本發(fā)明涉及基因組文庫構(gòu)建領(lǐng)域，尤其涉及一種海洋放線菌基因組文庫及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

放線菌是生物活性物質(zhì)、尤其是天然藥物的重要來源。面對日益嚴重的病原微生物耐藥性，以及天然藥物篩選過程中大量的重復發(fā)現(xiàn)，如何采用新技術(shù)、新資源、新模型篩選發(fā)現(xiàn)新的活性次生代謝產(chǎn)物，已成為天然藥物開發(fā)中亟待研究的重要課題。而海洋放線菌因其在海洋特殊環(huán)境(高鹽、高壓、 低溫、 低氧、 低光照和寡營養(yǎng))的選擇壓力下可能調(diào)整其次級代謝過程，從而產(chǎn)生并積累具有特殊化學結(jié)構(gòu)和生物活性的功能物質(zhì)。有學者曾認為海洋環(huán)境分離到的放線菌也存在于陸地環(huán)境中或來源于陸地，因此海洋放線菌的次生代謝產(chǎn)物的新穎性受到懷疑。2006年發(fā)現(xiàn)的鹽孢菌屬(Salinispora)是第一個海洋專一性的放線菌屬，對海洋放線菌的研究具有里程碑式的意義。海洋放線菌S. arenicola CNS-205屬于小單孢菌科中的一種。2006年，F(xiàn)enical小組從菌株S. arenicola CNS-205的發(fā)酵液中得到一系列新穎的天然產(chǎn)物，如兩個聚酮類化合物saliniketal A和 saliniketal B。正是由于這種放線菌能夠產(chǎn)生具有化學和生物多樣性的天然產(chǎn)物，2008年，S. arenicola CNS-205的基因組得到了測序。令人驚訝的是這個放線菌的基因組含有至少20種不同天然產(chǎn)物的基因簇。如何表達這些潛在的天然產(chǎn)物的基因簇一直是科學界一個很重要的研究方向。異體表達這些基因簇可以成為解決這個問題的一個方法之一。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種海洋放線菌基因組文庫及其構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)異體表達菌株S. arenicola CNS-205中天然產(chǎn)物的基因簇尚缺乏的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，包括：

步驟A、提取海洋放線菌S.arenicola CNS-205的DNA；

步驟B、采用注射器的針頭隨機剪切提取的DNA；

步驟C、采用末端修復酶修復經(jīng)隨機剪切后的DNA，然后與載體連接；

步驟D、采用包裝蛋白包裝成噬菌體后侵染宿主細胞，得到海洋放線菌S.arenicola CNS-205的基因組文庫。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，所述步驟B具體包括：采用注射器的針頭隨機剪切提取的DNA，直至剪切后的DNA片段集中到25～45kb之間。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，剪切后的DNA片段集中到40kb。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，所述步驟C中，所述末端修復酶為T 4 DNA聚合酶或T 4多聚核苷酸激酶。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，所述步驟C中，所述載體為pWEB^TM載體。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，所述pWEB^TM載體為去磷酸化的pWEB^TM載體。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，所述步驟D中，所述包裝的條件為28℃水浴120min。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，所述步驟D之后還包括：

步驟E、對基因組文庫的質(zhì)量進行鑒定。

所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，步驟E中，鑒定內(nèi)容包括：插入片段的大小、克隆數(shù)的多少及覆蓋基因組 DNA 的程度。

一種海洋放線菌的基因組文庫，其中，所述基因組文庫采用如上任一所述的方法構(gòu)建而成。

有益效果：本發(fā)明旨在以稀有海洋放線菌菌株S. arenicola CNS-205作為研究對象，構(gòu)建該菌株的基因組文庫，以便于下一步異體表達菌株S. arenicola CNS-205中具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物生物合成有關(guān)的基因簇， 以及對些基因簇的基因功能進行分析，從而將代謝工程或組合生物合成方法應用于化合物結(jié)構(gòu)的改造，為海洋放線菌新藥物開發(fā)研究工作奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中提取的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。

圖2為本發(fā)明實施例中質(zhì)粒DNA酶切后的電泳檢測圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種海洋放線菌基因組文庫及其構(gòu)建方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明的一種海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法，其中，包括：

步驟A、提取海洋放線菌S.arenicola CNS-205的DNA；

步驟B、采用注射器的針頭隨機剪切提取的DNA；

所述步驟B具體包括：采用注射器的針頭隨機剪切提取的DNA，直至剪切后的DNA片段集中到25～45kb之間。優(yōu)選地，剪切后的DNA片段集中到40kb。

本發(fā)明用注射器的針頭隨機剪切基因組 DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組 DNA，直至 10%或者更多的基因組 DNA 片段集中在25～45kb之間，優(yōu)選DNA片段集中到40kb，如果片段太小則重新提取總 DNA。

本發(fā)明大片段 DNA對于基因組文庫的構(gòu)建至關(guān)重要，在分離過程中應保證 DNA不被過度剪切或降解，同時保證DNA的純度。不同的載體對基因組 DNA長度的要求不同，對于pWEB^TM載體，基因組DNA合適的片段長度大約為40kb，需要將基因組DNA采用物理方法反復抽打來隨機剪切 DNA。

步驟C、采用末端修復酶修復經(jīng)隨機剪切后的DNA，然后與載體連接；

本發(fā)明所述末端修復酶為T 4 DNA聚合酶或T 4多聚核苷酸激酶。

所述步驟C中，所述載體為pWEB^TM載體，所述pWEB^TM載體為去磷酸化的pWEB^TM載體。

本發(fā)明經(jīng)隨機剪切后的基因組 DNA用末端修復酶修復，可以提高 DNA連接入載體的效率，本發(fā)明優(yōu)選T 4 DNA聚合酶和 T 4多聚核苷酸激酶末端修飾，與去磷酸化的線性pWEB^TM載體連接，較大的提高了連接效率。

步驟D、采用包裝蛋白包裝成噬菌體后侵染宿主細胞，得到海洋放線菌S.arenicola CNS-205的基因組文庫。

所述步驟D中，所述包裝的條件為28℃水浴120min。本發(fā)明對包裝的條件進行了優(yōu)化，由原來的30℃水浴90min調(diào)整為28℃水浴120min，在相對低的溫度下適當延長了包裝的時間，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后，包裝的效率明顯增加，文庫的滴度由原來的6.5×10⁴CFU/mL變?yōu)楝F(xiàn)在的8.1×10⁴CFU/mL，使文庫的覆蓋率明顯提升，文庫質(zhì)量明顯提高。

本發(fā)明所述步驟D之后還包括：

步驟E、對基因組文庫的質(zhì)量進行鑒定。鑒定內(nèi)容包括：插入片段的大小、克隆數(shù)的多少及覆蓋基因組DNA的程度等。對于不同的用途，對基因組文庫的要求也有所不同。用來大規(guī)模測序則插入片段越長越好，用來克隆基因和測序則對基因組文庫覆蓋率要求較高。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：

1）、本發(fā)明對提取的DNA，即對插入序列的隨機剪切的方法進行了改進，現(xiàn)有方法是用200μL的黃色槍頭反復吸吹2000次，才能將總DNA片段打碎，將片段集中到25～45kb之間。而本發(fā)明是采用一次性注射器的針頭對總DNA（即提取的DNA）進行片段打碎，發(fā)現(xiàn)吸吹50次即可達到之前的效果，大大節(jié)省了工作量，而且采用這種打斷方法最后檢測發(fā)現(xiàn)插入載體的平均片段長度明顯增加，由原來的36kb增加為現(xiàn)在的38kb。該文庫是基因簇的克隆，所以插入片段越長越好。

2）、在用包裝蛋白進行噬菌體包裝時，本發(fā)明對包裝的條件進行了優(yōu)化，由原來的30℃水浴90min調(diào)整為28℃水浴120min，在相對低的溫度下適當延長了包裝的時間，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后，包裝的效率明顯增加，文庫的滴度由原來的6.5×10⁴CFU/mL變?yōu)楝F(xiàn)在的8.1×10⁴CFU/mL，使文庫的覆蓋率明顯提升，文庫質(zhì)量明顯提高。

本發(fā)明采用隨機機械剪切而不采用內(nèi)切酶不完全酶切構(gòu)建了無偏見性的基因組文庫，容量達到8.1×10⁴CFU/mL，平均插入片段大小約38kb，比現(xiàn)有插入片段要大，獲得了3000個克隆，文庫覆蓋倍數(shù)約為5，重組率100%， 該基因組文庫為生物合成基因簇的克隆和大腸桿菌的異體表達奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的一種海洋放線菌的基因組文庫，其中，所述基因組文庫采用如上任一所述的海洋放線菌基因組文庫的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。

下面通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例1

1、材料及試劑

材料：海洋放線菌S. arenicola CNS-205為作者實驗室保存；

試劑：Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白酶K、溶菌酶均購自Sigma公司；pWEB^TM Cosmid Cloning Kit 購自 Epicentre公司；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

2、主要儀器

低溫超速離心機5415R(Eppendorf公司)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱PYX－150H －B(科力儀器)；恒溫循環(huán)器HX－2015(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床ZHWY－211B(上海智城分析儀器制造有限公司)；凝膠成像分析儀(BIO－RAD公司Gel Documentation 2000)；ND－2000微量紫外分光光度計(北京托摩根生物科技有限公司)；Powerpac Basic電泳儀(BIO－RAD)。

3、培養(yǎng)基

海洋放線菌普遍培養(yǎng)基(L^-1)：蛋白胨5g、酵母提取物1g、NaCl 19. 45g、MgCl₂ 5. 9g、Na₂SO₄ 3. 24g、CaCl₂ 1.8g、微量元素溶液100mL、pH 7. 6。

微量元素溶液(L^-1)：KCl 5. 5g、Na₂CO₃ 1. 6g、KBr 0. 8g、SrCl₂ 340mg、H₃BO₃ 220mg、硅酸鈉40mg、NaF 24mg、NH₄NO₃ 16mg、Na₂HPO₄ 80mg、檸檬酸鐵1g。

4、方法

4.1、海洋放線菌S. arenicola CNS-205 DNA的提取和純化

根據(jù)海洋放線菌的特性，取海洋放線菌的200μL菌液接種在20mL的海洋放線菌普遍培養(yǎng)基中，加入10g左右滅菌的玻璃珠，30℃、220r/min搖床培養(yǎng)5.5d；12000r/min離心10min，收集菌絲體。取約100μL菌絲體， 加入1mL TE(pH8. 0)緩沖液洗滌菌絲體，12000r/min離心1min，去掉上清。加入500μL溶菌酶，37℃水浴1h。加入10μL蛋白酶K，55℃水浴1h。加入500μL 2%的SDS，將溶液分裝到4管，各管添加TE至1mL。每管加入 200μL中性苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1，以體積份計)，充分混勻，直至溶液變?yōu)槿榘咨?2000r/min離心5min，小心吸取上清，加入200μL氯仿，充分混勻，12000r/min離心5min，小心吸取上清加到滅菌的玻璃管中，加入0.1倍體積的NaCl(5mol/L)和等體積的異丙醇，顛倒混勻，直至出現(xiàn)白色絮狀物，用槍頭將挑出的絮狀物在70%乙醇中浸泡5min，空氣中自然風干，在500μL TE緩沖液中4℃過夜溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2、插入序列的隨機剪切

用注射器的針頭隨機剪切海洋放線菌S. arenicola CNS-205的 DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，直至10%或者更多的DNA片段集中在40kb附近，如果片段太小則重新提取總DNA。

4.3、切割片段與載體的連接及包裝

按Epicentre公司pWEB^TM 粘粒克隆試劑盒文庫構(gòu)建試劑盒說明書進行。取約20μg DNA片段，加入1μL 10×快速連接緩沖液、 1μL 10mmol/L ATP、1μL pWEB^TM 載體、1μL 快速連接DNA酶、5. 16μL滅菌ddH₂O，充分混勻，室溫放置90min，70℃水浴10min。－20℃保存?zhèn)溆?。?0μL酶連反應液中加入25μL噬菌體包裝提取物，混勻，28℃水浴120min，加入噬菌體稀釋緩沖液將反應液稀釋至1mL，輕輕混勻，加入25μL氯仿，輕輕混勻，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.4、文庫效價的測定

用噬菌體稀釋緩沖液對包裝的噬菌體顆粒做10^-1、10^-2、10^-3、10^-4系列梯度稀釋。分別取10μL包裝的噬菌體顆粒加入100μL E. coli EPI100菌液，充分混勻，37℃保溫20min，將感染細胞涂布在含氨芐的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。單菌落計數(shù)，計算效價，公式如下:CFU/mL = (克隆數(shù))(稀釋倍數(shù))(1 000μL/mL) /(用于涂布噬菌體的體積)。

4.5、轉(zhuǎn)化和文庫的保存

基于對效價的測定以及對文庫克隆數(shù)的估算，計算構(gòu)建pWEB^TM粘粒文庫所需粘?？寺〉捏w積。按4.4所述方法進行轉(zhuǎn)化獲得陽性克隆子。挑取單菌落，放入加有含氨芐的LB培養(yǎng)基的96孔板過夜培養(yǎng)，加入甘油至最終濃度為20%，－70℃長期保存。

4.6、文庫質(zhì)量的檢測

隨機挑取單菌落培養(yǎng)用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，對提取的質(zhì)粒 DNA分別做Bam HⅠ酶切:質(zhì)粒DNA 15～20μL，50μL酶切體系，Bam HⅠ 1μL，酶切混合體系于30℃反應過夜，電泳檢測。

5、結(jié)果與分析

5.1、海洋放線菌S. arenicola CNS-205的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1。DNA片段較大，都集中在48kb以上，拖尾現(xiàn)象不明顯，DNA片段整齊度較高。DNA純度分析結(jié)果顯示:OD 260/OD 280 = 1. 96，A 260 /A 230=2.18，表明提取的DNA純度較高，沒有被蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。因此，所提取的總DNA達到了構(gòu)建基因組文庫的要求。

5.2、插入序列的隨機剪切

對提取的總DNA用一次性注射器的針頭隨機剪切，剪切到50次時，片段都集中到了25～45kb之間。結(jié)果如圖1。M.Lambda Mixer marker；1-3為S. arenicola CNS-205的基因組DNA分別被剪切50、30和20次。

5.3、文庫效價的測定

用 Phage Dilution Buffer 對 packaged phage particles 做10^-1、10^-2、10^-3、10^-4系列梯度稀釋。發(fā)現(xiàn)用稀釋10倍的噬菌體包裝原液進行侵染轉(zhuǎn)化后的平板上有81個單菌落，通過如下計算，能推測此文庫的滴度為8.1×10⁴ CFU/mL。

5.4、文庫質(zhì)量的檢測

隨機挑取單菌落，提取質(zhì)粒DNA，用B a mHⅠ酶切，電泳檢測。結(jié)果見圖2。平均插入片段約為38kb，且每個質(zhì)粒均釋放了一條大小為8.1kb的條帶，這個條帶的大小和文庫質(zhì)粒載體的大小吻合。每個質(zhì)粒經(jīng)過酶切后所釋放的外源片段大小各不相同，代表這些質(zhì)粒都是不同的, 說明這個基因組文庫基因多樣性較好。并未發(fā)現(xiàn)空載現(xiàn)象，文庫的重組率接近100%，說明文庫質(zhì)量較高。

應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。