專利名稱：一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在發(fā)育到一定時(shí)期是會(huì)發(fā)生自發(fā)的器官脫落，當(dāng)植物遭遇逆境時(shí)，也常常脫 落一些器官以度過難關(guān)。在不同植物中，葉片、果實(shí)、花等器官都可能存在脫落現(xiàn)象。脫落 是主動(dòng)的生理過程，它是高度協(xié)調(diào)一致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝以及基因表達(dá)變化的統(tǒng)一體現(xiàn)。脫落在離層區(qū)發(fā)生。離層區(qū)是指植物本體和將要脫落器官之間幾層特殊的細(xì)胞。 它們與周圍的細(xì)胞之間有明顯的形態(tài)和生化特征差異，對(duì)同樣的信號(hào)，離區(qū)細(xì)胞和相鄰器 官細(xì)胞可能做出不同的響應(yīng)，這也是脫落發(fā)生的基礎(chǔ)?；蚬こ淘诤艽蟪潭壬鲜菍⒛康幕蛞砸欢ǖ谋磉_(dá)量在特定的組織中表達(dá)，因而 需要一些調(diào)控外源基因有效表達(dá)的分子元件，其中啟動(dòng)子是最重要的一個(gè)。隨著基因工程 的不斷發(fā)展，為了滿足基因工程對(duì)不同功能啟動(dòng)子的需要，就必須分離一些新型有效的啟 動(dòng)子。按作用方式和功能，啟動(dòng)子可以分為組成型啟動(dòng)子、特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子。組織特異性啟動(dòng)子(tissue-specific promoter)又稱之為器官特異性啟動(dòng)子。在這 些啟動(dòng)子調(diào)控下，基因的表達(dá)往往僅發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā) 育調(diào)節(jié)的特性。這種特異性通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)物理信號(hào)為其存在的基礎(chǔ)。 典型的組織特異性啟動(dòng)子如水稻花藥特異性啟動(dòng)子0sg6B、番茄花粉特異性啟動(dòng)子LAT52、 煙草花藥絨氈層特異性啟動(dòng)子TA29、玉米花粉特異性基因啟動(dòng)子Zml3、矮牽牛花藥特異性 啟動(dòng)子ChsA、擬南芥花藥特異性啟動(dòng)子A9、油菜花藥特異性啟動(dòng)子Bp4A和BplO等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA片段。本發(fā)明所提供的DNA片段為如下1)、2)、3)或4)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。所述嚴(yán)格條件可為在0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜 交，并用該溶液洗膜。擴(kuò)增上述DNA片段全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)中，一條引物序列如序列表中序列2所示，另一條引物序列如序列表 中序列3所示。含有上述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。上述DNA片段在使目的基因在植物器官離層區(qū)中表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的
3保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述植物具體為擬南芥，所述器官具體為花。上述DNA片段在調(diào)節(jié)植物器官脫落中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述植物具體為擬南芥，所述器官具體為花。植物的器官脫落，尤其是果實(shí)的脫落，對(duì)農(nóng)作物是至關(guān)重要的性狀。實(shí)驗(yàn)證明，本 發(fā)明的DNA片段是一個(gè)離區(qū)特異的啟動(dòng)子，可以驅(qū)動(dòng)目的基因特異地在植物的離區(qū)組織中 表達(dá)，如驅(qū)動(dòng)與脫落相關(guān)的基因(如細(xì)胞壁的水解酶類)，以促進(jìn)果實(shí)的剝離；再如驅(qū)動(dòng)抑 制脫落的基因，防止在果實(shí)在成熟前脫落造成的產(chǎn)量損失。本發(fā)明的DNA片段還可以作為 啟動(dòng)子的一部分，連接其它的順式作用元件后獲得其它特性，如增強(qiáng)表達(dá)活性或增加誘導(dǎo) 表達(dá)能力。利用組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在特定的組織或器官中表達(dá)，可以增強(qiáng)其 表達(dá)效率，并減少基因異位表達(dá)對(duì)宿主植物造成的傷害或不利作用。因此，本發(fā)明的DNA片 段具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為pCAMBIA1391質(zhì)粒的物理圖譜。圖2為陽(yáng)性重組大腸桿菌的驗(yàn)證。圖3為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)⑶S基因在離區(qū)中特異表達(dá)。圖4為⑶S基因在不同組織中的表達(dá)檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、啟動(dòng)子的制備、確認(rèn)和功能驗(yàn)證一、啟動(dòng)子的制備和確認(rèn)PMD-18T-easy 載體購(gòu)自 TaKaRa，產(chǎn)品目錄號(hào)為 D101A。以1周齡擬南芥野生型植株為實(shí)驗(yàn)材料，提取其基因組DNA，并以總DNA為模板， 用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，，用pfu酶擴(kuò)增。引物序列兩端分別引如BamHl和EcoRl酶切位 點(diǎn)，引物序列如下上游GGATCCTGTGTGTGATTGTGTTATTGTGTCT(序列 2)，引入 BamHI 酶切位點(diǎn)
下游GAATTCGCAATATGGGACAAGAGAGAAGAG (序列 3)，引入 EcoR I 酶切位點(diǎn)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的片段為1250bp。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 加尾后連接到PMD-lST-easy載體上，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Amp抗性篩選，得到陽(yáng)性重 組菌；提取陽(yáng)性重組菌的質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)得的序列如序列表中序列1所示，將序列1所示 的 DNA 片段記作 AtD0F4. 7promoter_T。二、啟動(dòng)子的特異表達(dá)驗(yàn)證pCAMBIA1391質(zhì)粒(張勇，付紹紅，張汝全，牛應(yīng)澤.甘藍(lán)型油菜PEPC基因保守序 列的克隆和種子特異性ihpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建.2008.分子植物育種.第6卷，第4期，第 775-780頁(yè))(圖1)(由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)。農(nóng)桿菌菌株 GV3101 (Holsters M, Silva B, Van Vliet F, Genetello C, De Block
4M，Dhaese P，D印icker A,Inz D,Engler G,Villarroel R,Van Montagu M，Schell J(1980) Thefunctional organization of the nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid 3 =212-230)(由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)。 將實(shí)驗(yàn)一中得到的陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI酶切陽(yáng)性質(zhì) 粒，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，回收小片斷(即實(shí)驗(yàn)一中擴(kuò)增得到的DNA小片段)； 用BamHI和EcoRI酶切pCAMBIA1391質(zhì)粒，回收載體大片段；將DNA小片段和載體大片段用 T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Kan篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定 和酶切鑒定和測(cè)序鑒定，PCR鑒定中使用的引物為序列2和序列3所示。結(jié)果如圖2所示 (圖2，A圖為PCR鑒定結(jié)果，泳道1和2分別為兩個(gè)克隆的PCR鑒定結(jié)果；B圖為酶切鑒定 結(jié)果，泳道1和泳道2表示兩個(gè)克隆的酶切鑒定結(jié)果)，測(cè)序鑒定表明獲得的序列如序列表 中序列1所示。表明獲得了陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆記作pCAMBIA1391-AtD0F4. 7promoter
GUS。
酶切體系如下
10XK Buffer5uL
BamHIluL
EcoRIluL
PCAMBIA1391 或 AtD0F4. 7promoter_T 陽(yáng)性質(zhì)粒 25uL
ddH2018uL
37°C,3hr
連接體系如下
10 X Ligation buffer1 uL
PCAMBIA13912uL
AtD0F4. 7promoter6uL
T4 DNA連接酶luL
4°C連接過夜
提取陽(yáng)性克隆pCAMBIA1391-AtD0F4. 7promoter :GUS的質(zhì)粒，通過CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化
農(nóng)桿菌GV3101，通過抗生素Rif和Kan篩選，得到陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR 鑒定的引物為序列2和序列3所示。結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1.2Kb。表明構(gòu)建的重組農(nóng) 桿菌正確。將陽(yáng)性重組農(nóng)桿菌，用flower dip法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取T0代種子；將T0代種子播 種，在添加25mg/L Hyg的MS培養(yǎng)基上篩選抗性苗，獲得T1代種子。將T1代種子播種，在 添加25mg/L Hyg的MS培養(yǎng)基上篩選抗性苗，獲得抗性穩(wěn)定遺傳的T2代陽(yáng)性植株。以轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1391的擬南芥為對(duì)照。將T2代陽(yáng)性植株的根、莖、葉、花、果頰、種子，放入裝有l(wèi)mL⑶S染液的EP管中， 37°C溫浴4hr，用50%和70%的酒精依次洗脫12hr，在體視鏡和顯微鏡下觀察，并通過(XD 攝取圖像。X-Gluc (5-溴-4氯_3_吲哚葡萄糖苷)溶液(即GUS染液)配置(lmL)稱取lmg 的X-Gluc，加入1-2滴N，N- 二甲基甲酰胺，使X-Gluc至完全溶解，然后加入980 u L0. lmol/ L磷酸緩沖液(pH7. 0)和10 ii L 5mm/L鐵氰化鉀水溶液、10 u L 5mm/L亞鐵氰化鉀水溶液，攪拌，最后加入liiL Triton X-100。提取T2代陽(yáng)性植株的根、莖、葉、花、果頰、種子的RNA，反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢 測(cè)其中⑶S的表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增引物為如下所示。GUS-F 5' -GCAACTGGACAAGGCACT-3‘；GUS-R 5' -GCGTCGCAGAACATTACA-3‘)染色結(jié)果如圖3所示(A 果頰中GUS染色；B ；離層區(qū)部位的放大圖，箭頭分別指向 花瓣和雄蕊離區(qū)，比例尺=2mm)。各器官中GUS表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。⑶S表達(dá)結(jié)果顯示，⑶S基因僅在花和果頰中有表達(dá)，而在根、莖、葉、種子中均沒 有表達(dá)。染色結(jié)果顯示，僅在擬南芥植株果頰的基部有藍(lán)色著色，而果頰的基部為花器官 基部離層區(qū)；而在根、莖、葉、花、種子中均沒有著色。對(duì)照組，在擬南芥植株花器官基部離層 區(qū)細(xì)胞層沒有藍(lán)色的著色，其它部位也沒有著色。pCAMBIA1391載體中含有g(shù)us基因，本實(shí)驗(yàn)將DNA片段AtD0F4. 7promoter插 在gus基因的上游，gus基因的上游除了 DNA片段AtD0F4. 7promoter外，沒有其它的啟 動(dòng)子。而gus基因表達(dá)，說明是DNA片段AtD0F4. 7promoter啟動(dòng)的結(jié)果，證明DNA片段 AtD0F4. 7promoter是啟動(dòng)子?；虮磉_(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)證明，該啟動(dòng)子只啟動(dòng)⑶S基因在花和果頰 中表達(dá)，而在其它組織(根、莖、葉、種子)中不啟動(dòng)表達(dá)；染色實(shí)驗(yàn)證明，只有在擬南芥植株 果頰的基部(即花器官基部離層區(qū))有藍(lán)色的著色，而在其它組織部位(根、莖、葉、花、種 子)沒有著色，表明該啟動(dòng)子是離區(qū)特異表達(dá)的啟動(dòng)子。
權(quán)利要求
一種DNA片段，為如下1)、2)或3)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；3)與1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。
2.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述DNA片段全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)中，一條引物序列如序列表 中序列2所示，另一條引物序列如序列表中序列3所示。
4.含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。
5.權(quán)利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物器官離層區(qū)中表達(dá)中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為擬南芥，所述器官為花。
7.權(quán)利要求1所述DNA片段在調(diào)節(jié)植物器官脫落中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為擬南芥，所述器官為花。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子為如下1)、2)、3)或4)所示DNA片段1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；3)與1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的DNA片段是一個(gè)離區(qū)特異的啟動(dòng)子，可以驅(qū)動(dòng)目的基因特異地在植物的離區(qū)組織中表達(dá)，如驅(qū)動(dòng)與脫落相關(guān)的基因(如細(xì)胞壁的水解酶類)，以促進(jìn)果實(shí)的剝離；再如驅(qū)動(dòng)抑制脫落的基因，防止在果實(shí)在成熟前脫落造成的產(chǎn)量損失。因此，本發(fā)明的DNA片段具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101857863SQ201010155858
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者張秀清, 王學(xué)臣, 魏鵬程 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)