專利名稱：：一種鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及畜牧領(lǐng)域，涉及利用mtDNA基因特異組合單倍型鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的方法。
背景技術(shù)：
：千百年來，豬一直是人們生活中最重要的肉用動物之一，它性情溫順，易飼養(yǎng)，且出欄較快，深受廣大養(yǎng)殖戶的喜愛。豬的馴化可以追溯到9000-10000年以前(B5k5nyi1974)。在此期間，不同地理區(qū)域的國內(nèi)外野豬被馴化。由于各地的氣候條件及人們的喜好不同，選育的地方品種具有不同的地域特征性毛皮、體型和生產(chǎn)性狀等。根據(jù)《中國畜禽遺傳資源狀況》(2004)編委會調(diào)查數(shù)據(jù)顯示中國現(xiàn)存72個地方品種，大致可以分為六種類型，分別為華北型，華南型、華中型、江海型、西南型和高原型(張仲葛等.1986;Xu1987)。中國地方豬種由于具有繁殖性能好、母性強和耐粗飼等特點，在19世紀(jì)中期引入到法國、美國及英國等地，作為母本與國外地方豬種進行雜交以改良當(dāng)?shù)刎i品種。如何識別歐洲原種豬(優(yōu)良地方豬種)，并做到真正引種是我國引種工作中的一個重要問題。線粒體DNA在畜禽遺傳多樣性和起源鑒定中發(fā)揮著越來越重要的作用，同時不同類群線粒體DNA的遺傳變異也揭示了畜禽馴化的歷史(Brownetal.1979；Avisel994)。ATP合酶廣泛存在于哺乳動物線粒體中，是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶。該酶位于線粒體內(nèi)膜上，參與氧化磷酸化與光合磷酸化反應(yīng)，在跨膜質(zhì)子動力勢的推動下催化合成ATP。ATP合酶由Fl和FO兩部分組成，其中Fl亞基由核基因編碼，而FO亞基由線粒體基因和核基因共同編碼，編碼FO亞基的兩個線粒體基因為mtATP6和mtATP8基因。近幾年，相關(guān)報道表明人類許多疾病是由線粒體功能喪失所引起的，例如人類mtATP6基因8993位T>G的突變會引起156位編碼氨基酸的改變，其中從亮氨酸變?yōu)榫彼?Tatuchetal.1992；Manfredietal.1999；Garciaetal.2000)。但是，關(guān)于不同豬品種mtATP6和mtATP8基因遺傳變異的報道并不多見。最近有少量研究報道了在部分國外豬種、中國地方品種和野豬中進行線粒體DNA多樣性研究的結(jié)果(Kijas&Andersson2001，Yangetal.，2003，Wuetal.，2007)，但以上研究及相關(guān)文獻中并沒有報道關(guān)于影響ATP合酶組成的相關(guān)基因在群體水平的遺傳變異研究，而且也沒有報道鑒別中國地方豬種和國外地方豬種的特異組合單倍型研究的結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供用于鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的試劑盒。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，中國地方豬種和歐洲地方豬種mtATP6基因和mtATP8基因存在多態(tài)性差異，通過對相關(guān)位點的檢測可以用來鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種。進而，本發(fā)明提供一種用于鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的方法，其是通過檢測mtATP6基因的第591位堿基和mtATP8基因的第21位堿基，當(dāng)mtATP6基因的第591位堿基為C且mtATP8基因的第21位堿基為T時，該豬種為中國地方豬種，當(dāng)mtATP6基因的第591位堿基為T且mtATPS基因的第21位堿基為C時，該豬種為歐洲地方豬種。可使用測序或者是探針雜交等不同方式進行檢測。本發(fā)明還進一步提供了一種具有較高實用性的檢測方法，該方法通過PCR分別擴增mtATP6基因和mtATPS基因，利用FokI分別酶切擴增產(chǎn)物，并凝膠電泳檢測，其中mtATP6基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)4條帶且mtATPS基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)1條帶的為中國地方豬種，mtATP6基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)3條帶且mtATPS基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)2條帶的為歐洲地方豬種。進而，本發(fā)明還提供一種用于鑒別包括用于擴增mtATP6基因和/或mtATPS基因的引物，以及FokI酶。該試劑盒還可以進一步包括其它在檢測過程中所使用到的試劑。本發(fā)明方法能夠快速、準(zhǔn)確鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種，并且易于實驗室操作，污染少，成本低，具有較強的實用性。本發(fā)明試劑盒，具有廣闊的應(yīng)用前景，能夠產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益和良好的社會效益。圖1顯示的是mtATP6基因FokI酶切產(chǎn)物電泳圖，其中A代表339/164/149/91bp帶型；B代表488/164/91bp帶型；M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2顯示的是mtATP8基因FokI酶切產(chǎn)物電泳圖，其中C代表425bp帶型；D代表160/265bp帶型；M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明通過對不同豬品種mtATP6和mtATP8基因全序列和診斷性SNP分析來揭示中國地方豬種和歐洲地方豬種線粒體DNA的遺傳多樣性。其中研究對象包括6個傳統(tǒng)類型23個地方品種(民豬、二花臉、樂平、榮昌、香豬、藏豬、八眉、藍塘、五指山、巴馬香豬、版納微型豬、撒壩豬、通城、玉山、漢江、內(nèi)江、黔北黑、小梅山、嘉興黑、金華、桂中、莆田黑和上高豬)、3個不同類型中國野豬品種(華南、浙江和東北野豬)和3個歐洲品種(大白、長白和杜洛克)共805個個體(無親緣關(guān)系)。采用氯仿抽提法從豬耳組織中提取基因組DNA，用NanoDropND-1000分光光度計檢測其DNA的濃度和純度。根據(jù)GenBank信息(登錄號AJ002189)分別設(shè)計特異性引物擴增mtATP6(nt7923nt8665)和mtATP8(nt7625nt8049)基因全長，其中核苷酸具體位置以NCBI數(shù)據(jù)庫中Ursing和Arnason報道的豬線粒體DNA序列位置標(biāo)示為基準(zhǔn)(Ursing&Arnason1998)。試驗首先采用PCR擴增，所得產(chǎn)物進行測序。序列結(jié)果利用ChromasProvl.41軟件進行分析，然后采用Clustalw在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)進行序列比對，尋找品種間的重要SNP。為了試驗的精準(zhǔn)性，發(fā)明人對疑似SNP進行重測序驗證，同時采用DNAMAN軟件進行序列酶切位點分析。最后從群體水平對上述重要SNP進行組合單倍型分析。結(jié)果表明中國地方豬種和歐洲地方豬種在mtATP6和mtATP8基因存在多態(tài)性。實施例1采用氯仿抽提法從豬耳組織中提取基因組DNA，根據(jù)GenBank信息(登錄號AJ002189)分別設(shè)計特異性引物擴增mtATP6(nt7923nt8665，SEQIDNo.1)和mtATP8(nt7625nt8049,SEQIDNo.1)基因全長。其中擴增mtATP6基因的引物為mtATP6-F:5’-AGCACCCCTTGAGAAATA-3’禾口mtATP6-R:5’-GGCTTGGGTTTACTATGTG-3，。擴增mtATP8基因的引物為mtATP8_F:5，-TGGATCAAACCACAGCTTCA-3，禾口mtATP8-R:5’-CGTTTGGGTGTTGGGAATAG-3，。反應(yīng)體系如下總體系為25μ1，其中包括IOOng的基因組DNA、1.2μ1上游引物(lOpmol/μ1)、1·2μ1下游引物(lOpmol/μ1),2.5μ1的10XPCRBuffer,2μ1的dNTPs(0.25mM)和2.5U的Taq聚合酶。反應(yīng)程序950C預(yù)變性5min，進入以下循環(huán)94°C、lmin,55°C、30sec，72°C、lmin，進行35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束時，72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測后進行測序，結(jié)果如表1所示。表1不同品種豬的mtATP6基因及mtATP8基因的相關(guān)位點差異<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可以看出，中國地方豬種mtATP6基因的第591位堿基為C且mtATP8基因的第21位堿基為T；而歐洲地方豬種mtATP6基因的第591位堿基為T且mtATP8基因的第21位堿基為C。通過檢測這兩個位點的變異即可實現(xiàn)對中國地方豬種和歐洲地方豬種的鑒別。實施例2按照實施例1方法擴增mtATP6和mtATP8基因全長。采用總反應(yīng)體系為20μ1，其中包括5μIPCR產(chǎn)物和1.25μ1內(nèi)切酶FokI(酶切位點為GGATG(N)9Τ)的混合體系在37°C條件下10-12小時消化，隨后將酶切產(chǎn)物上樣于3%瓊脂糖膠電泳中，在75V的電壓條件下電泳80分鐘進行檢測。mtATP6基因序列中通常有3處FokI酶切位點，經(jīng)過FokI酶切可產(chǎn)生164+9l+339+149bp這4個片段(泳道1)，當(dāng)?shù)?91位堿基處由C突變?yōu)門時，導(dǎo)致第574位堿基處酶切位點的消失，此處只存在2個FokI酶切位點，產(chǎn)生164+91+488bp這3個片段。如圖1所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶FokI酶切后，產(chǎn)生兩種帶型339/164/149/91bp(泳道l)、488/164/91bp(泳道2)，分別命名為A型和B型。如圖2所示，mtATP8基因序列中由于第21位堿基處突變產(chǎn)生一個FokI酶切位點，經(jīng)過FokI酶產(chǎn)生兩種帶型425bp(泳道l)、160/265bp(泳道2)，分別命名為C型和D型。根據(jù)FokI酶特征序列特點，檢測到mtATP6基因第144、234和572堿基處存在多態(tài)性，mtATP8基因第三堿基處存在多態(tài)性。不同豬種的PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果按照上述類型區(qū)分結(jié)果，如表2所示。表2不同豬種的PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述群體數(shù)據(jù)分析表明AC組合單倍型僅出現(xiàn)在亞洲品種中，而BD組合單倍型出現(xiàn)在歐洲地方豬種中，單倍型AC和BD可以分別作為鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的特異組合單倍型。通過對國外引進種豬進行抽樣檢測(酶切結(jié)果)發(fā)現(xiàn)，引進的歐洲豬品種(大白、長白和杜洛克)中部分個體具有中國地方豬種單倍型AC，可以推斷此部分歐洲豬個體是經(jīng)過中國地方豬種改良的個體，不是國外原始地方豬種。權(quán)利要求一種鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的方法，其特征在于，通過檢測mtATP6基因的第591位堿基和mtATP8基因的第21位堿基，當(dāng)mtATP6基因的第591位堿基為C且mtATP8基因的第21位堿基為T時，該豬種為中國地方豬種，當(dāng)mtATP6基因的第591位堿基為T且mtATP8基因的第21位堿基為C時為歐洲地方豬種。2.一種鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的方法，其特征在于，通過PCR分別擴增mtATP6基因和mtATP8基因，利用FokI分別酶切擴增產(chǎn)物，并凝膠電泳檢測，其中mtATP6基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)4條帶且mtATPS基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)1條帶的為中國豬種，mtATP6基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)3條帶且mtATPS基因酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)2條帶的為歐洲地方豬種。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，用于擴增mtATP6基因的PCR引物為mtATP6-F:5’-AGCACCCCTTGAGAAATA-3’和mtATP6-R:5’-GGCTTGGGTTTACTATGTG-3，。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，用于擴增mtATPS基因的PCR引物為mtATP8-F:5’-TGGATCAAACCACAGCTTCA-3’禾口mtATP8-R:5’-CGTTTGGGTGTTGGGAATAG-3，。5.用于鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的檢測試劑盒，其包括用于擴增mtATP6基因和/或mtATP8基因的引物，以及FokI酶。6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述用于擴增mtATP6基因的PCR引物為mtATP6-F5'-AGCACCCCTTGAGAAATA-3‘禾ΠmtATP6-R:5’-GGCTTGGGTTTACTATGTG-3，。7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述用于擴增mtATPS基因的PCR引物為mtATP8-F:5’-TGGATCAAACCACAGCTTCA-3’禾口mtATP8-R:5’-CGTTTGGGTGTTGGGAATAG-3，。全文摘要本發(fā)明提供了一種鑒別中國地方豬種和歐洲地方豬種的方法，其通過檢測mtATP6基因第591位堿基和mtATP8基因第21位堿基的突變來鑒別檢測個體為中國地方豬種還是歐洲地方豬種，或者通過對mtATP6基因和mtATP8基因的酶切產(chǎn)物凝膠電泳進行鑒別。本發(fā)明還提供了相關(guān)檢測試劑盒。本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確，易于實驗室操作，污染少，成本低，具有較強的實用性。本發(fā)明試劑盒，具有廣闊的應(yīng)用前景，能夠產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益和良好的社會效益。文檔編號C12Q1/68GK101805800SQ20101015560公開日2010年8月18日申請日期2010年4月21日優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日發(fā)明者劉剛,劉月平,張浩,方美英,黃金明申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)