本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真菌次級代謝產(chǎn)物及其衍生物作為幾丁質(zhì)酶的抑制劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

幾丁質(zhì)(chitin)是以n-乙酰-β-d-葡萄糖胺(glcnac)為基本單元，通過β-1,4糖苷鍵連接的天然線性直鏈多糖。作為重要的結(jié)構(gòu)組成部分，幾丁質(zhì)大量存在于真菌和硅藻的細(xì)胞壁、軟體動(dòng)物的外殼、線蟲的卵殼以及甲殼類生物和昆蟲的外骨骼中，其合成和水解的動(dòng)態(tài)平衡對于這些生物的生長發(fā)育具有極其重要的作用。來自糖基水解酶18家族的昆蟲幾丁質(zhì)酶chti(chitinasei)是昆蟲蛻皮和變態(tài)發(fā)育中不可或缺的幾丁質(zhì)水解酶。下調(diào)或干擾chti基因表達(dá)水平將導(dǎo)致昆蟲蛻皮不正常而死亡。chti在生理功能上是特異的表皮幾丁質(zhì)降解酶，功能區(qū)別于人類的同源酶，因此，將18家族幾丁質(zhì)酶作為農(nóng)藥設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)，開發(fā)高效的幾丁質(zhì)酶抑制劑對于農(nóng)業(yè)害蟲的防治具有非常重要的意義。近十年來，昆蟲chti的研究在生物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域取得了突出進(jìn)展。其中，來源于農(nóng)業(yè)害蟲亞洲玉米螟—chti(ofchti)的晶體結(jié)構(gòu)的解析取得重要進(jìn)展，為針對chti的農(nóng)用小分子理性設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)。

春雷霉素(kasugamycin)由春日鏈霉菌(streptomyceskasugaensis)所產(chǎn)生，屬氨基糖苷類抗生素。春雷霉素在亞洲和南美洲被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，對水稻稻瘟病(包括葉瘟、稻頭瘟、谷瘟)等的防治尤為顯著，一般可達(dá)到80％以上。不僅如此，春雷霉素的適用作物還包括馬鈴薯、黃瓜、芹菜、高粱、辣椒、菜豆、柑橘等，可防治甜菜上的甜菜生尾孢、馬鈴薯上的胡蘿卜軟鷗文氏菌、菜豆上的棲菜豆假單孢菌、黃瓜上的流淚假單孢菌、番茄葉霉病、黃瓜細(xì)菌性角斑病等。另外因春雷霉素對人畜無毒、無殘留、無污染，符合現(xiàn)代環(huán)保要求，被中國綠色食品發(fā)展中心推薦為aa級綠色食品生產(chǎn)資料，被農(nóng)業(yè)部列為無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)推薦農(nóng)藥，被上海市列為蔬菜標(biāo)準(zhǔn)化工程首推殺菌劑。以其為基礎(chǔ)開發(fā)新的藥學(xué)用途可以大大節(jié)約研發(fā)周期和成本,“老藥新用”被認(rèn)為是新藥開發(fā)中最快捷、最有效的策略之一。春雷霉素及其衍生物針對18家族糖基水解酶的生物活性還沒有報(bào)導(dǎo)，因此，研究春雷霉素作為18家族糖基水解酶抑制劑對于擴(kuò)展其應(yīng)用有非常積極的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在防治農(nóng)業(yè)害蟲的研究中，為了找到高效的18家族糖基水解酶抑制劑，本發(fā)明篩選了大量的化合物，通過抑制效果、選擇性和殺蟲活性評價(jià)對化合物的抑制活性進(jìn)行了抑制效果評價(jià)研究，最終篩選到了春雷霉素及其衍生物。

首先，本發(fā)明公開春雷霉素及其衍生物作為幾丁質(zhì)酶抑制劑的應(yīng)用，其結(jié)構(gòu)通式如i所示，即春雷霉素及其衍生物。

r1基團(tuán)選自以下取代基：

r2基團(tuán)選自以下取代基：

本發(fā)明還公開結(jié)構(gòu)通式如i所示的抑制劑和/或其衍生物在抑制18家族幾丁質(zhì)酶活性中的應(yīng)用。具體的，所述抑制劑和/或其衍生物在抑制18家族幾丁質(zhì)酶活性中使用的終濃度為50μm。

本發(fā)明還公開所述的抑制劑在防治農(nóng)業(yè)害蟲方面的應(yīng)用。

具體的所述的農(nóng)業(yè)害蟲是鱗翅目昆蟲，包括麥蛾、棉紅鈴蟲、馬鈴薯塊莖蛾、甘薯麥蛾、棉褐帶卷蛾、大豆食心蟲、梨大食心蟲、亞洲玉米螟、大造橋蟲、菜粉蝶、棉鈴蟲、舞毒蛾、玉帶風(fēng)蝶、金鳳蝶、舟形毛蟲、黃腹燈蛾、紅腹燈蛾、美國白蛾、葡萄天蛾和稻苞蟲等。

本發(fā)明提供了評價(jià)結(jié)構(gòu)通式如i所示的化合物(kasugamycin)抑制活性所獲得的數(shù)據(jù)，包括抑制劑篩選、ic50值測定和選擇性測定所獲得的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在篩選的所有556個(gè)微生物次級代謝產(chǎn)物中，化合物kasugamycin(終濃度50μm)對幾丁質(zhì)酶ofchti的抑制率為86.4％，ic50值為14μm。對化合物的適用對象測定表明，在50μm終濃度下，化合物kasugamycin對幾丁質(zhì)酶ofchti表現(xiàn)出較高的抑制活性，對于其他來源的幾丁質(zhì)酶(除了粘質(zhì)沙雷氏菌來源的smchib、smchic之外)也同樣表現(xiàn)出一定的抑制活性。綜上，化合物kasugamycin針對不同物種來源的幾丁質(zhì)酶均能表現(xiàn)出抑制活性，同時(shí)根據(jù)ic50值可以推斷，當(dāng)化合物kasugamycin的濃度≥20μm時(shí)，對幾丁質(zhì)酶ofchti有較強(qiáng)抑制活性。

本發(fā)明化合物殺蟲活性的方法為：用h2o作為溶劑溶解化合物，采用注射方式直接將化合物導(dǎo)入研究對象體內(nèi)。經(jīng)過研究化合物kasugamycin在50μm濃度下對亞洲玉米螟的殺蟲活性可以發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，實(shí)驗(yàn)組幼蟲的發(fā)育被延緩。

由本發(fā)明實(shí)施例3的體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，春雷霉素及其衍生物在防治農(nóng)業(yè)害蟲方面有良好的應(yīng)用前景。尤其是在延緩亞洲玉米螟發(fā)育方面有較好的效果；優(yōu)選情況下，所述的農(nóng)業(yè)害蟲是鱗翅目昆蟲。具體的，所述的鱗翅目昆蟲為麥蛾、棉紅鈴蟲、馬鈴薯塊莖蛾、甘薯麥蛾、棉褐帶卷蛾、大豆食心蟲、梨大食心蟲、亞洲玉米螟、大造橋蟲、菜粉蝶、棉鈴蟲、舞毒蛾、玉帶風(fēng)蝶、金鳳蝶、舟形毛蟲、黃腹燈蛾、紅腹燈蛾、美國白蛾、葡萄天蛾或稻苞蟲。

附圖說明

圖1為化合物kasugamycin對ofchti的ic50值測定示意圖。其中橫坐標(biāo)log[kasugamycinconc(μm)]表示以10為底的化合物濃度對數(shù)值，濃度單位為μm；縱坐標(biāo)inhibitionrate表示抑制率；圖中曲線對應(yīng)不同的底物濃度下，inhibitionrate隨化合物濃度的變化而變化的趨勢，曲線上縱坐標(biāo)為0.5的點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)數(shù)值即為化合物對ofchti的半數(shù)抑制濃度ic50值，為14μm。

圖2是50μm終濃度下化合物kansugamycin對不同物種來源的18家族幾丁質(zhì)酶(gh18)的抑制活性示意圖。圖中橫坐標(biāo)表示抑制活性，縱坐標(biāo)表示不同來源的幾丁質(zhì)酶。

圖3為50μm化合物kasugamycin對亞洲玉米螟的殺蟲活性示意圖，其中a為對照組，b為實(shí)驗(yàn)組。a、b圖橫坐標(biāo)表示統(tǒng)計(jì)時(shí)間，縱坐標(biāo)表示相應(yīng)表型的亞洲玉米螟所占的百分比；■代表正常幼蟲，▲代表死亡幼蟲，●代表正常蛹，◆代表不正常蛹。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行等同替換或改變均屬于本發(fā)明保護(hù)范疇。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的酶ofchti如下述參考文獻(xiàn)給出：leichen,t.l.,yongzhou,qichen,xushenandqingyang,structuralcharacteristicsofaninsectgroupichitinase,anenzymeindispensabletomoulting.actacrystallographicasectiondbiologicalcrystallography2013,issn,1399-0047.

實(shí)施例1

將幾丁質(zhì)酶ofchti作為靶標(biāo)，對556個(gè)微生物次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑制劑篩選。具體步驟如下：

正對照：設(shè)置2組平行正對照。在30℃反應(yīng)溫度，100μl反應(yīng)體系的條件下，2nmol/l糖基水解酶ofchti和50μmol/l底物(mu-(glcnac)2)在20mmol/l的ph6.0的磷酸鹽緩沖液中孵育30min，之后加入100μl0.5mol/l碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)液用360nm波長的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)后測定450nm波長下的吸光度值。

實(shí)驗(yàn)組：設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)組。在30℃反應(yīng)溫度，100μl反應(yīng)體系的條件下，2nmol/l糖基水解酶ofchti和50μmol/l底物(mu-(glcnac)2)以及50μm化合物在20mmol/l的ph6.0的磷酸鹽緩沖液中孵育30min，之后加入100μl0.5mol/l碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)液用360nm波長的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)后測定450nm波長下的吸光度值。

根據(jù)以下公式計(jì)算抑制活性

抑制百分?jǐn)?shù)＝(正對照-實(shí)驗(yàn)組)/正對照*100

篩選來源的微生物次級代謝產(chǎn)物經(jīng)由各類真菌發(fā)酵產(chǎn)生，數(shù)目較大(556個(gè))，種類豐富，結(jié)構(gòu)差異明顯，主要有抗生素、激素、生物堿、各類毒素及維生素等，其中化合物kasugamycin屬于氨基糖苷類化合物。對抑制劑進(jìn)行篩選時(shí)，先進(jìn)行長時(shí)間的初篩，在初篩的基礎(chǔ)上對初篩獲得的陽性結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)篩(具體步驟同上)確認(rèn)后獲得最終數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，化合物kasugamycin對ofchti具有抑制效果，在50μm終濃度下對ofchti抑制率分別為86.4％。

實(shí)施例2

1)半數(shù)抑制濃度ic50測定

ofchti：mu-(glcnac)2作為底物，底物濃度為30μm。在相同底物濃度下取終濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μm八組化合物濃度梯度進(jìn)行抑制活性測定。反應(yīng)體系為100μl，緩沖環(huán)境為20mm磷酸鹽緩沖液，ph6.0，酶終濃度為2nm，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間30min，之后加入100μl濃度為0.5m的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，釋放的mu經(jīng)由360nm激發(fā)光激發(fā)后于450nm波長下測定其吸光度值。數(shù)據(jù)擬合后得ic50＝14μm，結(jié)果如圖2所示。

2)化合物的適用對象測定

gh18：選擇7個(gè)不同物種來源的18家族幾丁質(zhì)酶對化合物kasugamycin的抑制活性進(jìn)行評價(jià)，6個(gè)幾丁質(zhì)酶分別為來源于亞洲玉米螟的ofchti，來源于人的殼三糖酶hschit1，來源于煙曲霉的afchib1以及來源于粘質(zhì)沙雷氏菌的smchia、smchib和smchic。反應(yīng)設(shè)置2組平行對照組和3組平行實(shí)驗(yàn)組。mu-(glcnac)2作為底物，終濃度為30μm，化合物kasugamycin終濃度為50μm。反應(yīng)體系為100μl，緩沖環(huán)境為20mm磷酸鹽緩沖液，ph6.0，各幾丁質(zhì)酶終濃度為2nm，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間30min，之后加入100μl濃度為0.5m的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，釋放的mu經(jīng)由360nm激發(fā)光激發(fā)后于450nm波長下測定其吸光度值。根據(jù)實(shí)施例1中公式計(jì)算抑制活性。

實(shí)施例3

化合物kasugamycin的殺蟲活性評價(jià)具體步驟如下：

實(shí)驗(yàn)選取五齡第四天的健康幼蟲作為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組?；衔飇asugamycin用h2o溶解，濃度為500μm。對照組幼蟲注射2μl的h2o，實(shí)驗(yàn)組幼蟲注射2μl濃度為500μm的化合物kasugamycin。注射后的幼蟲于26℃，相對濕度70％-90％，每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)至全部化蛹為止，期間每天對正常幼蟲、死亡幼蟲、正常蛹和不正常蛹的數(shù)量和表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制成圖3，其中a為對照組，b為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組幼蟲的發(fā)育被延緩。