專利名稱：一種啟動(dòng)子SiUbi1、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種啟動(dòng)子，特別是一種植物例如谷子的啟動(dòng)子，以及所述啟動(dòng)子的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、 結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn)基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。目前廣泛應(yīng)用的一種組成型啟動(dòng)子為CaMV35S，它在單子葉植物和雙子葉植物中都產(chǎn)生較高效率的表達(dá)，但Ajith Anand等將水稻幾丁質(zhì)酶基因chitinase轉(zhuǎn)入小麥，發(fā)現(xiàn)使用CaMV35S作為啟動(dòng)子時(shí)，轉(zhuǎn)入的植株到第二代時(shí)chitinase全部表現(xiàn)出基因沉默，而使用玉米泛素WDiquitin啟動(dòng)子，在第四代時(shí)，該基因的表達(dá)量仍然較大(AjithAnand等， Plant Biotechnology Journal,2003(1) :241-251)。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如泛素(WDiquitin)和肌動(dòng)蛋白 (Actin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有效地在植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。泛素⑴biquitin，Ubi)啟動(dòng)子廣泛存在于真核生物中，在增強(qiáng)基因表達(dá)的長(zhǎng)期性，穩(wěn)定性等方面有顯著功效，并且以啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞(謝偉，樂(lè)超銀.三峽大學(xué)學(xué)報(bào)，2007, ) :176-179) 0目前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的W^i-I啟動(dòng)子、水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素WdBI啟動(dòng)子、煙草泛素Ubi. U4啟動(dòng)子、馬鈴薯泛素啟動(dòng)子、番茄泛素W^il-I啟動(dòng)子、大麥泛素Mubl啟動(dòng)子等等。其中，玉米泛素W^i-I啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。Ubi啟動(dòng)子能夠有效促進(jìn)外源基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定高效表達(dá)，現(xiàn)在已經(jīng)有很多的Ubi 啟動(dòng)子在單子葉植物和雙子葉植物中得到應(yīng)用。并且W^i啟動(dòng)子跟源于T-DNA的n0S、0CS、 mas和源于病毒的CaMV35S、CsVMV等啟動(dòng)子相比，具有更高水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。郭殿京等(遺傳學(xué)報(bào)，1999, ) :168-173)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小麥愈傷組織中，W^i啟動(dòng)子的效率最高，是 CaMV 35S 啟動(dòng)子的 4-5 倍。Genschik 等(Gene, 1994，148 195-202)將分離得到煙草泛素基因Ubi. U4的啟動(dòng)子序列導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因煙草中啟動(dòng)GUS表達(dá)，結(jié)果表明Ubi. U4啟動(dòng)子啟動(dòng)⑶S基因的表達(dá)量是CaMV35S的7倍。
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隨著植物基因工程的發(fā)展，人們不再滿足把特定的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物，而是要外源基因特定而高效的表達(dá)。外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想轉(zhuǎn)基因植物的重要原因，而啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起到關(guān)鍵作用(侯丙凱等.遺傳，2001，23(5) 492-497)。利用證i啟動(dòng)子在細(xì)胞體內(nèi)持久而高水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，將其整合至附加型的載體中，可獲得高水平的表達(dá)系統(tǒng)，因而在轉(zhuǎn)基因植物中，泛素啟動(dòng)子有巨大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
為了給植物研究中調(diào)控目的基因表達(dá)提供一種新的工具和選擇，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)谷子基因組的深入研究，提供了一種新的泛素啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控植物中目的基因表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的植物啟動(dòng)子。 在本發(fā)明中，所述啟動(dòng)子的具體堿基序列長(zhǎng)度為2020個(gè)堿基，如SEQ ID NO 1所示 ACTTAGCTTCTGGCCATCTCCAGAGACAGTGAGTTGATGCTTGATGCTAGACGAGGGGAAAAAAAGCAG AAAATCAGCCATACTAAATCAACTAATGATTTCAAAGAGAGGTACCTAATGCTCAAAAAGGAAGAGATTGGGCGATT TGCGACTAAAGAAGAGAATAAAATAGATTTTTTATAGCGTTAAGAAGTGTGTCACAGCTCTTACAGGAATGCTTGAT CTACAAATGGAATAGATGATAATGGCAGCGGATATGGACGGATCGGGGTTGTTTAGTTCCTAATTTTTTAAAAAGTT TTTCGTCACATCGAATCTTATAACACATGTGTGAGTATTAAATATAGATAAAAAATAACTAATTACATAATTTATTT GTAGTTTGCTAGATAAAATTTTTGAGCCTAGGGTTAGTTTATGATTGAATAATAATTATCACGAAAGTACTACAGTA GTTAAATTTAAAATTGTTCGCAAACTAAACAAGGCCATGGTGTGTTTTTATTTTACTCTCTAAAAATCTGCACAAAG GTTTTCTGACTCATGGGCCACACGTCTCAGTGTCGGTAAACACGGACGGAATCACGGGAGAAGGCATTAACAGCGTC GGGTCTAACGGCCACAAACCAGCGACGAACGAAACAGACGTTCTGACGTCTCCGTGTCCACTCCGTCACTGGTTCCT TCTGGAGAGCTCTGACCTCCTCCGTCTCTATCTACGGCCGGCTCGCCTTCCGTTCCGCGTTCGCGTTGGACTCTTTG CGCTGGCGTGTTCCTGGAATTGCGTGGCGGAGACGAGGCGGATTTCTCTCGCACGGAACGGAACCGCCACGGGCCCA AAGGCACGGTGATTCCTTCTCCACCAACATAAATAGCCAGGACCCCTCCTCGCCTTTCCCCAATCTCATCTCGCATT GTGTTGTTCGGAGCAAGGAGAACCCAGCCCCCCATCGCTCTCAATCCCAATCGATCTTCTTCTCGTGAGCCTCGTCA ATCCATCACCCGCTTCTAAGGTACGGCTCCCCCTCTAATCTTCTCTTCCCATCTCAGATTGGCGAGTTTATGTGATT AGATTAGATGCTTCTCATCTAGATTGCGAGTTTCTGTTCGTAGATGGCTGGCTTGTAAGCGGTTCCTAGGTGGGTTT CTGTTCGTAGATGACTGGCTTGTAAGCGGTTCCTAGGTGGGATCGTTCTGATGATTTCTTTGGCTGCTGCGTAGAGA TAGATCTGGTCCTGCTTTTCTTAATTCTTGGTGCAGATTTTGTGACCTGGTTCTATGTTCTTGTTCCTGCTTTGTAG CTCAAATAGTTGTCTTAACTAGCTGGGCTTATTATTTGATTTGTACCTGCATGTATTATCACCAAATACAATTACTG TGAAGGAGTCAATATACCCTGCTCTGTACCTTTTACCTGACGAGCCATACTATCATTTTGATTCGTGTCATATGCAT GCCAGATACGGAAATTATATGCTGCTACTTGCGTTATTATCATGCTGATTTGTTTCATATGCACGCCTAGATAGATG GAAATTATATGCTACTGCTGAGCGTTATTATCATGCTGATTCGTTTCATATGCATGCCTAGATAGTTGGAAGTTTTG TTGTTTGCTGAGTGTTACTATCATGTTGATTTGTAATCATATGCATGCCTAGATAGATGAAGATACATGAATGTTAT TCGTTTCAGATAGATGGAATATGCTGCTACTGAGCGTTACTATCATGTTGATTTGTTTCATATACACGCCTAGATAG ATGAAGAGATGGATGTTGATTTGTTTCATATGCATGCCTAATAGATGAAGATATATGCTGCTACTGATGATTACTTA CTACTTCGTGCCCATGCATGCTCTTTGGTTTACTTGGATGGTGACATGCTGATGCAGTTTTGCTGGTTCTATAGTAC CTATGTGCTTAGCATGTATATCTGTTTCTTGTTGCTGACTGTTTCTTTCCCTCCTTAGTCTACCGCCGTATACTTATCATGTTGCTTGTTTTTTCTTCTACAG(SEQ ID NO 1)在本發(fā)明中，將SEQ ID N0:1所示的啟動(dòng)子序列稱為啟動(dòng)子SWbil，也簡(jiǎn)稱為啟動(dòng)子P 603。該啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，帶有該啟動(dòng)子和GUS的水稻愈傷組織以及轉(zhuǎn)基因水稻苗經(jīng)GUS染色實(shí)驗(yàn)后，所述水稻愈傷組織和轉(zhuǎn)基因水稻苗的根、莖、葉等都變藍(lán)色。本發(fā)明的又一方面，涉及具有與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互補(bǔ)的序列的啟動(dòng)子。本發(fā)明的又一方面，還涉及SEQ ID NO :1所示啟動(dòng)子的具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來(lái)分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C;“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性； 0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說(shuō)，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來(lái)形成雜交體，例如， 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。為便于說(shuō)明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預(yù)洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中雜交過(guò)夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過(guò)2-45個(gè)，或者不超過(guò)2-30個(gè)，或者不超過(guò)3-20個(gè)，或者不超過(guò)4-15個(gè)，或者不超過(guò)5-10個(gè)，或者不超過(guò)6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。
在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。通過(guò)一種多核苷酸進(jìn)行說(shuō)明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說(shuō)，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄校渲胁迦氲暮塑账峥啥噙_(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開(kāi)序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。本發(fā)明中，所述的啟動(dòng)子來(lái)源于單子葉植物，具體地，所述單子葉植物為谷子，例如所述谷子為改良冀張谷1號(hào)(改良冀張谷1號(hào)種子于2010年4月1日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCCP201006)。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種含有本發(fā)明所述啟動(dòng)子的重組載體。所述重組載體可以通過(guò)將上述啟動(dòng)子插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組載體為p8+P603重組載體。本發(fā)明的又一方面，還涉及含有本發(fā)明所述啟動(dòng)子的所述重組載體的重組細(xì)胞。 所述重組細(xì)胞可以通過(guò)將含有本發(fā)明所述啟動(dòng)子的所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P603o本發(fā)明的又一方面，還涉及一種單子葉植物愈傷組織，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻。所述水稻包括但不限于，例如中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、11優(yōu)416、11優(yōu)107、11優(yōu)128、11優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、 皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上述水稻品種均可購(gòu)自安徽徽商農(nóng)家福有限公司)等。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種制備本發(fā)明所述啟動(dòng)子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，2)以改良冀張谷1號(hào)的種子基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，可以根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種調(diào)控植物中目的基因表達(dá)的方法，所述方法包括用本發(fā)明所述啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物的愈傷組織的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明所述啟動(dòng)子的重組細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過(guò)程中利用了前述的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P603。 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單子葉植物的愈傷組織為水稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開(kāi)發(fā)。另外， 還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來(lái)篩選和再生整合有表達(dá)單元的植株。本發(fā)明中，可利用所述單子葉植物啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的植物包括但不限于，例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。本發(fā)明的又一方面，還涉及本發(fā)明所述啟動(dòng)子在植物中調(diào)控目的基因表達(dá)的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物為單子葉植物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明所述啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因是GUS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地所述水稻為日本晴。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子聯(lián)用。本發(fā)明的又一方面，涉及本發(fā)明所述啟動(dòng)子在水稻育種中的用途。所述水稻為日本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、 皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻 195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新的啟動(dòng)子，作為植物例如水稻，轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子。本發(fā)明的啟動(dòng)子由于是組成型啟動(dòng)子，同時(shí)還可跨物種調(diào)控目的基因的表達(dá)，故本發(fā)明的啟動(dòng)子可為多種植物育種提供便利，如低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究。將可能極大的縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā)明的啟動(dòng)子可廣泛用于培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等植物。發(fā)明的有益效果本發(fā)明人通過(guò)生物信息學(xué)研究獲得一種來(lái)源于谷子的泛素啟動(dòng)子，并采用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所述啟動(dòng)子P603的功能，該啟動(dòng)子具有跨物種調(diào)控目的基因表達(dá)的作用，為組成型啟動(dòng)子。具體地，所述啟動(dòng)子能夠在水稻中調(diào)控⑶S基因表達(dá)在水稻的愈傷組織、水稻轉(zhuǎn)基因小苗的根、莖、葉中都能調(diào)控gus基因的高效表達(dá)。


圖1是啟動(dòng)子P603的PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道M:200bp DNALadder Marker, 其左側(cè)的數(shù)字表示所指向的Ladder Marker的條帶的大小，單位都是bp ；泳道1 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是用于構(gòu)建p8質(zhì)粒的pCAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。圖3是p8質(zhì)粒示意圖中多克隆位點(diǎn)和GUS序列部分的示意圖。圖4是p8質(zhì)粒示意圖。圖5是經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子 P603序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P603轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(左)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色； 不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對(duì)照，右)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖6是經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻苗的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P603序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P603轉(zhuǎn)化的水稻苗(右)經(jīng)⑶S染色后，其根、莖、葉呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8轉(zhuǎn)化的水稻苗(對(duì)照，左)經(jīng)GUS 染色后其根、莖、葉的顏色未發(fā)生變化。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 啟動(dòng)子P603片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+P603重組載體的構(gòu)建PCR 擴(kuò)增
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使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄號(hào)DP320-02)提取改良冀張谷1號(hào)種子的基因組DNA(gDNA)，根據(jù)該啟動(dòng)子在改良冀張谷 1號(hào)gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物Fl，加限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和保護(hù)堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點(diǎn)Sbf I和保護(hù)堿基)。以上述提取的改良冀張谷1號(hào)的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。如表1所示。
表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
權(quán)利要求
1.一種具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列的啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQID NO :1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，優(yōu)選地， 所述重組載體為P8+P603重組載體。
3.一種含有權(quán)利要求2所述重組載體的重組細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述的重組細(xì)胞，其為重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P603。
5.一種植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，更優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中花9、中花10、中花 11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22,黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、 II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻 201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
6.一種制備權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)SEQID N0:1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，具體地，所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。2)以改良冀張谷1號(hào)基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。
7.—種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物的愈傷組織的步驟，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，特別優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過(guò)程中利用了權(quán)利要求 4所述的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P603。
9.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)的用途，其中所述目的基因?yàn)?GUS,所述植物為水稻，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
10.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在水稻育種中的用途，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中花 9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II 優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、 皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻 197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種啟動(dòng)子，特別是一種植物例如改良冀張谷1號(hào)的啟動(dòng)子，以及所述啟動(dòng)子的制備方法及用途。本發(fā)明所述啟動(dòng)子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子的制備方法以及所述啟動(dòng)子在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)和水稻育種中的用途。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102206641SQ201010154219
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者倪雪梅, 張印新, 張耕耘, 黃剛 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司