一種斑馬魚代謝物的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境毒理與生物醫(yī)學(xué)，特別是一種斑馬魚代謝物的提取方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 代謝物分析是一種重要的生物體征和毒理指標(biāo)的分析方法，通過對生物體內(nèi)代謝 物進(jìn)行定性或定量的分析可以在生物體內(nèi)發(fā)生的一系列變化以及發(fā)生變化的節(jié)點(diǎn)，有助于 生物毒性的判斷以及環(huán)境污染等情況的分析。
[0003] 本發(fā)明所使用的受試生物為斑馬魚。斑馬魚具有體型小、易于養(yǎng)殖繁殖以及成本 低等優(yōu)點(diǎn)，在生態(tài)毒理等領(lǐng)域的使用十分廣泛。且斑馬魚在遺傳、生理和藥理反應(yīng)方面與人 類存在高度的相似性，因此可作為良好的模式動(dòng)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)分析，提供一種斑馬魚代謝物的提取方法及其應(yīng) 用，該提取方法工藝簡單、易于實(shí)施，用于納米材料對斑馬魚低濃度暴露的毒性實(shí)驗(yàn)，相對 于其他的毒性檢測方法更靈敏和簡便的得到更多可用的數(shù)據(jù)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0006] -種斑馬魚代謝物的提取方法，步驟如下：
[0007] 1)將斑馬魚樣品用生理鹽水沖洗干凈后準(zhǔn)確稱重，然后迅速浸沒于液氮中保存?zhèn)?用；
[0008] 2)將上述斑馬魚樣品置于盛有液氮的研缽中在_80°C溫度下研磨5分鐘至斑馬魚 組織變成勻質(zhì)漿體；
[0009] 3)將上述漿體狀斑馬魚樣品加入-20°c預(yù)冷的提取液中，在40°C溫度下微波萃取 30分鐘，微波萃取功率為（樣品罐數(shù)+2) X 100W，離心后收集第一次上清液，然后在固體殘 留物中再加入相同量的上述_20°C的提取液，繼續(xù)在40°C溫度下微波萃取30分鐘，離心后 收集第二次上清液；
[0010] 4)將第一次上清液與第二次上清液混合，在混合液中加入滅菌去離子水，4000rpm 下離心5分鐘，靜置5分鐘后溶液分層，上層溶液是甲醇/水相，下層溶液為氯仿相，兩相分 離后將氯仿相用氮?dú)獯蹈?，然后將甲?水相轉(zhuǎn)移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液；
[0011] 5)將上述混合溶液放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)以-30°C - -50°C真空干燥后，采用兩步法 進(jìn)行衍生化：首先加入濃度為20mg/mL的甲氧氨基鹽酸鹽-吡啶溶液，密封后渦旋1分鐘， 后將其在3000rpm下離心1分鐘，再在30°C下溫浴90分鐘，然后加入硅烷化試劑N-甲 基-N-(三甲基硅烷）-三氟乙酰胺（MSTFA)，37°C下溫浴30分鐘，得到斑馬魚代謝物衍生化 樣品并轉(zhuǎn)移到適合GC-MS分析的內(nèi)襯管中保存。
[0012] 所述步驟3)提取液為甲醇、氯仿與水的混合液，混合液中甲醇、氯仿與水的 體積比為2. 5:1:1，其中甲醇、氯仿與水均為色譜純；斑馬魚樣品與提取液的用量比為 0? 3-0. 5g:15mL〇
[0013] 所述步驟4)中斑馬魚樣品與滅菌去離子水的用量比為0. 3-0. 5g :500 y L。
[0014] 所述步驟5)中斑馬魚樣品與甲氧氨基鹽酸鹽-吡啶溶液的用量比為0. 3-0. 5g: 50 y L，斑馬魚樣品與硅烷化試劑的用量比為0. 3-0. 5g :80 y L。
[0015] 一種所述斑馬魚代謝物的提取方法的應(yīng)用，用于斑馬魚納米毒性檢測。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該斑馬魚代謝物的提取和分析方法簡單、準(zhǔn)確，易于實(shí)施，用于 斑馬魚暴露于低濃度納米材料實(shí)驗(yàn)，可使斑馬魚毒性檢測的靈敏性提高。
【附圖說明】
[0017] 圖1是同一批次染毒的斑馬魚成魚的總超氧化物歧化酶活性對比圖。
[0018] 圖2是同一批次染毒的斑馬魚成魚的丙二醛含量對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 :
[0020] 一種斑馬魚代謝物的提取方法，步驟如下：
[0021] 1)將斑馬魚樣品用生理鹽水沖洗干凈后準(zhǔn)確稱重，然后迅速浸沒于液氮中保存?zhèn)?用；
[0022] 2)將上述斑馬魚樣品置于盛有液氮的研缽中在_80°C溫度下研磨5分鐘至斑馬魚 組織變成勻質(zhì)漿體；
[0023] 3)將上述漿體狀斑馬魚樣品加入-20°C預(yù)冷的提取液中，提取液提取液為甲醇、 氯仿與水的混合液，混合液中甲醇、氯仿與水的體積比為2. 5:1: 1，其中甲醇、氯仿與水均為 色譜純，斑馬魚樣品與提取液的用量比為0. 3g :15mL，在40°C溫度下微波萃取30分鐘，微波 萃取功率為（樣品罐數(shù)+2) X 100W，離心后收集第一次上清液，然后在固體殘留物中再加入 相同量的上述-20°C的提取混合液，繼續(xù)在40°C溫度下微波萃取30分鐘，離心后收集第二 次上清液；
[0024] 4)將第一次上清液與第二次上清液混合，在混合液中加入滅菌去離子水，斑馬魚 樣品與滅菌去離子水的用量比為0. 3g :500 y L，4000rpm下離心5分鐘，靜置5分鐘后溶液 分層，上層溶液是甲醇/水相，下層溶液為氯仿相，兩相分離后將氯仿相用氮?dú)獯蹈?，然?將甲醇/水相轉(zhuǎn)移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液；
[0025] 5)將上述混合溶液放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)以-30°C - -50°C真空干燥后，采用兩步法 進(jìn)行衍生化：首先加入濃度為20mg/mL的甲氧氨基鹽酸鹽-吡啶溶液，斑馬魚樣品與甲氧氨 基鹽酸鹽-吡啶溶液的用量比為0. 3g :50 y L，密封后渦旋1分鐘，后將其在3000rpm下離 心1分鐘，再在30°C下溫浴90分鐘，然后加入硅烷化試劑N-甲基-N-(三甲基硅烷）-三氟 乙酰胺（MSTFA)，斑馬魚樣品與硅烷化試劑的用量比為0. 3g :80 y L，37°C下溫浴30分鐘，得 到斑馬魚代謝物衍生化樣品并轉(zhuǎn)移到適合GC-MS分析的內(nèi)襯管中保存。
[0026] 以上斑馬魚樣品設(shè)為第一組樣品。
[0027] 對比實(shí)驗(yàn)：
[0028] 1)第二組樣品
[0029]該組斑馬魚代謝物的提取方法，步驟與第一組樣品基本相同，不同之處在于：將步 驟3)中的微波萃取改變?yōu)槌曒腿?，超聲功率?00W。
[0030] 2)第三組樣品
[0031] 該組斑馬魚代謝物的提取方法，步驟與第一組樣品基本相同，不同之處在于：將步 驟3)中的提取混合液改變?yōu)樯V純乙醇。
[0032] 3)第四組樣品
[0033] 該組斑馬魚代謝物的提取方法，步驟與第一組樣品基本相同，不同之處在于：
[0034] 將步驟3)中的提取混合液改變?yōu)樯V純乙醇，同時(shí)微波萃取改變?yōu)槌曒腿?，?聲功率為100W。
[0035] 以上四組樣品的分析：
[0036] 分析儀器為安捷倫氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜。參數(shù)設(shè)置如下：
[0037] 氣相色譜進(jìn)樣參數(shù)為：采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 UL，進(jìn)樣口溫度230°C、斑 馬魚成魚分流進(jìn)樣比例為1:10,幼魚不分流、載氣為氦氣，流速2mL/min。
[0038] 氣相色譜參數(shù)為：MDN-35毛