專利名稱：具有改變產(chǎn)物產(chǎn)量特性的真細(xì)菌rna聚合酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離的真細(xì)菌突變體，其包含至少一突變，上述突變導(dǎo)致rpoB基 因編碼的RNA聚合酶0 -亞基中至少一種氨基酸發(fā)生取代，因此在同等的條件下，與等基因 親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變。 本發(fā)明的另一方面涉及在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法以及使用本發(fā)明的 突變真細(xì)菌生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的用途。
背景技術(shù)：
在多肽的工業(yè)化生產(chǎn)中，人們的興趣是獲得盡可能高的產(chǎn)物產(chǎn)量。增加產(chǎn)量的一 條途徑是增加編碼目標(biāo)多肽的基因的拷貝數(shù)，其可以通過將基因置于具有高拷貝數(shù)的質(zhì)粒 中來實現(xiàn)，然而在宿主細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，如果沒有選擇壓力，質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，并且經(jīng)常 從宿主細(xì)胞中丟失。另一條增加目標(biāo)基因拷貝數(shù)的途徑是以多拷貝的形式將其整合到宿 主細(xì)胞的染色體上。以前已經(jīng)描述過在不使用抗生素標(biāo)記的情況下，通過雙重(double) 同源重組的方法可以將基因整合到染色體上(Hone等，Microbial Pathogenesis, 1988, 5 407-418)；也有關(guān)于整合兩個基因的描述(Novo Nordisk :W091/09129和TO 94/14968)。將 基因的多個拷貝整合到宿主細(xì)胞的染色體上導(dǎo)致了不穩(wěn)定性。也有人描述過將空間上緊密 相連的反向平行排列的兩個基因整合能獲得較好的穩(wěn)定性(Novozymes :W0 99/41358)，并 且將多基因的多拷貝整合也同樣具有穩(wěn)定性(Novozymes :W0 02/00907)。其他增加產(chǎn)物產(chǎn)量的方法可以是提高調(diào)節(jié)特異性目標(biāo)基因表達(dá)的特異性啟動子 的啟動子活性，也可以通過同時綜合提高一些啟動子的活性來改善產(chǎn)物的產(chǎn)量。在細(xì)菌的RNA聚合酶中，研究最多的是大腸桿菌(E.coli)的RNA聚合酶，它代表 了從許多細(xì)菌屬中分離得到的酶，包括沙門氏菌屬(Samonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、 變形菌(Proteus)、氣桿菌屬(Aerobacter)和芽孢桿菌屬(Bacillus) (Fukuda 等，1977， Mol. Gen. Genet. 154 135)。RNA聚合酶的核心酶由a、日和3，-亞基，按2 1 1的比例組成，它們分別 由rpoA、rpoB和rpoC基因編碼。在RpoB基因內(nèi)突變體提供了對多種抗生素(如利福平) 的細(xì)胞抗性。利福平結(jié)合于0 -亞基，并且在體外和體內(nèi)均完全阻止了通過酶的RNA鏈的生產(chǎn) 起始作用(Wehrli和Staehelin, 1971,Bact. Rev. 35 290)。由于3 -亞基發(fā)生了改變不再 與藥物相結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞獲得了對利福平的抗性。利福平抗性細(xì)胞的RNA聚合酶0 -亞基中的突變位于亞基中心的200個氨基酸鏈 長中的3個單獨的區(qū)域，上述區(qū)域被定義為假定的利福平結(jié)合袋(packet) (Jin和Gross，:45_58)。由rpoB基因突變所產(chǎn)生的利福平抗性可以產(chǎn)生多效表現(xiàn)型(Yang和Price， 1995，J. Biol. Chem. 270 :23930_23933 ；Kane 等，1979，J. Bacteriol. 137 1028-1030)，一 些情況下可以導(dǎo)致基因活性的增加，而在一些情況下并不產(chǎn)生任何效果(Kane等，1979， J. Bacteriol. 137 :1028_1030)。Sharipova 等(1994，Microbiology 63 :29_32)報道，在 一些利福平抗性株系中具有較高水平的磷酸酶活性，而在另一些利福平抗性株系中則具 有較低水平的磷酸酶活性。已有人報道，從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的 利福平抗性SP0—分離物中，a -淀粉酶的活性增加了 100倍(Hu Xuezhi等，1991，Acta microbiologicasinica 31:268-273)。在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中，突 變Q469R導(dǎo)致產(chǎn)生了利福平抗性，并對NusG產(chǎn)生了超敏性(Ingham和Furnaux，2000， Microbiology, 146 :3041_3049)。

發(fā)明內(nèi)容
雖然一些報道顯示在利福平抗性分離物中一些基因產(chǎn)物的產(chǎn)量有所增加，但也有 報道表明rpoB的突變效果具有很高的多效性，并且所觀察到的產(chǎn)量增加從來沒有聯(lián)系到 特定的rpoB基因中的突變。令人驚奇的是本發(fā)明的特異性突變無論是單獨、還是組合，在 所述rpoB-突變存在于宿主菌株時，都將導(dǎo)致目的產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生大幅度的改善。本發(fā)明的第一方面涉及一種分離的突變體真細(xì)菌，其包含至少一個突變，上述突 變導(dǎo)致了所編碼的RNA聚合酶0 -亞基中至少一種氨基酸發(fā)生取代，因此與在同等的生長 條件下培養(yǎng)的等基因親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物 的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所說的至少一種氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID而2中469、478、482、 485和487的任一位置處，或者發(fā)生在任何真細(xì)菌RNA聚合酶3 -亞基家族成員的等價位置 上。本發(fā)明的第二方面涉及在突變真細(xì)菌中產(chǎn)生至少一種目的產(chǎn)物的方法，包括在適 當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，并產(chǎn)生上述目的產(chǎn)物。本發(fā)明的第三方面涉及使用本發(fā)明的突變真細(xì)菌來生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的用 途，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，并產(chǎn)生上述目的產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明涉及如下方面1. 一種不同等基因的親本真細(xì)菌之分離的突變體，其包含至少一個突變，上述突 變導(dǎo)致了由rpoB基因編碼的RNA聚合酶0 -亞基中至少一個氨基酸發(fā)生取代，，與同等的 條件下培養(yǎng)的等基因親本株系的產(chǎn)量或生產(chǎn)率相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量 或生產(chǎn)率得到了改善，其中所述的至少一個氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID N0:2中位置469、 478、482、485或487中的任何位置，或者任何真細(xì)菌RNA聚合酶0 -亞基家族成員的等價位 置；其條件為，所述的突變真細(xì)菌不是其中由Q469K或Q469R組成的至少一個氨基酸取代的 枯草芽孢桿菌。2.根據(jù)項1所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括Q469R、 A478D、A478V、H482R、H482P、R485H 或 S487L。3.根據(jù)項1所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括在SEQ ID NO 2中位置469或478處的任何隨機(jī)取代，或在任何真細(xì)菌RNA聚合酶0 -亞基家族成員的等價位置所發(fā)生的取代。4.根據(jù)項1所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括在SEQ ID NO 2中位置469、478、和/或487處的任何隨機(jī)取代，或在任何真細(xì)菌RNA聚合酶0 -亞基 家族成員的等價位置所發(fā)生的取代。5.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括 Q469R、A478D、和 / 或 S487L。6.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括 Q469R 或 A478D。7.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中來源于細(xì)菌的RpoB蛋白與SEQ ID NO 2第461到500位置處氨基酸序列所述蛋白之等價區(qū)域具有至少80%的同源性。8.根據(jù)項7所述的分離的突變真細(xì)菌，其中來源于細(xì)菌的RpoB蛋白與SEQ ID NO 2第461到500位點處氨基酸序列所述蛋白的等價區(qū)域具有至少90%的同源性。9.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包括了革蘭氏陽性 菌。10.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包括了芽孢桿菌的 各個種。11.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其包括了嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽 孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩 芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢 桿菌。12.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其包括了遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢 桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。13.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為地衣芽孢桿菌。14.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是基因產(chǎn)物或代謝 途徑的產(chǎn)物。15.根據(jù)項14所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因包含在操縱子中。16.根據(jù)項14或15所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因是突變真細(xì)菌外源或內(nèi)源基因。17.根據(jù)項14-16中任何所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因以至少兩個拷貝的 形式存在。18.根據(jù)項14-17中任何所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因以至少十個拷貝的 形式存在。19.根據(jù)項14-18中任何所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因以至少100個拷貝的
形式存在。20.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物包括多肽、維生素、 氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性劑。21.根據(jù)項20所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是一種多肽，優(yōu)選是一種酶。22.根據(jù)項21所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶選自分類系統(tǒng)中的下述酶類氧化還原酶(EC 1)、轉(zhuǎn)移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC4)、異構(gòu)酶(EC 5)或連接酶 (EC 6)。23.根據(jù)項21或22所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶選自具有下述活性的酶類 氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì) 酶、角質(zhì)酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、3 -半乳糖苷酶、葡 糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、 異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇六磷 酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。24.根據(jù)項23所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶是淀粉酶或甘露聚糖酶。25.根據(jù)項20所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是包括纖維素結(jié)合區(qū)、淀 粉結(jié)合區(qū)、抗體、殺微生物肽、激素或者融合蛋白多肽的多肽。26.根據(jù)項20所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是碳水化合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸。27.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中真細(xì)菌是重組真細(xì)菌。28.根據(jù)項27所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是重組多肽。29.根據(jù)項28所述的分離的突變真細(xì)菌，其中編碼多肽的基因被整合到突變真細(xì) 菌的宿主染色體上，但在整合位點處并未留有任何抗生素抗性標(biāo)記基因。30.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變與生長 在等同條件下的等基因親本株系正常水平相比，其產(chǎn)量至少增長5%到1000%。31.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變與生長 在等同條件下的等基因親本株系正常水平相比，其產(chǎn)量至少增長5%到500%。32.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變與生長 在等同條件下的等基因親本株系正常水平相比，其產(chǎn)量至少增長5%到250%。33.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變包括改 善產(chǎn)量或改善生產(chǎn)力。34.根據(jù)上述任何項所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是分泌型、膜結(jié)合型 或存在于細(xì)胞內(nèi)。35. 一種在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中 培養(yǎng)項1-34中任意之一所定義的突變真細(xì)菌，由此產(chǎn)生所述目的產(chǎn)物。36.根據(jù)項35所述的方法，其進(jìn)一步包含分離或純化目的產(chǎn)物。37.項1-34中任意之一所述的突變真細(xì)菌在生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物中的用途，其 中包括了在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，由此產(chǎn)生所述目的產(chǎn)物。38.根據(jù)項37所述的用途，其進(jìn)一步包含分離或純化目的產(chǎn)物。


附圖1中對比序列的第一行顯示了地衣芽孢桿菌RpoB蛋白的40個氨基酸片段， 對應(yīng)于SEQ ID NO 2中第461到500的位置。第二行顯示了克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii) RpoB蛋白的同源的40個氨基酸片段，對應(yīng)于(incl.)序列4中第462到501的位 置，上述位置與SEQ ID NO :2中的相應(yīng)位置進(jìn)行了比對。上述兩個片段與已公布的不同細(xì)菌的RpoB蛋白序列進(jìn)行了比對，結(jié)果顯示在附圖1中，粗體字母表示與頂端兩個芽孢桿菌 屬RpoB蛋白序列存在差異的野生型序列。附圖中每一個來源編號對應(yīng)的同源片段，其微生 物來源如下來 源 1)B oor 等，Genetic and transcriptional organization of the regionencoding the beta subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase. J. Biol. Chem. 270 20329(1995)。來 源 2) Kaneko 等，Sequence analysis of the genome of the unicellularcyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determinationof the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNARes. 3 109(1996)。來 源 3)Parkhill 等，Complete DNA sequence of a serogroup A strain ofNeisseria menigitidis Z2491. Nature 404:502(2000)。4)Aboshikiwa Cloning and physical mapping of theStaphylococcus aureus rplL， rpoB and rpoC genes， encoding ribosomal proteinL7/L12 and RNA polymerase subunits beta and beta’ .J. Gen. Microbiol. 138 :1875(1992)。來 源 5) Ovchinnikov 等，The primary structure of Escherichia coli RNApolymerase. Nucleotide sequence of the rpoB gene and amino—acid sequence ofthe beta-subunit. Eur. J. Biochem. 116 :621 (1981)。來源 6)Fleischmann 等，Whole-genome random sequencing and assemblyof Haemophilus influenzae Rd. Science 269:496(1995)。來 源 7)Kalman 等，Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis. Nat. Genet. 21 :385 (1999)。來源 8)Mollet 等，Determination of Coxiella burnetii rpoB sequence and itsuse for phylogenetic analysis. Gene 207:97(1998)。來源 9) Stover 等，Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosaPAO 1, an opportunistic pathogen. Nature 406:959(2000)。來源 10)Borodin 等，Nucleotide sequence of the rpoB gene coding for thebeta-subunit of RNA polymerase in Pseudomonas putida. Lokl. Biochem. 302 1261(1998)。來 源 11) Sverdlov 等，Nucleotide sequence of the rpoB gene of SamonellatyPhimurium coding for the beta-subunit of RNA polymerase. Dokl. Biochem. 287 62(1986)。來 源 12) Honore 等，Nucleotide sequence of the first cosmid from theMycobacterium leprae genome project structure and function of the Rif-Strregions. Mol. Microbiol. 7 207 (1993)。來 源 13)Alekshun 等，Molecular cloning and characterization of Borreliaburgdorferi rpoB.Gene 186:227(1997)。來 源 14) Laigret 等，The unique organization of the rpoB region ofSpiroplasma citri :a restriction and modification system gene is adjacent to
8rpoB.Gene 171 95(1996)。來 源 15) Parkhi 11 等，The genome sequence of the food-borne pathogenCampylobacter jejuni reveals hypervariable seqyences.Nature 403 665(2000)。來源 16)Deckert 等，The complete genome of the hyperthermophilicbacterium Aquifex aeolicus. Nature 392:353(1998)。來源 17)Palm等，The DNA-dependent RNA-polymerase of Thermotogamaritima ； characterisation of the enzyme and the DNA-sequence of the genes forthe large subunits. Nucelic Acids Res. 21 :4904(1993)。源18)Takaki等，Sequence analysis of a 32~kb region including themajor ribosomal protein gene clusters from alkaliphilic Bacillus sp. strain C-125. Biosci.Biotechnol. Biochem. 63 :452 (1999)。來 源 19) Simpson 等，The genome sequence of the plant pathogen Xylellafastidiosa. Nature 406 :151(2000)。來源 20)Drancourt，M. Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella taxonomy. Submitted(FEB-1999)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。來 源 21)Drancourt and Raoult， Calymmatobacterium granulomatis rpoB. Submitted(DEC-1999)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。來源 22)Mollet 等，(Serratia marcescens)RNA polymerase beta-subunit. Submitted(N0V-1996)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases0來 源 23) Nakasone 等，Isolation of rpoB and rpoC genes from deep-seapiezophilic bacterium Shewanella violacea and its overexpression in Escherichiacoli. Submitted(JUL-2000)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。來 源 24)Padayachee and Klugman， Molecular basis forrifampicin resistantStreptococcus pneumoniae isolates from South Africa. Submitted(FEB-1999)tothe EMBL/GenBank/DDBJ databases0來 源 25)Nielsen 等，Legionella pneumophi 1 a RNA polymerase B-subunit (rppB)gene. Submitted(DEC-1998)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。來 源 26) White 等，Genome sequence of the radioresistant bacteriumDeinococcus radiodurans Rl. Science 286:1571 (1999)。27)Streptomyces coelicolor, Seeger and Harris, Submitted(MAR-2000) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。來 源 28) Helicobacter pylori (Campylobacter pylori) , Hocking 等， Submitted(JAN-1997)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。定義在討論本發(fā)明的具體實施方案之前，首先提供關(guān)于本發(fā)明主要方面的特定術(shù)語的 定義。在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中，使用了傳統(tǒng)的單個字母核苷酸代碼和傳統(tǒng)的單 個字母和三個字母氨基酸殘基代碼。為了便于參考使用了下列命名法原始氨基酸 位點取代氨基酸
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按照這種命名法，具體實例為，天冬酰胺在位置30處取代丙氨酸以表示為Ala 30 Asn 或 A30N在同一位置處的丙氨酸缺失表示為Ala 30*或 A30*插入額外的氨基酸殘基，例如賴氨酸，表示為Ala 30 AlaLys 或 A30AK缺失氨基酸殘基的連續(xù)區(qū)段，30-33位置處的氨基酸殘基為例，可以表示為 (30-33)*。在含有缺失(例如缺失氨基酸殘基)的特異性多肽與其同源多肽進(jìn)行相比處，如 果在上述位置發(fā)生插入，可以表示為*36Asn或 *36N 表明了在位置36處插入了天冬酰胺。多突變采用加號來表示，例如Ala 30 Asn+Glu 34 Ser 或 A30N+E34S代表了在位置30和34處發(fā)生了取代(天冬酰胺和絲氨酸分別取代了丙氨酸和谷 氨酸)。在一個給定的位置處可以插入一個或更多個可選擇的氨基酸殘基時，表示為A30N, E或 A30N 或 A30E此外，當(dāng)一個適合于修飾的位置沒有給出具體的修飾方式時，可以理解為其它任 何氨基酸殘基都可以取代該位置上的氨基酸殘基(例如可以從A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、 L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中選擇不同于通常在所研究該位置上的其它任一氨基酸殘基)。 因此，例如在位置202處發(fā)生甲硫氨酸的修飾作用(取代)，M202，但并沒有給出具體的修 飾方式，可以理解為其它任一氨基酸殘基都可以取代甲硫氨酸，例如可以從A、R、N、D、C、Q、 E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y和V中選擇其它任何氨基酸殘基。真細(xì)菌本發(fā)明中的術(shù)語“真細(xì)菌”是指具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞原核微生物，細(xì)胞可 以是桿菌、球菌(cocci)或螺旋菌，多數(shù)種類的細(xì)菌是通過一個或多個鞭毛來實現(xiàn)運(yùn)動的。 真細(xì)菌與原始細(xì)菌的區(qū)別之處在于其擁有肽聚糖細(xì)胞壁和由酯類相連的脂質(zhì)。突變真細(xì)菌本發(fā)明中的術(shù)語“突變真細(xì)菌”是指不同的等基因(otherwise isogenic)親本真細(xì)菌，它是通過在RNA聚合酶0 -亞基上述5個位置中的至少1個發(fā)生突 變而獲得的。取代本發(fā)明中的術(shù)語“取代”是指一個氨基酸被另一個氨基酸替代。0 -亞基本發(fā)明中的術(shù)語“ 0 -亞基”是指rpoB基因編碼的RpoB蛋白，其被包含 在RNA聚合酶中，所述RNA聚合酶由a、0和0，-亞基組成，按2 1 1的比例組成， 它們分別由rpoA、rpoB和rpoC基因編碼。rpoB基因本發(fā)明中的術(shù)語“rpoB基因”是指編碼RNA聚合酶中亞基的基因。0 -亞基家族成員本發(fā)明中的術(shù)語“ 0 -亞基家族成員，，不是指通常分類學(xué)意義 上的包含相同屬成員的家族，而是指由a、0和0 ’ 3個亞基組成，并按上述比例組成的原 核(真細(xì)菌)RNA聚合酶，其中亞基氨基酸序列包含了 40個連續(xù)的氨基酸，這40個連 續(xù)的氨基酸序列可以與SEQ ID NO 2中RpoB蛋白序列第461到500處位置進(jìn)行比對，并且至少具有75%的同源性。等基因親本株系本發(fā)明中的術(shù)語“等基因親本株系”是指在突變體中，除所述突 變體的rpoB基因至少一個突變外，該菌株遺傳上等同于的突變體菌株或突變體的后代。等價位置本發(fā)明中的術(shù)語“等價位置”是指與SEQ ID NO 2中461到500位置片 斷相比對后的位置，附圖1和實施例3中也進(jìn)行了解釋。同源性本發(fā)明中的術(shù)語“同源性”是指同源的多核苷酸或多肽。如果兩個或更多 個多核苷酸或兩個或更多個多肽具有同源性，這就意味著同源的多核苷酸或多肽至少具有 60 %的同一性，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，最優(yōu) 選至少98%?？梢酝ㄟ^已有技術(shù)中公知的計算機(jī)程序?qū)蓚€序列進(jìn)行對比來確定上述兩 個多核苷酸或多肽序列是否具有足夠高的同一性以達(dá)到所定義的同源性程度，此種計算機(jī) 程序例如 GCG 程序包中提供的 “GAP” 程序(Program Manual for the WisconsinPackage, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group,575 Science Drive, Madison, Wisconsin,USA 53711) (Needleman,S. B.禾口 Wunsch，C. D.，(1970),Journal of Molecular Biology，48，443-453)。在使用GAP程序?qū)NA序列進(jìn)行比較時，采用下述設(shè)定GAP生成 罰分(creation penalty)為 5. 0，GAP 延伸罰分(extension penalty)為 0. 3。代謝途徑本發(fā)明中的術(shù)語“代謝途徑”是指活細(xì)胞中由酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)鏈 條，例如將一種化合物轉(zhuǎn)換為另一種化合物，或由較小的單元組建成較大的高分子，或分解 化合物釋放出了利用的能量。外源的本發(fā)明中的術(shù)語“外源的”是指在自然情況下，通常不存在于宿主生物體 中的物質(zhì)，例如基因。內(nèi)源的本發(fā)明中的術(shù)語“內(nèi)源的”是指來源于宿主生物體體內(nèi)的物質(zhì)，例如基因。操縱子本發(fā)明中的術(shù)語“操縱子”是指包括一些基因的多核苷酸，這些基因成簇 的，并且可能轉(zhuǎn)錄在多順反子mRNA中，例如編碼代謝途徑中酶的基因。操縱子的轉(zhuǎn)錄可以 起始于啟動子區(qū)域，并且由相鄰的調(diào)控基因進(jìn)行調(diào)控，其編碼一種調(diào)控蛋白，反過來結(jié)合于 操縱子的操作子序列上，進(jìn)而分別對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制或增強(qiáng)。改變產(chǎn)物產(chǎn)量本發(fā)明中的術(shù)語“改變產(chǎn)物產(chǎn)量”是指或者產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改 變，其意味著每增加一定數(shù)量的底物，終產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，或者通過縮短或延長培養(yǎng) 周期可以獲得相同數(shù)量的終產(chǎn)物。改變產(chǎn)物產(chǎn)量可以是增加產(chǎn)物的產(chǎn)量，也可以是增加生 產(chǎn)力，然而也可以是降低產(chǎn)物的產(chǎn)量或降低某種產(chǎn)物的生產(chǎn)力。核酸構(gòu)建體此處所說的術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離 自天然存在的基因或已經(jīng)過修飾作用而包含了自然界中并不存在的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建 體包含表達(dá)本發(fā)明編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”具有相同 的含義。調(diào)控序列此處所說的術(shù)語“調(diào)控序列”是指包含了表達(dá)本發(fā)明多肽所必需的或有 利于表達(dá)本發(fā)明多肽的所有成份。對編碼多肽的核酸序列而言，每一種調(diào)控序列可以是同 源的，也可以是異源的。上述調(diào)控序列包括，但并不局限于前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸序列、前肽 序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。在最小程度上，調(diào)控序列包括了啟動子、轉(zhuǎn)錄和翻 譯終止信號。調(diào)控序列中可以提供接頭而有目的地引入特異性限制性位點，從而方便于調(diào) 控序列與編碼多肽的核酸序列中的編碼區(qū)域進(jìn)行連接。
操作性連接此處所說的術(shù)語“操作性連接”是指一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中調(diào)控序列 被放置在相對于DNA序列中的編碼序列而言為恰當(dāng)?shù)奈恢锰帲瑥亩ＷC調(diào)控序列可以行使 對多肽表達(dá)的指導(dǎo)作用。編碼序列此處所說的術(shù)語“編碼序列，，是意欲包括一種核酸序列，其直接說明的 是其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的界限通常為開放閱讀框確定，其通常起始于起始 密碼子ATG。典型的編碼序列包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。表達(dá)此處所說的術(shù)語“表達(dá)”包括了產(chǎn)生多肽的任何步驟，其中包括了，但并不局 限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體此處所說的術(shù)語“表達(dá)載體”包括了線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包括 了編碼本發(fā)明多肽的片段，上述片段操作性地與提供其轉(zhuǎn)錄的其它片段相連。宿主細(xì)胞此處所說的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括了任何適于用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型。
具體實施例方式如前所述大腸桿菌中導(dǎo)致利福平抗性的突變體具有多種效果。大腸桿菌中的這種 抗性來源于rpoB基因中的點突變(Jin和Gross, 1988，J. Mol. Biol. 202 :45_58)，上述點突 變處于該蛋白的3個獨立區(qū)域。在一些報道中突變也造成了特異性蛋白表達(dá)水平發(fā)生了改 變。在來自不同的細(xì)菌的已知rpoB基因中進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了很高程度的同源性。我們已經(jīng)測定出地衣芽孢桿菌中RpoB蛋白的氨基酸序列與枯草芽孢桿菌中RpoB 蛋白具有約95%的同源性。在枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的亞基中擁有四個非常相似的 共線性序列區(qū)，其中包括了一旦改變將產(chǎn)生利福平抗性的保守區(qū)域。本發(fā)明分離了地衣芽 孢桿菌的rpoB突變體，并且檢測了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。可以采用已有技術(shù)中已知的方法來獲 得RpoB突變體，例如定點突變或隨機(jī)突變。如前所述RpoB蛋白中還存在有其它一些位置， 如果上述位置發(fā)生突變將導(dǎo)致產(chǎn)生利福平抗性。本發(fā)明獲得了地衣芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌的利福平抗性RpoB突變體，并且 檢測了不同RpoB突變個體對目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變情況。通過對分離的突變體進(jìn)行研究表明，地衣芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌的利福平抗 性是由于rpoB基因的點突變，在實施例4和5中還進(jìn)一步鑒定了增加了特異性目的產(chǎn)物產(chǎn) 量的特異性突變體。在多數(shù)情況下，如果RpoB蛋白5個特異性位置中的一個發(fā)生了單氨基酸取代就 將導(dǎo)致目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生改善，同時也可能存在兩個或更多個特異性突變之間的協(xié)同效^ o因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種分離的真細(xì)菌突變體，其包含至少一個突變，上 述突變導(dǎo)致了由rpoB基因編碼的RNA聚合酶0 -亞基中至少一種氨基酸發(fā)生取代，因此在 同等的生長條件下，與等基因親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了 目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所說的至少一種氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID NO :2中469、 478、482、485和487的任一位置處，或者發(fā)生在任一真細(xì)菌RNA聚合酶0 -亞基家族成員的 等價位置上。在另一個實施方案中，產(chǎn)物產(chǎn)量的改變是指產(chǎn)量改進(jìn)。
在分離的突變體DNA序列中，本發(fā)明鑒定出一些至少是一個氨基酸發(fā)生了取代的 特異性突變，上述特異性突變提高了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此在本發(fā)明的一個實施方案中，涉 及在由rpoB基因編碼的RNA聚合酶的0 -亞基中至少有一個氨基酸發(fā)生了取代，上述至 少一個氨基酸所發(fā)生的至少一個取代包括了 Q469R、A478D、A478V、H482R、H482P、R485H或 S487L，在與SEQ ID NO 2進(jìn)行比對時，上述位置對應(yīng)于不同來源的0 -亞基的等價位置。一旦確定了可以導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量發(fā)生改善的相關(guān)位置后，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以在 此相同的位置試著進(jìn)行隨機(jī)突變。本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案涉及了本發(fā)明第一方面所提到 的分離的突變真細(xì)菌，在上述突變真細(xì)菌中，所說的至少一個氨基酸取代包括了在SEQ ID NO 2中位置469或478處的任何隨機(jī)取代；或者包括了在SEQ ID NO 2中位置469、478和 /或487處的任何取代；或者在任一真細(xì)菌RNA聚合酶3 -亞基家族成員的等價位置所發(fā) 生的取代。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，涉及了上述定義的分離突變真細(xì)菌，其中所發(fā) 生的至少一個氨基酸取代包括了 Q469R、A478D和/或S487L ；或者優(yōu)選包括Q469R或A478D ； 其中在與SEQ ID NO :2進(jìn)行比對時，上述位置對應(yīng)于這些亞基的等價位置。按照本發(fā)明，分離細(xì)菌應(yīng)包含由a、0和0，3個亞基按上述比例組成的RNA聚 合酶，上述3 _亞基氨基酸序列中包含40個連續(xù)的氨基酸，這40個連續(xù)的氨基酸序列可以 與SEQ ID NO 2中RpoB蛋白第461到500處位置進(jìn)行比對，并且至少具有75%的同源性。在一個特定的實施方案中，上述同源性至少為80%，在另外兩個特定的實施方案 中，上述同源性分別為85%和90%。在一些細(xì)菌種類中，例如大腸桿菌、沙門氏菌屬(Salmonetla)、奈瑟氏菌屬 (Neiseria)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等一些革蘭氏陰性菌，與地衣芽孢桿菌(SEQ ID NO 2)位置478處相等價的位置處通常是由絲氨酸(S)而不是丙氨酸(A)。如附圖1所示， 地衣芽孢桿菌SEQ ID NO 2中461到500位置處的氨基酸片段均可與已公布的各種細(xì)菌 RpoB蛋白相應(yīng)序列進(jìn)行比對。由于絲氨酸和丙氨酸在結(jié)構(gòu)上非常相似，因此用絲氨酸來替代丙氨酸或用丙氨酸 來替代絲氨酸而不影響RpoB蛋白的功能并不足以為奇。因此本發(fā)明所說的在478位置處發(fā)生的氨基酸取代，例如A478D或A478V或A478 的任一隨機(jī)取代，應(yīng)該包括S478D或S478V或S478的任一隨機(jī)取代。在本發(fā)明的第一方面，細(xì)菌是分離的突變真細(xì)菌。在其中的一個實施例中， 分離的突變真細(xì)菌是革蘭氏陽性菌。可用的革蘭氏陽性菌包括了，但不局限于芽孢桿 菌屬菌種(Bacillus sp.)、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿 菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢 桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱 桿菌禾口蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。在另一個實施例中，所說細(xì)菌包括遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿 菌、克勞氏芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。在本發(fā)明的另一個實施例中，所說細(xì)菌是地衣芽孢桿菌。
按照本發(fā)明，目的產(chǎn)物包括基因產(chǎn)物或代謝途徑中的產(chǎn)物，由于rpoB基因編碼的 RNA聚合酶的亞基中至少一個氨基酸發(fā)生了至少一次的取代作用，從而導(dǎo)致上述產(chǎn)物 的產(chǎn)量得到了改善。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中涉及了第一方面的突變體，該突變體中的目的產(chǎn)物 是基因產(chǎn)物或代謝途徑中的產(chǎn)物，優(yōu)選編碼目的產(chǎn)物的基因包含在操縱子中；更優(yōu)選該基 因是突變真細(xì)菌的外源或內(nèi)源基因；最優(yōu)選該基因以至少2個拷貝的形式存在或至少10個 拷貝或甚至至少100個拷貝。可以通過能夠穩(wěn)定保持的合適質(zhì)粒來攜帶基因或操縱子，例如在宿主細(xì)胞中能夠 穩(wěn)定自主復(fù)制的質(zhì)粒(對質(zhì)粒的選擇主要依靠該質(zhì)粒與要引入的宿主細(xì)胞之間是否具有 穩(wěn)定的兼容性)或其可攜帶在宿主的染色體上。上述基因可以與宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性，在 這種情況下，目的產(chǎn)物是宿主細(xì)胞產(chǎn)生的天然蛋白，并且大多數(shù)情況下，該基因處于其在染 色體的通常位置處。如果編碼目的產(chǎn)物的基因是一種外源基因，可以用合適的質(zhì)粒攜帶該 基因或?qū)⒃摶蛘系剿拗鞯娜旧w上。在本發(fā)明的一個實施方案中，真細(xì)菌是一種重組 真細(xì)菌。在其它的實施方案中目的產(chǎn)物也可以是一種重組蛋白?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的一些技術(shù)對編碼目的產(chǎn)物的基因進(jìn)行整合。該基 因可以在染色體上存在一個、兩個或更多個拷貝。W0 91/09129和W0 94/14968 (Novo Nordisk)對整合兩個基因進(jìn)行了描述，上述 內(nèi)容一并作為參考。W0 99/41358描述了對空間上緊密相連的反向平行排列的兩個基因進(jìn) 行整合具有較好的穩(wěn)定性(Novo Nordisk)，上述內(nèi)容一并作為參考。W0 02/00907描述了 基因的穩(wěn)定染色體多拷貝整合(Novozymes A/S)，上述內(nèi)容一并作為參考。編碼目的產(chǎn)物的基因以多拷貝的形式存在可以進(jìn)一步改善上述產(chǎn)物的產(chǎn)量。整合 在宿主細(xì)胞染色體上的基因可以每條染色體上一個、兩個或更多個拷貝的形式存在。攜帶 于質(zhì)粒中的基因可以在每個宿主細(xì)胞中以上百個拷貝的形式存在。在本發(fā)明的一個實施方 案中，上述基因以至少兩個拷貝的形式存在。在另一個實施方案中，上述基因以至少十個拷 貝的形式存在。在另一個實施例中，上述基因以至少100個拷貝的形式存在。為了方便對染色體整合的選擇，導(dǎo)致使用了選擇性標(biāo)記，例如抗生素抗性標(biāo)記。然 而應(yīng)當(dāng)盡量避免使用抗生素標(biāo)記基因。W0 01/90393描述了一種將基因整合到宿主細(xì)胞染 色體上而在菌株中并未留有抗生素抗性標(biāo)記的方法，上述內(nèi)容一并作為參考。在本發(fā)明的另一個實施方案中，涉及了對上述定義的分離的突變真細(xì)菌，在該突 變真細(xì)菌中編碼目的產(chǎn)物的基因被整合到突變真細(xì)菌的宿主染色體上，但在整合位點處并 未留有任何抗生素抗性標(biāo)記。本發(fā)明也涉及了包含編碼目的產(chǎn)物的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其可以操作性地 連接于一個或更多個調(diào)控序列上，上述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中、在與其相兼容的條 件下，對編碼序列的表達(dá)進(jìn)行指導(dǎo)。可以采用多種途徑對編碼目標(biāo)多肽的核苷酸序列進(jìn)行調(diào)控以使其表達(dá)目標(biāo)多肽。 根據(jù)表達(dá)載體，在將核苷酸序列插入表達(dá)載體之前，對其進(jìn)行調(diào)控是比較合理或必需的。采 用重組DNA方法對核苷酸序列進(jìn)行修飾的技術(shù)已為本領(lǐng)域人員所公知。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?，其為宿主?xì)胞所識別的能夠表達(dá)目標(biāo)核苷酸 序列的核苷酸序列。啟動子序列中包含有可以調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以
14是任何在宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列，包括了突變、截短和雜交啟動子，其可以 來源于與宿主細(xì)胞同源或異源的編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。適于調(diào)節(jié)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動子實例，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，可 以是來源于大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍(lán)色鏈霉菌(Str印tomyces coelicolor) 的瓊脂糖基因(dagA)，枯草芽孢桿菌的蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)，地衣芽孢桿 菌的a-淀粉酶基因(amyL)，嗜熱脂肪芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽 孢桿菌的a-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢桿菌的青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢桿菌 的xylA和xylB基因及原核內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75:3727-3731), l^XRtac ^ij]^ (DeBoer 等，1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 :21_25)。 在 "Usefulproteins from recombinant bacteria，， 于 Scientific American,1980,242 74-94和Sambrook等，1989，同上中也描述了一些其它啟動子。調(diào)控序列也可以是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，該序列為宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。 終止子序列可操作性地連接于編碼多肽的核苷酸序列的3’末端。任何在宿主細(xì)胞中具有 功能的終止子都可以在本發(fā)明中使用。調(diào)控序列也可以是適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列，其是對宿主細(xì)胞翻譯起重要作用的mRNA的 非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作性地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在宿主細(xì) 胞中具有功能的前導(dǎo)序列都可以在本發(fā)明中使用。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是一種可操作性地連接于核苷酸序列3’末 端的序列，并且在轉(zhuǎn)錄過程中，可以被宿主細(xì)胞識別作為信號在轉(zhuǎn)錄形成的mRNA上加載多 聚腺苷酸殘基。任何在宿主細(xì)胞中具有功能的多聚腺苷酸化序列都可以在本發(fā)明中使用。調(diào)控序列也可以是一種信號肽編碼區(qū)，該區(qū)域編碼的氨基酸序列與多肽的氨基末 端相連，并指導(dǎo)所編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核苷酸序列的5’末端編碼序列天然包 含一種信號肽編碼區(qū)，其通常與翻譯閱讀框相連，編碼區(qū)的片段可以編碼分泌型多肽?；蛘?編碼序列的5’末端包含與編碼序列異源的信號肽編碼區(qū)。在天然編碼序列中不包含信號 肽編碼區(qū)時需要異源信號肽編碼區(qū)簡單地替代天然信號肽編碼區(qū)?；蛘邽榱嗽黾佣嚯牡姆?泌，可以用異源信號肽編碼區(qū)簡單替換天然的信號肽編碼區(qū)。然而任何可以指導(dǎo)表達(dá)多肽 進(jìn)入宿主細(xì)胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)都可以在本發(fā)明中使用。對細(xì)菌宿主細(xì)胞而言，有效的信號肽編碼區(qū)可以是來源于芽孢桿菌屬NCIB 11837麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌a -淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋 白酶基因、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、 nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA基因的信號肽編碼區(qū)。在Simonen和Palva，1993， Microbiological Reviews 57 :109_137 中也描述了一些其它的信號肽。調(diào)控序列也可以是前肽編碼區(qū)，其編碼的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。由 此產(chǎn)生的多肽被稱為酶或前多肽(在一些情況下也被稱為酶原(zymogen))。通常前多 肽是不具有活性的，可以通過催化作用或自主催化作用從前多肽中切除前肽而轉(zhuǎn)變成成 熟的有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可以來源于枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因(aprE)、 枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶基因(nprT)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的a因子、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的天冬氨酸蛋白酶基因和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)的漆酶基因(TO 95/33836)。在多肽的氨基末端存在信號肽和前肽區(qū)，前肽區(qū)的位置靠近多肽的氨基末端，而 信號肽區(qū)的位置靠近前肽區(qū)的氨基末端。增加調(diào)節(jié)序列也是十分必要的，因為這些調(diào)節(jié)序列可以隨著宿主細(xì)胞的生長來調(diào) 節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例可以是那些對化學(xué)或物理刺激以及調(diào)節(jié)化合物發(fā)生反應(yīng)并 開啟或關(guān)閉基因表達(dá)的序列。原核系統(tǒng)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱子系統(tǒng)。也 可以采用酵母的ADH2或GAL1系統(tǒng)。在真核系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括了在甲氨蝶呤存在時能 夠擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和在重金屬存在時能夠擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在上述情況 下，編碼多肽的核酸序列可操作性地與調(diào)節(jié)序列相連接。表汰載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。上述的各種核酸和調(diào)控序 列可以連接在一起，從而產(chǎn)生了重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體中包括了一個或更多個限 制性酶切位點，保證了在上述位點處方便地插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘咭部梢?通過將核苷酸序列或含有該核苷酸序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體來表達(dá)本發(fā)明 的核苷酸序列。在構(gòu)建的表達(dá)載體中，編碼序列位于載體中以便于將編碼序列操作性地與 表達(dá)的調(diào)控序列相連接。重組表達(dá)載體可以是任何便于對重組DNA進(jìn)行操作并使核酸序列進(jìn)行表達(dá)的載 體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇主要依靠于載體與載體將要引入的宿主細(xì)胞之間的兼 容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。載體可以是能夠自主復(fù)制的載體，例如存在于染色體之外的載體，它的復(fù)制與染 色體的復(fù)制相獨立，實例有質(zhì)粒、染色體外成份、微型染色體或人工染色體。為了保證自主復(fù)制，載體可以包含任何成份?；蛘邔⑤d體引入宿主細(xì)胞時，載體可 以與基因組整合在一起，與其插入的染色體一起進(jìn)行復(fù)制。此外，可以將含有全長DNA的單 個載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的基因組中，或是使用轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個或更多個選擇標(biāo)記，上述選擇標(biāo)記允許對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn) 行容易的選擇。選擇標(biāo)記可以是一種基因，其產(chǎn)物可以提供生物殺滅劑或病毒抗性、對重金 屬的抗性、原養(yǎng)型微生物對營養(yǎng)缺陷體的抗性等。細(xì)菌性選擇標(biāo)記的實例有來源于枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者 可以提供抗生素抗性的標(biāo)記，例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有能夠允許將載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組或載體能夠 在宿主細(xì)胞中獨立于基因組進(jìn)行自主復(fù)制的元件。為了能夠整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可以根據(jù)編碼多肽的核苷酸序列或其它 任何能夠通過同源重組或非同源重組而將載體穩(wěn)定整合到基因組中的元件?；蛘咻d體中含 有額外的可以指導(dǎo)通過同源重組而將載體整合到宿主細(xì)胞中的核苷酸序列。上述額外核苷 酸序列可以將載體精確地整合到宿主細(xì)胞基因組中確定的染色體位置上。為了增加精確整 合的可能性，整合元件優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核苷酸，例如100到1500個堿基對，優(yōu)選400到 1500個堿基對，最優(yōu)選800到1500個堿基對，上述堿基對與相應(yīng)的靶序列具有高度的同源 性以增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是任何與宿主細(xì)胞基因組中目標(biāo)序列相同源的 序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體也可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了保證載體能夠在所研究宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，載體還要含有復(fù)制起點。 細(xì)菌中復(fù)制起點的實例可以是質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的允許在大腸桿 菌中進(jìn)行復(fù)制，pUB110、pE194、pTA1060，pAM^ 1允許在芽孢桿菌中進(jìn)行復(fù)制。復(fù)制起點中 還可以含有突變，上述突變在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生了溫度敏感功能(例如參考Ehrlich，1978， Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 75:1433)0可以將超過一個拷貝的本發(fā)明核苷酸序列插入到宿主細(xì)胞中以增加基因產(chǎn)物的 產(chǎn)量?？赏ㄟ^向宿主細(xì)胞基因組中整合至少核苷酸序列的一個額外拷貝來增加核酸序列 的拷貝數(shù)，或者通過包括核苷酸序列與擴(kuò)增性選擇標(biāo)記基因來增加核酸序列的拷貝數(shù)，其 中細(xì)胞含有可選擇標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，其中通過在有適當(dāng)選擇試劑存在的情況下培養(yǎng)細(xì) 胞，可以獲得該核酸序列的額外拷貝數(shù)。本領(lǐng)域人員已經(jīng)廣泛熟悉了連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法 (例如參考Sambrook等，1989，同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，其優(yōu)先在重組生產(chǎn)多肽中 使用。將包含本發(fā)明核苷酸序列的載體引入到宿主細(xì)胞中，從而保證了如前所述的載體能 夠作為染色體的元件進(jìn)行復(fù)制或能夠在染色體之外進(jìn)行自主復(fù)制。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞 (unicelluar)微生物，例如原核微生物，也可以是非單細(xì)胞微生物，例如真核微生物?？梢圆捎玫膯魏思?xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽性菌，其中包括，但并不局限 于芽孢桿菌細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏 芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜 熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或者鏈霉菌細(xì)胞，例如淺青紫鏈霉菌 (Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus),或者革蘭氏陰性菌,例 如大腸桿菌和假單胞菌。在優(yōu)選實施例中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌， 嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另外一個優(yōu)選實施例中，桿狀細(xì)菌細(xì)胞是嗜堿 芽孢桿菌。將載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞可以采用的有效方法例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如參見 Chang 和 Cohen，I979，Molecular General Genetics 比8 :111_115)、采用感受態(tài)細(xì)胞(例 如參見 Young 禾口 Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81 :823_829，或者 Dubnau 禾口 Davidoff-Abelson, 1971, Journal of MolecularBiology 56 :209_221)、電轉(zhuǎn)化(例如參 B Shigekawa ^P Dower, 1988, Biotechniques 6 :742_751)、結(jié)合(conjugation)(例如參見 Koehler 禾口 Thorne, 1987, Journal ofBacteriology 169:5771-5278)。目的產(chǎn)物可以是任何基因的產(chǎn)物或者代謝途徑的產(chǎn)物，上述產(chǎn)物可以在工業(yè)上使 用，并且可以在例如真細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)。在本發(fā)明的一個實施方案中，目的產(chǎn)物包括 了多肽、維生素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性劑。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例是關(guān)于本發(fā)明第一方面的突變體，通過上述突變體產(chǎn)生 的目的產(chǎn)物包括了多肽、維生素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性劑；目的產(chǎn)物優(yōu)選 多肽；其中優(yōu)選酶類；更優(yōu)選選自酶分類系統(tǒng)中的下述酶類氧化還原酶(EC 1)、轉(zhuǎn)移酶 (EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、異構(gòu)酶(EC 5)和連接酶(EC 6)。
在本發(fā)明的其它實施例中，酶類可以是選自具有下述活性的酶類氨肽酶、淀粉 酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán) 式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、3 -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖 氧化酶、葡糖苷酶、鹵過氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶(irwertase)、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、 脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶(phytase)、酚氧 化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或者木聚糖酶，其中優(yōu)選淀 粉酶或甘露聚糖酶。在本發(fā)明的另一個實施方案中，多肽產(chǎn)物包括了纖維素結(jié)合區(qū)、淀粉結(jié)合區(qū)、抗 體、殺微生物肽、激素或者融合蛋白。優(yōu)選的目的產(chǎn)物是包含纖維素結(jié)合區(qū)、淀粉結(jié)合區(qū)、抗 體、殺微生物肽、激素或融合蛋白的多肽。目的產(chǎn)物也優(yōu)選碳水化合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸。在宿主細(xì)胞中，本發(fā)明的特異性突變改變了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改 變可以是如上所述的改善產(chǎn)量或改善生產(chǎn)力。在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)量的改變是指與生長在等同條件下的等基因親本 株系相比，其產(chǎn)量至少增長5%到1000%。在本發(fā)明的另一個實施方案中，產(chǎn)量的改變在 5%到500%之間，在另一個實施方案中，在5%到250%之間，在另一個實施方案中，產(chǎn)量的 改變在5%到50%之間。本發(fā)明的宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中、在適于生產(chǎn)目標(biāo)多肽的條件下進(jìn)行培 養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，產(chǎn)生的多肽任選從培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)基中進(jìn)行回收。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任一適于生長宿主細(xì)胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)基，例如進(jìn)行 了適當(dāng)添加的基本或復(fù)合培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基可以從商業(yè)上獲得或按照已公開的配方 進(jìn)行制備(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的 目錄中)。培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行制備(例如參見references for bacteria and yeast ；Bennett, J. ff.禾口 LaSure, L.編，More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA,1991)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽沒有分 泌到培養(yǎng)基中，可從細(xì)胞裂解物中回收多肽?？梢圆捎脗鹘y(tǒng)的方法從培養(yǎng)基中回收多肽，其 中根據(jù)具體的多肽種類包括了采用離心或過濾的方法從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，沉淀上清 的蛋白成分或采用硫酸銨等鹽類進(jìn)行過濾，采用離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析以 及相似的各種層析方法進(jìn)行純化。可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的特異方法對多肽進(jìn)行檢測，上述方法包括了使用特異 性抗體、形成一種酶產(chǎn)物或一種酶底物消失。例如可以采用一種酶實驗對多肽的活性進(jìn)行 檢測?？梢圆捎矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的各種方法對本發(fā)明的多肽進(jìn)行純化，其中包括了，但 并不限制于層析方法(例如離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層 析)，電泳方法(例如制備等電位聚焦電泳(IEF))、差異溶解度(如硫酸銨沉淀)或抽提 方法(例如參見 Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York,1989)。在本發(fā)明的一個實施方案中，目的產(chǎn)物分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中。在另一個實施方案 中，目的產(chǎn)物附著在細(xì)胞膜上。在另一個實施方案中，目的產(chǎn)物存在于細(xì)胞中。
本發(fā)明的第二方面涉及在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法，包括在適 當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明第一方面任一實施例所定義的突變真細(xì)菌，由此所述產(chǎn)物產(chǎn)生于 培養(yǎng)基中。用于培養(yǎng)的適合的培養(yǎng)基以及純化或分離目的產(chǎn)物的方法如上所述，其中純化 或分離是完成本發(fā)明額外的任選步驟。在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法、在適于生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)培 養(yǎng)基中對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。例如可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中、在適于多肽表達(dá)和/或分離的條件 下，采用搖瓶培養(yǎng)或在實驗室或工業(yè)發(fā)酵器中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵培養(yǎng)(包括連續(xù)發(fā) 酵、分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批(fed-batch)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)宿主細(xì)胞。在包含碳源、氮源和無 機(jī)鹽的適當(dāng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中，采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。適合的培養(yǎng)基可以從商 業(yè)上獲得或按照已公開的配方進(jìn)行制備(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如 果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽沒有分泌到培養(yǎng)基 中，可從細(xì)胞裂解物中回收多肽。可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的特異方法對多肽進(jìn)行檢測，上述方法包括了使用特異 性抗體、形成一種酶產(chǎn)物或消耗一種酶底物。例如可以采用一種酶實驗對多肽的活性進(jìn)行 檢測?？梢圆捎矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的方法對產(chǎn)生的多肽進(jìn)行回收，例如采用傳統(tǒng)的從營養(yǎng) 培養(yǎng)基中回收多肽的方法，其中包括了，但并不局限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或 沉淀。
可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種方法對本發(fā)明的多肽進(jìn)行純化，其中包括了，但 并不限制于層析方法(例如離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層 析)，電泳方法(例如制備等電位聚焦)、差異溶解度(如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提方 法(例如參見 Protein Purification, J. Janson 禾口 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York, 1989)。本發(fā)明的第三方面涉及使用本發(fā)明第一方面任一實施例所定義的突變真細(xì)菌生 產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法，其中包括了在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，由此目 的產(chǎn)物得以產(chǎn)生，并且任選使用分離或純化目的產(chǎn)物的步驟。下面的實施例對本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的解釋說明，然而并不對本發(fā)明的保護(hù)范圍 構(gòu)成限制。前面描述的特征和下面的實施例既可以相互獨立，也可以相互結(jié)合，它們是以不 同的形式來解釋本發(fā)明。實施例實施例1來源于地衣芽孢桿菌rpoB基因的DNA序列從包含有地衣芽孢桿菌染色體DNA片段的質(zhì)?？寺≈?，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定了地 衣芽孢桿菌rpoB基因的DNA序列。包含有地衣芽孢桿菌克隆的質(zhì)粒文庫來源于保藏 ATCC14580。DNA 序列顯示于 SEQ ID N0:1。實施例2地衣芽孢桿菌RpoB蛋白從SEQ ID NO :1DNA序列的開放閱讀框中翻譯的地衣芽孢桿菌RpoB蛋白顯示于 SEQ ID NO :2。
實施例3DNA聚合酶片段比對采用BLAST搜索對SEQ ID NO 2中位置461到500處的40個地衣芽孢桿菌RpoB 蛋白片段與已發(fā)表的不同細(xì)菌來源的RpoB蛋白序列進(jìn)行了比對。結(jié)果顯示于附圖1中，其 中第一行為地衣芽孢桿菌RpoB蛋白序列。實施例4特異rpoB突變體產(chǎn)量/生產(chǎn)力的改善材料和方法正如W0 91/09129和W0 99/41358中所記載的，表達(dá)盒的一個或更多個拷貝被整 合到下列株系的染色體中。株系JA 677 能夠過量生產(chǎn)內(nèi)源a -淀粉酶變體的地衣芽孢桿菌(BLA)。JA 678 :JA 677的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變Q469R。JA 688:能夠過量生產(chǎn)嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶突變體的地衣芽孢桿菌 (BSG)。JA 689 :JA 688的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變Q469R。JA 690 :JA 688的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變H482R。JA 684 能夠過量生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌a -淀粉酶的地衣芽孢桿菌(BAN)。JA 687 :JA 684的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變A478D。SJ 4671 能夠過量生產(chǎn)內(nèi)源a -淀粉酶的地衣芽孢桿菌(BLA)。SJ 4671 riflO :SJ 4671 的 rpoB 突變，導(dǎo)致氨基酸改變 A478V。SJ 4490 能夠過量生產(chǎn)內(nèi)源a -淀粉酶的地衣芽孢桿菌。JA 675 :SJ 4490 的 rpoB 突變，導(dǎo)致氨基酸改變 Q469R 和 R485H。SJ 6129 能夠過量生產(chǎn)芽孢桿菌屬a-淀粉酶突變體的地衣芽孢桿菌 (W000/60060中公布)；(糾正-實際的國際參考號為SJ 6093)。SJ 6129 riflO :SJ 6129 (SJ 6093)的 rpoB 突變，導(dǎo)致氨基酸改變 S487L。培養(yǎng)基LB 瓊脂10g/l來源于酪蛋白的蛋白胨；5g/l酵母抽提物；10g/l氯化鈉；12g/lBact0-瓊 脂，用50KAN調(diào)整pH到6. 8-7. 2，其中50KAN為含有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂。M-9緩 沖液(使用去離子水)磷酸氫二鈉 2H20 8. 8g/l ；磷酸二氫鉀3g/l ；氯化鈉4g/l ；硫酸 鎂 7H20 0. 2g/l。Med-F搖瓶培養(yǎng)基(于去離子水混勻后達(dá)到既定濃度):A部分麥芽糊精llg/1 ；酪胨6. 2g/l ；細(xì)菌用蛋白胨0. 5 ；酵母抽提物0. 5g/l ；硫 酸鎂 7H20 0. 5g/l ；氯化鈣0. lg/1 ；檸檬酸50mg/l ；痕量金屬(硫酸鋅 H20 2. 5mg/l ；硫 酸亞鐵 7H20 9. 9mg/l ；硫酸銅 5H20 1. 0mg/l ；氯化鋅 1. 0mg/l) ；Pluronic 0. lg/1 ；調(diào)整 pH 為 6. 7。B部分5g/l磷酸二氫鉀，用氫氧化鈉調(diào)整pH為6. 7。A部分和B部分在121°C下滅菌20分鐘后，按1 1的比例進(jìn)行混合。
搖瓶評估菌株的步驟首先，菌株在37°C下、在瓊脂中斜面培養(yǎng)1天。(SJ4671、SJ4671 riflO、SJ4490、 JA675 在 LB 瓊脂中培養(yǎng) JA677、JA678、JA688、JA689、JA690、JA684、JA687 在含有 50KAN 的 LB中培養(yǎng))。然后，瓊脂用M-9緩沖液清洗，并且在650nm(0D65(lJ下測定獲得的細(xì)胞懸浮 液的光學(xué)密度。基于0D65(tam的測定結(jié)果，每一個搖瓶中采用相同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。此處采用 的接種強(qiáng)度為ODXml細(xì)胞懸浮液=0. 1。每一菌株分別在3個搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件 為37°C、300rpm，分別培養(yǎng)1、2和3天后，收集樣品。測定pH、0D65(lnm和a -淀粉酶活性，并 且確定每一菌株的相對活性，依次計算出每一 rpoB突變菌株其親本菌株的相對活性，結(jié)果 顯示于表1。從上述結(jié)果可以清楚看出上述rpoB突變對酶的生產(chǎn)力/產(chǎn)量具有重大的效^ o表1 :rpoB突變菌株的相對淀粉酶活性(相對于親本菌株的％ ) 實施例5來源于克勞氏芽孢桿菌部分rpoB基因的DNA序列從包含有克勞氏芽孢桿菌染色體DNA片段的質(zhì)?？寺≈校捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定了克 勞氏芽孢桿菌部分rpoB基因的DNA序列。包含有克勞氏芽孢桿菌克隆的質(zhì)粒文庫來源于 保藏NCIB 10309。部分DNA序列顯示于SEQ IDN0 :3。實施例6克勞氏芽孢桿菌RpoB蛋白從SEQ ID NO :3DNA序列的開放閱讀框中翻譯的克勞氏芽孢桿菌RpoB蛋白顯示于 SEQ ID NO :4。實施例7DNA聚合酶片段比對采用BLAST搜索對SEQ ID NO :4中位置462到501處的40個克勞氏芽孢桿菌 RpoB蛋白片段與已發(fā)表的不同細(xì)菌來源的RpoB蛋白序列進(jìn)行了比對，其中上述蛋白片段在RpoB蛋白的位置上與地衣芽孢桿菌同源和等價。結(jié)果顯示于附圖1中，其中第一行為地 衣芽孢桿菌RpoB蛋白序列，上數(shù)第二行為克勞氏芽孢桿菌RpoB蛋白序列。實施例8特異rpoB突變體產(chǎn)量/生產(chǎn)力的改善材料與方法采用天然表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。株系NCIB 10309 克勞氏芽孢桿菌(產(chǎn)生其內(nèi)源蛋白，BCP)。PP143 :NCIB 10309的典型突變體，其在編碼顯示于SEQ ID NO 4中位置462到 501處的40個克勞氏芽孢桿菌RpoB蛋白氨基酸片段的DNA區(qū)域中沒有發(fā)生突變，其蛋白片 段與SEQ ID NO 2中位置461到500處顯示的地衣芽孢桿菌RpoB蛋白同源。NN49201 :PP143 的 rpoB 基因突變，導(dǎo)致 SEQ ID NO 4 中位置 462 到 501 處的 40 個克勞氏芽孢桿菌RpoB蛋白氨基酸片段發(fā)生氨基酸取代A479D。SEQ ID NO :4中的取代 A479D對應(yīng)于SEQ ID NO :2中的等價取代A478D，可從附圖1中最上端兩行的比對中清楚地 看出。培養(yǎng)基瓊脂例如B3-瓊脂等適于支持克勞氏芽孢桿菌良好生長的適當(dāng)瓊脂。蛋白胨6g/l ；肽酶4g/l ；酵母抽提物3g/l ；肉類提取物1. 5g/l ；葡萄糖 lH201g/ 1 ；使用去離子水的瓊脂20g/l，用氫氧化鈉/鹽酸調(diào)整pH到7. 35，在121°C下滅菌40分鐘。 冷卻到40-50°C后，加入經(jīng)過濾滅菌的pH為9的10% v/v的1M碳酸氫鈉和經(jīng)121°C滅菌 40分鐘的用去離子水溶解的10% w/v干脫脂牛奶的10% v/v。M-9緩沖液(使用去離子水)磷酸氫二鈉 2H20 8. 8g/l ；磷酸二氫鉀3g/l ；氯化 鈉 4g/l ；硫酸鎂 7H20 0. 2g/l。Med-F搖瓶培養(yǎng)基(于去離子水最終混勻后達(dá)到既定濃度)A部分麥芽糊精llg/1 ；酪胨6. 2g/l ；細(xì)菌用蛋白胨0. 5 ；酵母抽提物0. 5g/l ；硫 酸鎂 7H20 0. 5g/l ；氯化鈣0. lg/1 ；檸檬酸50mg/l ；痕量金屬(硫酸鋅 H20 2. 5mg/l ；硫 酸亞鐵 7H20 9. 9mg/l ；硫酸銅 5H20 1. 0mg/l ；氯化鋅 1. 0mg/l) ；Pluronic 0. lg/1 ；調(diào)整 pH為6. 7，于121°C下滅菌20分鐘。B部分:5g/l磷酸二氫鉀，28. 6g/l碳酸鈉；8. 4g/l碳酸氫鈉，用磷酸調(diào)整pH為 9. 0，該溶液經(jīng)過濾滅菌后立即使用。A部分和B部分滅菌后進(jìn)行混合。搖瓶評估菌株的步驟首先，菌株在37°C下、在瓊脂中斜面培養(yǎng)1天。然后，瓊脂用M-9緩沖液清洗，并且 在650nm(0D65CIJ下測定獲得的細(xì)胞懸浮液的光學(xué)密度?；?D65(tam的測定結(jié)果，每一個搖瓶中采用相同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。此處采用 的接種強(qiáng)度為ODXml細(xì)胞懸浮液=0. 1。每一菌株在2個搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為 37°C、300rpm，分別培養(yǎng)1、2和3天后，收集樣品。測定pH、0D65(lnm和蛋白酶活性，并且確定 每一菌株的相對活性，依次計算出每一 rpoB突變菌株其親本菌株的相對活性，結(jié)果顯示于 表2。從上述結(jié)果可以清楚看出上述rpoB突變對酶的生產(chǎn)力/產(chǎn)量具有重大的效果。
22
表2 :rpoB突變菌株的相對蛋白酶活性(相對于親本菌株的％ )
權(quán)利要求
一種分離的突變真細(xì)菌，其包含至少一個突變，上述突變導(dǎo)致了由rpoB基因編碼的RNA聚合酶β-亞基中至少一個氨基酸發(fā)生取代，在同等的生長條件下，與等基因親本株系產(chǎn)生的相同目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所述的至少一個氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID NO2中位置469、478、482、485或487中的任何位置，或者任何真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代改善了目的產(chǎn) 物的產(chǎn)量，或提供了較高的目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括 Q469R、A478D、A478V、H482R、Η482Ρ、R485H 或 S487L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括在SEQ ID NO 2中位置469或478處的任何隨機(jī)取代，或在任何真細(xì)菌RNA聚合酶β -亞基家族 成員的等價位置所發(fā)生的取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括在SEQ ID NO :2中位置469、478、和/或487處的任何隨機(jī)取代，或在任何真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞 基家族成員的等價位置所發(fā)生的取代。
6.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括 Q469R、A478D、和 / 或 S487L。
7.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個氨基酸取代包括 Q469R 或 A478D。
8.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包括了芽孢桿菌 的各個種，優(yōu)選為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) > 短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、 燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)禾口蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)。
9.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是基因產(chǎn)物或代謝 途徑的產(chǎn)物。
10.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物包括多肽、維生 素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是一種多肽，優(yōu)選是一 種酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶選自分類系統(tǒng)中的下述酶類 氧化還原酶(EC 1)、轉(zhuǎn)移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC4)、異構(gòu)酶(EC 5)或連接酶 (EC 6)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶選自具有下述活性的酶 類氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁 質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β “半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化 酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇 六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或者木聚糖 酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是碳水化合物，優(yōu)選透 明質(zhì)酸。
15.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中真細(xì)菌是重組真細(xì)菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是重組多肽。
17.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變與生 長在等同條件下的等基因親本株系正常水平相比，其產(chǎn)量至少增長5%到1000%。
18.—種在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng) 權(quán)利要求1-17中任意之一所定義的突變真細(xì)菌，由此產(chǎn)生所述目的產(chǎn)物。
19.權(quán)利要求1-17中任意之一所述的突變真細(xì)菌在生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物中的用途， 其中包括了在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，由此產(chǎn)生所述目的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有改變產(chǎn)物產(chǎn)量特性的真細(xì)菌RNA聚合酶突變體，具體地，本發(fā)明涉及一種分離的突變真細(xì)菌，其包含至少一個突變，上述突變導(dǎo)致了由rpoB基因編碼的RNA聚合酶β-亞基中至少一個氨基酸發(fā)生取代，因此在同等的生長條件下，與等基因親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所述的至少一個氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID NO2中位置469、478、482、485或487中的任意一個，或者任一真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價位置。本發(fā)明的另一方面涉及一種在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法以及本發(fā)明突變真細(xì)菌在生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物中的用途。
文檔編號C12N1/21GK101851599SQ20101015578
公開日2010年10月6日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月29日
發(fā)明者尼爾斯·班克, 斯蒂恩·T·喬根森, 普雷本·尼爾森, 詹斯·T·安德森, 金·B·佩德森 申請人:諾維信公司