植物與廣宿主菌根真菌的相互作用，可促進(jìn)植物磷和其它礦物質(zhì)的吸收?？梢姡箍浦参锸欠浅Ｖ匾霓r(nóng)業(yè)作物。豆科植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物表達(dá)基因，對(duì)優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。

本發(fā)明人通過對(duì)蒺藜苜?；蚪M的深入研究，提供了一種新的豆科植物啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠調(diào)控豆科植物，尤其是苜蓿植物中目的基因的表達(dá)，同時(shí)為研究豆科植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具與選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明第一方面提供一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列：

a、具有如SEQ ID NO：1-5所示的任意一種核苷酸序列；

b、對(duì)上述a所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；

c、與上述a所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

所述SEQ ID NO：1的序列如下：

CTTATAACTGGAAAACCGACGTTAGTTAACTACCGCTGAGTTTTTGATTATTTCCATGTGTTTCTATGAAATAATGGATGTCAAAAAAGCAACCATCTAACTATTGGGATCCAAGAAACAAGAAAATGGAACCAATTTATGGACCTTAAAAAGTGATTTTACATACAAAAGAAAAGGAAGAGCTAGATAAGTGTACAATGCAGTGCAGCCCGTGGTCTCTATCTTCTAAAATTTAATACAGTATATCAATAACAACATCTCTGTATATAGTTTTCAAGAGAGTGTGGAACCGAACGAACCATCATTTATTATGCGATGAATCTTGGTGGCATTAAAATGATTGATAAGTTTAGAAGTGCAATGCATGTTAGTGTTTTATTTCCTAGTTGTCATACGCACACACAAAATAAGTCCCACATCGGTTAACATACATATTTATTTAATGTTTATATAACGCGCAAATGCTCTCTTCTATTG(SEQ ID NO：1)。

所述SEQ ID NO：2的序列如下：

TAAATGGGGCTCTTATCACAATACTTTTTTTAGGAATTACTTACTGTACATCTCCTTGGGAGATAGAAGGATTACTTTGAGTTCATTCATTAATCACCTTTCAGACAGAACTAGTCCAAACCCAAGTTGCAATACTGTACACATAAATTTTGTAGGTTTCAACTTTGAGGAAAGATCCCTAATAATGTAAAAAGAGAGGTGAGGTACCAAATTGTATGTAAGGCAATAGACACAATACAGTTGATGATTTCAAAACTTTTGTATTACTTAAAGTGAGGGAAGAGGGTTCATTTCATGTTGGTGGTAAGTGCGTTGTTTTAGTTGTGAAAATAGTCCCACATCGATTACATGAAAGAAATATTCACTGTTTATATTACGCTAGCACACTCCAACTAACG(SEQ ID NO：2)。

所述SEQ ID NO：3的序列如下：

TACACTAGCATGGGTTGGAATTATGTAGAGGTAATAGTGATTTTGATATTTGAATGTGTAACTAACTATTATAAGGATTTTCAAATGTATCAGAATTCTAAAATAGTTTAAGATTGTAAATTTGGTTAGTCAAAATAGTCTCTAAAATTGAAATTGGTTAATATTGTCATATTAATCTGTGAATATATTTATTTCTTGTCATATCAGTCACTATAAATGCTTATTGTCATTTCAATTCATATATGAAAAAAAGTTAATGTCAATATTGAAAAACTATATTAACATCAGATTATTTTGACTAATGCATTGATACATGGAAAGATTATTGTAGCCACTACTTGAACATGCAGGGACAAAAAATAACTATTATCCCGATTATGTAAATCTAATTTTACAATGTTTGCCATTTGCAGATCGAGGCTAAAGATAGTGTAACTAGGGAAGGGTAAAAACAGATTGTGAATGAATTGGAGAAGCTAAAGATGGAACGAGCAGATGAAGTTAAATAAGTGATATACTTGCGGTGGAGCAATGCATGGTTAAGGCAGGATATGATGAGGCAATATAGTCATCCAGAAGAAGCATCGGCGAGACTGAGAAAGAATTCTAGCGCGTATACCAATTACTGGAGTCCCACATCGCTTAAATGTTATGCATCTTCAGTGTTTATATATCGTCACAGAGCACTATGACTTG(SEQ ID NO：3)。

所述SEQ ID NO：4的序列如下：

GACATCCCTTCAAGACAGACTCAGACTAAAAAAAATTCATGTCAGACAAGATTTTGTCAAAACAATATAGAACCTTAGTAGCTCTTGTGAGTCACATACTCATGGACACCGATACTGCACAGACACAGACACGGACACGGACACGTCAACGCCAATAATTTGACAGATTTTATCACAGAATTCAATGTAATCATATGTGTCAGTGTCGTGTTGGTGTCAGACATGATATTATCCGACATCGGAACACACCTAACATGAGGGGTATATGTGCTTCATAGGATTAGACGAAACATCAGCCGTAACTTTCATATGTGAAGTGAATTGAAAATTCAGTAAGCCAACAGAAACAACAAATGACATTTTCAGAATATCTAACTTCAATTGTGAGGAAAATCATGATTTCTCTACATTTTCAATTTTTCAAGCACTAAGTTCCATCAGTAAATCTCACAAGGATAGAAACAAAGCAGAGCTAGTATTTGGAGGAAGTGATGAGAAATCATACCAATGATGAGGTAAAATTACAGTCTAAACTTTGATTCACATTGTGAGAAGCATACCCATTGATTGCTTCAGTTGTTGAGTGCGTGTACTTGTTACTTATGTCCCACATGGCTTAGATATTATGCATATTCAATGTTTATATATCCTCATAGAGCACTGTGGCTTG(SEQ ID NO：4)。

所述SEQ ID NO：5的序列如下：

GCATGTATCAACATAGTGTGACACAAGTAATAGATATTTAAACATTTAGTCTAGAGTTTGATCTCTGTCAGTGGACATGAAAAAACACTAGTTTAAAGTGGTAATAATATCTTAAATAAATCTCAATTAACTCGAGAAAATTAGTCTTTACAATTGTGCATGTAGAGACCTTTTTATCTAAAAAAATTATGAGAATGGAATATGGATATGTACGATTGTACTTGTTTCTTGGTCTGAGTGTGAGGGAGAGGAAGAAGTTCACTTAACTTGTTTATTGGTTTATTTAATAAATCTGAAACTGAACTCAATTAAGTGAGAGAGCGGGAGATGCATGCATCATGGTCGCTTGCTTTGGACTTAGGTGAAAGCTGGTTGAGAACTGTATTTGTATATTACGTTTGCTATTAGTCCCACATCGGCTACATCTTTAGCTTTTAAGCGTTTATATAACACACGCGAATGCCTAGGCTTG(SEQ ID NO：5)。

在本發(fā)明中，將SEQ ID NO:1-5所示的啟動(dòng)子序列分別稱為啟動(dòng)子MtrU6-11、MtrU6-12、MtrU6-13、MtrU6-14、MtrU6-15。

其中，攜帶有上述啟動(dòng)子的植物經(jīng)GUS染色后，變?yōu)樗{(lán)色。

其中，所述植物為豆科植物。

其中，所述植物為苜蓿植物。

其中，所述植物為蒺藜苜蓿。

其中，所述植物為紫花苜蓿。

其中，所述植物為煙草小苗。

其中，所述SEQ ID NO：1-5所示的任意一種核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。即分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過40-67個(gè)，或者不超過32-53個(gè)，或者不超過24-45個(gè)，或者不超過16-26個(gè)，或者不超過8-14個(gè)，或者不超過4-7個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。

在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

其中，所述的具有與SEQ ID NO：1-5所示的任意一種核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列或多核苷酸序列。

其中，所述的“同一性”是指：在SEQ ID NO：1的參考核苷酸序列中每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)10個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5％的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的10％；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5％。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。

用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如常規(guī)采用的BLAST或BLAST2.0算法。

在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列或多核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有與SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

其中，所述啟動(dòng)子來源自豆科植物，具體地，所述豆科植物為苜蓿，例如蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明第二方面提供一種載體，其具有第一方面所述的啟動(dòng)子。

其中，所述載體可以通過將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達(dá)載體而得到，或者可以通過人工合成得到。

其中，在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述載體本發(fā)明的啟動(dòng)子與pCambia1391質(zhì)粒經(jīng)重組得到重組載體pCambia1391-MtrU6-10或pCambia1391-MtrU6-11或pCambia1391-MtrU6-12或pCambia1391-MtrU6-13或pCambia1391-MtrU6-14。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明第三方面提供一種重組農(nóng)桿菌，所述重組農(nóng)桿菌含有第一方面的啟動(dòng)子或第二方面所述的載體。

其中，適用于構(gòu)建本發(fā)明所述重組農(nóng)桿菌的宿主菌株為農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第五方面提供一種植物愈傷組織或外植體，其具有轉(zhuǎn)化本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或感染有本發(fā)明的重組農(nóng)桿菌的功能。

其中，所述外植體可以是植物的植物的胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉等，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為煙草的葉。

其中，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述愈傷組織為蒺藜苜蓿愈傷組織。

此外，本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其具有轉(zhuǎn)化本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或感染有本發(fā)明的重組農(nóng)桿菌的功能。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第五方面提供一種用于擴(kuò)增得到第一方面所述的啟動(dòng)子。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-11引物對(duì)的兩條引物分別由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列組成：

SEQ ID NO:6 F:CTTATAACTGGAAAACCGACGT；

SEQ ID NO:7 R:CAATAGAAGAGAGCATTTGCG。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-12引物對(duì)的兩條引物分別由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的堿基序列組成：

SEQ ID NO:8 F:TAAATGGGGCTCTTATCAC；

SEQ ID NO:9 R:CGTTAGTTGGAGTGTGCTAG。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-13引物對(duì)的兩條引物分別由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的堿基序列組成：

SEQ ID NO:10 F:TACACTAGCATGGGTTGG；

SEQ ID NO:11 R:CAAGTCATAGTGCTCTGTGAC。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-14引物對(duì)的兩條引物分別由SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的堿基序列組成：

SEQ ID NO:12 F:GACATCCCTTCAAGACAG；

SEQ ID NO:13 R:CAAGCCACAGTGCTCTAT。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-15引物對(duì)的兩條引物分別由SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的堿基序列組成：

SEQ ID NO:14 F:GCATGTATCAACATAGTGTGACAC

SEQ ID NO:15 R:CAAGCCTAGGCATTCGCGTGT。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第六方面提供一種制備SEQ ID NO:1-5所示的啟動(dòng)子的方法，包括以蒺藜苜?；蚪MDNA為模板，利用擴(kuò)增引物，通過高保真酶KOS-plus PCR對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO:1-5在蒺藜苜蓿U6SnRNA基因前的啟動(dòng)子序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，例如利用本發(fā)明提供的引物對(duì)。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-11是根據(jù)蒺藜苜蓿中1號(hào)染色體上的基因組獲得。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-12、MtrU6-13、MtrU6-14是根據(jù)蒺藜苜蓿中7號(hào)染色體上的基因組獲得。

其中，所述啟動(dòng)子MtrU6-15是根據(jù)蒺藜苜蓿中8號(hào)染色體上的基因組獲得。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的本發(fā)明第七方面提供一種調(diào)控植物中目的基因表達(dá)的方法，包括將第一個(gè)方面的啟動(dòng)子或第二方面的載體轉(zhuǎn)入植物體或外植體的步驟，或使用第三方面的重組農(nóng)桿菌感染植物體或外植體的步驟。

其中，所述目的基因?yàn)镚US基因。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將含有重組載體pCambia1391-MtrU6-10或pCambia1391-MtrU6-11或pCambia1391-MtrU6-12或pCambia1391-MtrU6-13或pCambia1391-MtrU6-14的重組農(nóng)桿菌GV3101-MtrU6-10或GV3101-MtrU6-11或GV3101-MtrU6-12或GV3101-MtrU6-13或GV3101-MtrU6-11轉(zhuǎn)化如煙草葉中，煙草葉經(jīng)GUS染色驗(yàn)證，GUS基因均已表達(dá)。。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第八方面提供一種將本發(fā)明的啟動(dòng)子或載體或重組農(nóng)桿菌應(yīng)用在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途。

其中，所述目的基因?yàn)镚US基因.

其中，所述植物為豆科植物，優(yōu)選為苜蓿植物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述苜蓿植物為蒺藜苜蓿。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述苜蓿植物為紫花苜蓿。

有益效果

1、本發(fā)明采用分子生物學(xué)的方法，通過對(duì)擬南芥基因組與蒺藜苜?；蚪M進(jìn)行比對(duì)分析和判斷，以及不斷的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到了具有調(diào)控目的基因的啟動(dòng)子MtrU6-11、MtrU6-12、MtrU6-13、MtrU6-14、MtrU6-15。

2、本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可以用于調(diào)控豆科植物，尤其是苜蓿植物目的基因的表達(dá)，具體的，所述啟動(dòng)子能夠在煙草或蒺藜苜?；蜃匣ㄜ俎Ｖ姓{(diào)控GUS基因表達(dá)，為研究豆科植物，尤其是苜蓿植物基因表達(dá)提供了新的工具和選擇。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的啟動(dòng)子示意圖；

圖2是本發(fā)明提供的pCambia1391-MtrU6-10、pCambia1391-MtrU6-11、pCambia1391-MtrU6-12、pCambia1391-MtrU6-13、pCambia1391-MtrU6-14載體圖譜示意圖；

圖3是注射含有啟動(dòng)子和不含有啟動(dòng)子的載體菌液的煙草葉，其中葉片上的圓形標(biāo)記表示注射含有啟動(dòng)子的載體菌液的位置，葉片上的三角標(biāo)記表示注射不含有啟動(dòng)子的載體菌液的位置；

圖4是經(jīng)轉(zhuǎn)化后的煙草葉的GUS染色葉片，其中，轉(zhuǎn)化有含啟動(dòng)子重組農(nóng)桿菌的煙草葉部分呈藍(lán)色，轉(zhuǎn)化有不含啟動(dòng)子重組農(nóng)桿菌的煙草葉未發(fā)生變化。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

在下面的描述中闡述了很多具體的細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是，本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其他方式來實(shí)施，因此，本發(fā)明并不限于下面公開的具體實(shí)施例的限制。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售方式獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1啟動(dòng)子的獲得

1、啟動(dòng)子的鑒定與分離

使用擬南芥U6SnRNA保守序列在蒺藜苜?；蚪M庫(ID:3880)里利用snapgene軟件進(jìn)行比對(duì)搜尋，得到多條與擬南芥U6SnRNA序列一致的堿基序列，本申請(qǐng)?jiān)诙鄺l堿基序列中一一進(jìn)行分析和試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了14條具有活性的啟動(dòng)子，其中9條啟動(dòng)子已被Kim G B,Nam Y W.等在《Isolation and Characterization of Medicago truncatula，U6 Promoters for the Construction of Small Hairpin RNA-Mediated Gene Silencing Vectors》公開。本申請(qǐng)將剩余的5條進(jìn)行研究。以下為具體實(shí)施操作過程。

本申請(qǐng)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-30～-23處都存在一個(gè)共有序列TTTATATA或者TATA類似序列，其中1號(hào)染色體上的位于-31～-24bp處，在上游-65～-55bp處存在一個(gè)堿基序列為GTCCCACATCG的upstream sequence element(USE)元件或者類似元件，其中1號(hào)染色上的位于-66～-56bp處。USE元件為植物U6啟動(dòng)子特有元件，因此判定這5個(gè)基因均為U6snRNA基因，并將這5個(gè)啟動(dòng)子命名為其分布情況如表1所示，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

表1啟動(dòng)子分布情況

2、蒺藜苜蓿DNA提取及擴(kuò)增

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取蒺藜苜蓿的基因組DNA，根據(jù)步驟1的分析得到的啟動(dòng)子的位置與序列，分別在首尾設(shè)計(jì)特異引物(上游引物F，加限制性酶切酶Pst I和保護(hù)堿基，下游引物R加限制性酶切位點(diǎn)EcoR I或BamHI和保護(hù)堿基)，使用高保真酶KOD-plus PCR擴(kuò)增各個(gè)啟動(dòng)子。其中，PCR擴(kuò)增引物如下：

擴(kuò)增啟動(dòng)子Mtr U6-10引物：

U6-10F:CTTATAACTGGAAAACCGACGT

U6-10R:CAATAGAAGAGAGCATTTGCG

擴(kuò)增啟動(dòng)子Mtr U6-11引物：

U6-11F:TAAATGGGGCTCTTATCAC

U6-11R:CGTTAGTTGGAGTGTGCTAG

擴(kuò)增啟動(dòng)子Mtr U6-12引物：

U6-12F:TACACTAGCATGGGTTGG

U6-12R:CAAGTCATAGTGCTCTGTGAC

擴(kuò)增啟動(dòng)子Mtr U6-13引物：

U6-13F:GACATCCCTTCAAGACAG

U6-13R:CAAGCCACAGTGCTCTAT

擴(kuò)增啟動(dòng)子Mtr U6-14引物：

U6-14F:GCATGTATCAACATAGTGTGACAC

U6-14R:CAAGCCTAGGCATTCGCGTGT

其中，PCR擴(kuò)增體系參照KOD‐plus試劑盒說明書，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，3min；94℃，15s，55℃，30s，68℃，60s，34個(gè)循環(huán)；68℃，5min；4℃，∞。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小分別為Mtr U6-10：477bp，Mtr U6-11：401bp，Mtr U6-12：696bp，Mtr U6-13：673bp，Mtr U6-14：472bp的條帶，將PCR產(chǎn)物回收純化連接PMD18-T載體(Takara公司)，送測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果如下：Mtr U6-10如SEQ ID NO:1所示，Mtr U6-11如SEQ ID NO:2所示，Mtr U6-12如SEQ ID NO:3所示，Mtr U6-13如SEQ ID NO:4所示，Mtr U6-14如SEQ ID NO:5所示。

測(cè)序結(jié)果表明，獲得的克隆載體中的啟動(dòng)子序列正確。

實(shí)施例2重組表達(dá)載體(pCambia1391-MtrU6-X)構(gòu)建

1、載體構(gòu)建

將Mtr U6-10連到pCambia1391載體上時(shí)，分別使用限制性酶切酶Pst I和EcoR I雙酶切克隆了Mtr U6-10片段的PMD18-T載體質(zhì)粒和pCambia1391質(zhì)粒，Mtr U6-11，Mtr U6-12，Mtr U6-13，Mtr U6-14連接到pCambia1391載體上時(shí)，分別使用限制性酶切酶Pst I和BamHI雙酶切克隆了相應(yīng)片段的PMD18-T載體質(zhì)粒和pCambia1391質(zhì)粒，切膠回收啟動(dòng)子片段和載體骨架，使用T4連接酶連接相應(yīng)片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序驗(yàn)證陽性克隆，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒命名為pCambia1391-MtrU6-10，pCambia1391-MtrU6-11，pCambia1391-MtrU6-12，pCambia1391-MtrU6-13，pCambia1391-MtrU6-14。

構(gòu)建好的載體圖譜示意圖見圖2。

實(shí)施例3煙草中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)

1、煙草苗的培養(yǎng)

取干凈培養(yǎng)皿，在其中進(jìn)行若干煙草種子發(fā)芽，待煙草發(fā)芽后轉(zhuǎn)移至土壤里培養(yǎng)，培養(yǎng)4～6周時(shí)備用，其中，土壤中的培養(yǎng)條件為：光照16h,24℃，黑暗8h，20℃。

2、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

將實(shí)施例2中構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCambia1391-MtrU6-10，pCambia1391-MtrU6-11，pCambia1391-MtrU6-12，pCambia1391-MtrU6-13，pCambia1391-MtrU6-14，使用熱擊法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，在kan和Rif抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天后，挑取單菌落，搖菌鑒定陽性克隆。

3、菌液的準(zhǔn)備

將鑒定為陽性的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞在28℃過夜培養(yǎng)，取5-6ml菌液于4000rpm離心5min后，去上清，使用含MES(10mM)，MgCl(10mM)，AS(150uM)的重懸液重懸至OD600值為0.8左右，28℃避光靜置2～3h左右，得到侵染菌液。

4、侵染

用針頭在煙草葉片表面輕輕劃一下，使用1mL注射器吸取少量重懸后的菌液注射煙草，每個(gè)啟動(dòng)子至少注射3片葉子，每片葉子上同時(shí)注射含無啟動(dòng)子的載體菌液作為對(duì)照組，浸染方法如圖3所示；

注射過的煙草在溫室中培養(yǎng)48h后，將葉片切下后用GUS染色液37℃過夜染色，再用脫色液(乙酸：乙醇＝1：9)脫色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。

根據(jù)圖4所示的染色結(jié)果可知，注射無啟動(dòng)子的載體菌液區(qū)，均沒有觀測(cè)到染色跡象，注射了pCambia1391-MtrU6-10，pCambia1391-MtrU6-11，pCambia1391-MtrU6-12，pCambia1391-MtrU6-13，pCambia1391-MtrU6-14農(nóng)桿菌菌液的區(qū)域均可以觀察到藍(lán)色，結(jié)果顯示這5個(gè)蒺藜苜蓿U6啟動(dòng)子均具備活性，均可以驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)。

需要說明的是，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有相關(guān)資料公開了蒺藜苜蓿中存在9種啟動(dòng)子，但是并沒有給出其公開的啟動(dòng)子可以表達(dá)GUS基因，也就是說其公開的9個(gè)啟動(dòng)子不一定具有調(diào)控GUS基因表達(dá)的功能和效果。例如Kim G B,Nam Y W.公開的Isolation and Characterization of Medicago truncatula,U6Promoters for the Construction of Small Hairpin RNA-Mediated Gene Silencing Vectors一文中提到的9種啟動(dòng)子，而且，相對(duì)于已公開的啟動(dòng)子，本申請(qǐng)的啟動(dòng)子堿基序列不但與其完全不同，而且還具有驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)的調(diào)控效果。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之類。