啟動子組合物的制作方法
【專利說明】啟動子組合物
[0001] 相關專利申請 本專利申請要求在2013年3月15日提交的美國臨時專利申請No.61/794,818的優(yōu)先 權，該申請以通過引用整體并入本文。
【背景技術】
[0002] 當前用于神經(jīng)退行性疾病的基因治療的方法缺乏開啟和關閉被遞送的治療基因 的表達的能力。另外，當前方法缺乏在遞送后定量調節(jié)治療基因的表達的能力。對可調控 的啟動子有著現(xiàn)實的需求。
[0003] 發(fā)明概沐 在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的啟動子序列，包括長度在500至1700個 核苷酸之間的核酸或由長度在500至1700個核苷酸之間的核酸組成，所述核酸與SEQID N0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6或SEQIDN0:7 具有至少90%的同一性。在某些實施方案中，該啟動子與SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2、SEQ IDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6或SEQIDN0:7具有90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
[0004] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種包含上述啟動子的表達盒，所述啟動子有效 連接至編碼蛋白質或RNA轉錄物的預選的DNA區(qū)段而在轉化細胞中起作用。在某些實施方 案中，該預選的DNA區(qū)段包含選擇標記基因或報告基因。在某些實施方案中，該預選的DNA 區(qū)段編碼治療組合物。在某些實施方案中，該治療組合物為RNAi分子。
[0005] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種包含上述表達盒的載體。在某些實施方案中， 該載體為腺相關病毒（AAV)載體。
[0006] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種包含上述表達盒或上述載體的轉化細胞。在 某些實施方案中，該宿主細胞為真核細胞。在某些實施方案中，該真核細胞為動物細胞(例 如哺乳動物細胞，如人類細胞)。
[0007] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生轉化細胞的方法，包括步驟：（i)將包含 上述有效連接至DNA區(qū)段的啟動子的重組DNA引入細胞以便產(chǎn)生轉化細胞，和（ii)識別或 選擇轉化細胞系。在某些實施方案中，表達該重組DNA以便將表型特征賦予該轉化細胞。在 某些實施方案中，當將其引入源自亨廷頓氏病患者的細胞時，相比源自對照個體的細胞，該 轉化細胞表現(xiàn)出顯著增加的報告基因表達。
[0008] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供通過上述方法制備的轉化細胞。
[0009] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含上述分離的啟動子的轉化細胞。
[0010] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含上述表達盒的轉化細胞。
[0011] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中治療神經(jīng)退行性疾病的方法，包括 施用（a)上述載體或（b)上述轉化細胞。
[0012]附圖簡沐 圖1 :當與健康對照個體比較時，在亨廷頓氏病死亡后腦患者材料中，對五種啟動子的 表達分析顯示出其內(nèi)源性轉錄物的上調。
[0013] 圖2A-2C:在6周大（圖2A)、11周大（圖2B)和19周大（圖2C)的亨廷頓氏病小鼠 腦中內(nèi)源性轉錄物的上調。
[0014] 圖3 :克隆的基因啟動子序列的活性。
[0015] 圖4 :通過報告基因（熒光素酶）表達所顯示的克隆的基因啟動子序列的誘導。
[0016] 發(fā)明詳沐 本發(fā)明提供基因啟動子序列的用途，所述基因啟動子序列可以在神經(jīng)退行性障礙發(fā)作 時或神經(jīng)退行性障礙病理進展期間激活、增強或抑制基因序列的表達。本發(fā)明可直接應用 于基因治療領域。作為在神經(jīng)退行性疾病受調控的基因治療方法的開發(fā)中的工具，它具有 潛在的商業(yè)價值。本發(fā)明提供一種在病程期間基于神經(jīng)退行性疾病進展的狀態(tài)或進展速率 定量調節(jié)或調控治療基因表達的方法。例如，在疾病進展期間，該基因啟動子序列可以激活 治療基因的表達。如果該治療停止了疾病進展，該基因啟動子序列的活性會減弱，導致減少 的/有限的治療基因表達。此治療基因表達的疾病調控動態(tài)方法在基因治療領域是獨特的 和需要的。
[0017] 本發(fā)明可應用于基因治療領域。它滿足了在遞送進入腦后對治療基因的調控和/ 或定量調節(jié)的需求。基因表達分析已顯示在神經(jīng)退行性疾病進展發(fā)作時或神經(jīng)退行性疾病 病程期間，大量基因啟動子序列起到"開啟"、增強、抑制或"關閉"基因表達的作用。本發(fā)明 人已在神經(jīng)退行性疾病的細胞和動物模型中鑒定并克隆了在神經(jīng)退行性疾病進展期間激 活和/或增強基因表達的基因啟動子序列。這些基因啟動子序列也可以在神經(jīng)退行性疾病 模型中于神經(jīng)退行性疾病進展期間激活和/或增強報告基因的表達。此方法是獨特的并且 不同于現(xiàn)有的用于人工調控治療基因表達的系統(tǒng)，該不同在于：其依靠神經(jīng)退行性疾病相 關的分子事件來調制治療基因的表達。這些事件以及因此特定的基因啟動子序列的活性通 過依賴于疾病發(fā)作和/或進展的細胞內(nèi)和/或細胞外信號來控制/誘導。
[0018] 本發(fā)明人已在得自對照個體或攜帶亨廷頓氏?。⊿卩，神經(jīng)退行性疾?。┗蛲蛔?的個體的組織培養(yǎng)細胞中鑒定、克隆了七種不同的基因啟動子序列并測試其活性。該實驗 證明這些基因啟動子序列在被引入源自亨廷頓氏病患者的細胞時，相比源自對照個體的細 胞，可以驅動顯著增加的報告基因表達。同時，引入人造應激因子（stressor)(如蛋白酶體 抑制劑或促炎性刺激）導致來自基因啟動子序列的活性增加，所述活性通過內(nèi)源性控制的 轉錄物或報告基因在培養(yǎng)細胞中的表達來測量。另外，我們已在亨廷頓氏?。?，神經(jīng)退行 性疾病）的小鼠模型的腦中檢測出這些基因啟動子序列活性的疾病進展依賴型增加，所述 活性的增加如通過內(nèi)源性調控的基因轉錄物的定量PCR分析所測量。
[0019] 啟動子序列 在某些實施方案中，本發(fā)明提供以下激活和/或增強基因表達的啟動子序列：泛素 特異性肽酶 31 (USP31，SEQIDN0:1)，γ-FBG(SEQIDN0:2)，H2A組蛋白家族，成員 Y(H2AFY，SEQIDN0:3)，核轉錄因子Y，γ(NYFC，SEQIDN0:4)，DNA損傷誘導轉錄物 3 (CHOP，SEQIDN0:5),非編碼 38ARNA(38A基因座，SEQIDN0:6)，和非編碼 17ARNA (17A,SEQIDN0:7)〇 基因ID:USP31(SEQIDNO:1)

基因ID:β%?/5(SEQIDN0:5)

[0020] "啟動子"是指通常位于其編碼序列上游（5'）的核苷酸序列，它通過提供對RNA聚 合酶和正確轉錄所需的其它因子的識別來控制該編碼序列的表達。"啟動子"包括最小啟 動子，所述最小啟動子是由TATA框和其它用于指定轉錄起始位點的序列所構成的短DNA序 列，向所述轉錄起始位點加入調控元件以控制表達。"啟動子"也指包括最小啟動子加上能 控制編碼序列或功能性RNA表達的調控元件的核苷酸序列。這種類型的啟動子序列由近端 和更遠端的上游元件組成，其中后者常常被稱為增強子。因此，"增強子"是DNA序列，所述 DNA序列能夠刺激啟動子活性并且可以是該啟動子的先天元件或是插入以增強啟動子的水 平或組織特異性的外源元件。它能夠在兩個取向（正常的或翻轉的）上操作，并且甚至能夠 在被從該啟動子移動至上游或下游時起作用。增強子和其它上游啟動子元件均結合介導其 功效的序列特異性DNA結合蛋白。啟動子可以是整體源自天然基因，或是由源自天然存在 的不同啟動子的不同元件構成，或甚至是由合成的DNA區(qū)段構成。啟動子也可以包含涉及 蛋白質因子結合的DNA序列，所述蛋白質因子控制應答于生理或發(fā)育狀況的轉錄起始的效 率。
[0021] 如本文所用，"有生物活性的"意指該啟動子具有至少約0.1%、10%、25%、50%、75%、 80%、85%、甚至9