一株高產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的尾孢屬內(nèi)生真菌新種及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中一株高產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的尾孢屬內(nèi)生真菌新種及其應(yīng) 用，所述次生代謝產(chǎn)物可為多糖、黃酮、三萜和總酚中的四種、三種、兩種或一種。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物的代謝產(chǎn)物可分為兩類，即初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物是 指維持植物體正常生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)和能量代謝，如脂類、氨基酸、核酸以及它們的多 聚體等，這些物質(zhì)的分子量一般很大，又稱為大分子化合物。次生代謝產(chǎn)物是由次生代謝產(chǎn) 生的一類細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長發(fā)育正常運(yùn)行的非必需的小分子有機(jī)化合物（習(xí)慣上 稱為天然產(chǎn)物），其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時(shí)期的特異性，次生代 謝產(chǎn)物可分為苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、類萜、留體及其甙、生物堿七大類。在植物的 某個(gè)發(fā)育時(shí)期或某個(gè)器官中，次生代謝產(chǎn)物可能成為代謝庫的主要成分，比如橡膠樹產(chǎn)生 大量橡膠和甜菊葉中甜菊甙的含量可達(dá)干重的10%以上。
[0003] 植物中直接或間接的提取是目前人們獲得天然產(chǎn)物的主要手段，但隨著人口的增 多市場(chǎng)需求量的增加，直接從植物中提取次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)難以滿足需求，所以發(fā)展新的 高效生產(chǎn)這些重要的次生代謝產(chǎn)物方法迫在眉睫。內(nèi)生真菌是在宿主體內(nèi)生存并完成生活 周期的真菌，長期寄生在某種植物上的內(nèi)生真菌通常能與該宿主植物協(xié)同演化，宿主植物 與其內(nèi)生真菌之間可能存在基因重組的現(xiàn)象，從而使得宿主植物上的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿 主植物相同的代謝產(chǎn)物。近年來發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物中有51 %來自植物內(nèi)生真菌，38%來自土 壤微生物，11 %來自植物和動(dòng)物，顯然內(nèi)生真菌己成為天然產(chǎn)物的重要資源。
[0004] 野生碗豆生存環(huán)境原始、復(fù)雜，種群多樣性高，其內(nèi)生真菌的豐富度及多樣性較其 它物種更為優(yōu)越。通過對(duì)野生碗豆內(nèi)生真菌的分離可得到一些較為原始及次生代謝產(chǎn)物多 樣的內(nèi)生真菌。尾孢屬（Cercospora)真菌可導(dǎo)致草坪葉斑病，常見的有4種類型：引起翦股 穎葉斑病的翦股穎尾孢菌（C. agrostidis)、引起羊茅葉斑病的羊茅尾孢菌（C. festucae)、 引起野牛草和狗牙根葉斑病的C. seminalis和引起鈍葉草葉斑病的C. fusimaculans.。也 有關(guān)于尾孢菌作為水萌蘆生防菌的應(yīng)用，但關(guān)于尾孢屬內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物分析報(bào)道甚 少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何利用微生物生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，所述次生代謝 產(chǎn)物為多糖、黃酮、總?cè)坪涂偡又械乃姆N、三種、兩種或一種。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株可以產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌，所 述次生代謝產(chǎn)物為多糖、黃酮、總?cè)坪涂偡又械乃姆N、三種、兩種或一種。
[0007] 本發(fā)明提供的內(nèi)生真菌是尾孢屬（Cercospora sp. nov. )WDL2,該菌株已于2014 年10月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱CCTCC，地址為：中國武漢武漢大學(xué)）， 保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M 2014518。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO ：M 2014518〇
[0009] 上述菌劑可為產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物多糖、黃酮、總?cè)坪涂偡又械乃姆N、三種、兩種 或一種的菌劑。
[0010] 所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可 為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白 碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一 種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、 礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培 養(yǎng)的活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的形式存在。所述 組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒 劑。
[0011] 根據(jù)需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑（如吐溫20、吐溫80等）、粘合劑、穩(wěn) 定劑（如抗氧化劑）、pH調(diào)節(jié)劑等。
[0012] 所述尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 在生產(chǎn)次生代 謝產(chǎn)物多糖、黃酮、總?cè)坪涂偡又械乃姆N、三種、兩種或一種的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0013] 所述以尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 為活性成分 的菌劑在生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物多糖、黃酮、總?cè)坪涂偡又械乃姆N、三種、兩種或一種的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)尾孢屬WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 的方法。
[0015] 本發(fā)明所提供的培養(yǎng)尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 的方法，包括將尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 在用 于培養(yǎng)尾孢菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
[0016] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種以尾孢屬WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518為活性成分的菌劑的制備方法。
[0017] 本發(fā)明所提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 作為活性成分，得到所述菌劑。
[0018] 對(duì)中國黑龍江省阿城區(qū)林場(chǎng)采集野生豌豆葉片內(nèi)生真菌的分離，可能得到一些較 為原始以及次生代謝產(chǎn)物功能多樣的內(nèi)生真菌。本發(fā)明分離篩選得到產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的 尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518。
[0019] 實(shí)驗(yàn)證明，尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 菌絲體 (干重）生長速率為〇.22g/d，其菌絲體（干重）中多糖、黃酮、總?cè)坪涂偡拥暮糠謩e為 74. 452mg/g、l. 250mg/g、4. 395mg/g和3. 343mg/g，在最適搖瓶發(fā)酵條件下發(fā)酵培養(yǎng)10天其 發(fā)酵液中黃酮、總?cè)坪涂偡拥暮糠謩e為〇. 668mg/L、0. 633mg/L和2. 124mg/L。這表明該 菌株能產(chǎn)生多糖、黃酮、總?cè)坪涂偡?，在生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物方面具有重要應(yīng)用。
[0020] 保藏說明
[0021] 菌種名稱：尾孢屬
[0022] 拉丁名：Cercospora sp. nov.
[0023] 菌株編號(hào)：WDL2
[0024] 保藏機(jī)構(gòu)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心
[0025] 保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CCTCC
[0026] 地址：中國武漢武漢大學(xué)
[0027] 保藏日期：2014年10月27日
[0028] 保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CCTCC NO :M 2014518
【附圖說明】
[0029] 圖1為生長4天的尾孢屬（Cercospora sp. nov. ) WDL2在10倍光學(xué)顯微鏡下的菌 絲形態(tài)。
[0030] 圖2為生長7天的尾孢屬（Cercospora sp. nov. )WDL2在40倍光學(xué)顯微鏡下的菌 絲形態(tài)。
[0031] 圖3為生長15天的尾孢屬（Cercospora sp. nov. )WDL2的菌落形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034] 實(shí)施例 1、尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 的分離、 鑒定與保藏
[0035] 1、內(nèi)生真菌WDL2的分離
[0036] 將野生豌豆葉片（采自中國黑龍江省阿城區(qū)亞溝林場(chǎng)）進(jìn)行消毒。將氯霉素加入 2%麥芽粉瓊脂培養(yǎng)基使其含量為50mg/L，得到麥芽粉氯霉素平板；用PDA固體培養(yǎng)基制成 PDA固體平板。將上述消毒后的野生豌豆葉片切成0.5cm 2的小塊放在麥芽粉氯霉素平板上， 25°C黑暗培養(yǎng)5天。將從野生豌豆葉片組織切口邊緣處長出的內(nèi)生真菌菌絲逐個(gè)用接種環(huán) 接至PDA固體平板上進(jìn)行菌種純化。將篩選到的其中一株內(nèi)生真菌命名為內(nèi)生真菌WDL2。
[0037] 2、內(nèi)生真菌WDL2的鑒定
[0038] 從以下幾個(gè)方面鑒定步驟一分離并純化得到的內(nèi)生真菌WDL2 :
[0039]2. 1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0040] 將處于對(duì)數(shù)生長期且菌落大小穩(wěn)定，上述步驟一分離并純化得到的內(nèi)生真菌WDL2 進(jìn)行單菌落狀態(tài)觀察，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、菌落表面狀態(tài)（是否平坦、突 起、褶皺、凹陷等）、菌落邊緣特征（是否整齊、不規(guī)則、放射狀等），產(chǎn)孢時(shí)間等。菌落外觀 形態(tài)特征采集使用佳能60D相機(jī)（18-200mm IS，日本），技術(shù)參數(shù)為：APS-C規(guī)格數(shù)碼單反； 1800萬有效像素；10倍光學(xué)變焦。
[0041] 對(duì)處于對(duì)數(shù)生長期的所述內(nèi)生真菌WDL2，經(jīng)涂片染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲 的形態(tài)，包括菌絲的表面狀態(tài)、菌絲的顯微結(jié)構(gòu)（如子座、分生孢子梗、分生孢子等）。菌落 顯微觀察使用正立生物顯微鏡Axioskop2plusFL(蔡司，德國），技術(shù)參數(shù)：消色差一消球差 多功能聚光鏡；照明系統(tǒng)為100W鹵素?zé)簦吕照彰?；五檔熒光分光器；HB050, HB0103光源。 采用Axioplan 2imaging MOT軟件進(jìn)行圖像采集與分析。
[0042] 結(jié)果表明（圖1、圖2和圖3)，上述步驟一分離并純化得到的內(nèi)生真菌WDL2具有 如下形態(tài)特征：菌落凸起，正面白色，背面黑褐色，表面光滑，邊緣有褶皺，培養(yǎng)基變成黃色， 菌落厚2-3mm，用PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)生長較為緩慢，培養(yǎng)16天菌落直徑為4厘米。顯 微結(jié)構(gòu)觀察顯示，具較大子座，子座近球形，直徑80 y m~160 y m。分生孢子梗單生或多根 密集簇生在子座上