在的和重組形式。如本文所用，術(shù)語"血清型"是指基于 衣殼蛋白質(zhì)與限定的抗血清的反應(yīng)性來鑒定并有別于其它AAV的AAV，例如，有八種已知的 靈長類AAV血清型：AAV1至AAV8。例如，血清型AAV9用于指代包含編碼自AAV9cap基因 的衣殼蛋白質(zhì)以及含有來自相同AAV9血清型的5'和3'ITR序列的基因組的AAV。在某些 實(shí)施方案中，該AAV載體為AAV9。
[0037] 縮寫"rAAV"是指重組腺相關(guān)病毒，也被稱為重組AAV載體(或"rAAV載體")。在 一個實(shí)施方案中，采用已知技術(shù)構(gòu)建該AAV表達(dá)載體以至少提供在轉(zhuǎn)錄方向上有效連接的 組分、控制元件(包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、目標(biāo)DNA和轉(zhuǎn)錄終止區(qū))。選擇在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮功 能的控制元件。得到的包含有效連接的組分的構(gòu)建體的側(cè)面（5'和3'）是功能性AAVITR 序列。
[0038] 所謂"腺相關(guān)病毒反向末端重復(fù)序列"或"AAVITR"意指存在于AAV基因組每一 端的識別區(qū)域（art-recognizedregion)，所述識別區(qū)域作為DNA復(fù)制起點(diǎn)和病毒包裝信 號以順式共同作用。
[0039] 該AAVITR區(qū)域的核苷酸序列是已知的。如本文所用，"AAVITR"不必具有前述 的野生型核苷酸序列，但其可被改變，例如，通過核苷酸的插入、缺失或置換。此外，該AAV ITR可以源自若干AAV血清型的任一者，包括但不限于：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7 等。另外，在AAV載體中位于選定的核苷酸序列側(cè)面的5'和3'ITR不必完全相同或源自相 同的AAV血清型或分離物，只要它們的功能符合期望，S卩，允許從宿主細(xì)胞基因組或載體切 除和拯救目標(biāo)序列。
[0040]可以使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)（如在Sambrook和Russell,MolecularCloning:A LaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY (2001)中所描述的那些)將編碼治療組合物的核酸工程改造進(jìn)AAV載體中。例如，連接可在 下述條件下完成：20mMTris-ClpH7. 5，10mMMgC12, 10mMDTT, 33Pg/mlBSA, 10 mM-5〇mMNaCl,和40μΜΑΤΡ,0·01-〇·〇2 (Weiss)單位T4DNA連接酶于0。C(對于 "粘性末端"連接）或ImMATP, 0.3-0. 6 (Weiss)單位T4DNA連接酶于14°C(對于"平 末端"連接）。分子間"粘性末端"連接通常在30-100Pg/ml總DNA濃度下進(jìn)行（5-100 nM總終濃度)。包含ITR的AAV載體已在例如，美國專利No. 5, 139, 941中描述。具體來 說，那其中描述的若干AAV載體可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心("ATCC"）在登錄號53222、 53223、53224、53225和53226下獲得。
[0041] 在某些實(shí)施方案中，該腺相關(guān)病毒包裝了全長的基因組，S卩，約與天然基因組大小 相同的基因組，并且既不太大也不太小。在某些實(shí)施方案中，該AAV不是自身互補(bǔ)AAV載體。
[0042] 該病毒載體還包括控制外源基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。所述啟動子可以是控制治療組合 物轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子。該表達(dá)系統(tǒng)適用于向哺乳動物接受者施用。
[0043] 在某些實(shí)施方案中，施用了病毒顆粒。病毒顆粒是熱穩(wěn)定的、耐溶劑、耐去垢劑、耐 pH變化、耐溫，并且可以在CsCl梯度上濃縮。AAV不與任何致病事件相關(guān)聯(lián)，并且尚未發(fā)現(xiàn) 采用AAV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)會在細(xì)胞生長或分化上誘導(dǎo)任何持續(xù)的負(fù)面效應(yīng)。已顯示ITR是包裝 所要求的唯一順式元件，所述包裝允許完全加工病毒基因以產(chǎn)生載體系統(tǒng)。
[0044] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含表達(dá)盒的載體，所述表達(dá)盒包含有效連接至 靶序列的啟動子。如本文所用，"表達(dá)盒"意指能夠指導(dǎo)具體核苷酸序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞中 表達(dá)的核酸序列，所述核酸序列包括有效連接至目標(biāo)核苷酸序列的啟動子，所述目標(biāo)核苷 酸序列可以有效連接至終止信號。該編碼區(qū)域通常編碼功能性目標(biāo)RNA，例如RNAi分子。 該包括目標(biāo)核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的。
[0045] 本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供編碼靶分子(如分離的RNAi分子）的載體。如本文所 用，術(shù)語"由…編碼"采用廣義，類似于專利用辭中的術(shù)語"包含"。RNAi分子包括siRNA、 shRNA和其它可以或能夠調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)(例如通過RNA干擾）的小RNA。這類小RNA包括 但不限于shRNA和微RNA(miRNA)。
[0046] "有效連接的"是指核酸序列在單個核酸片斷上相關(guān)聯(lián)從而其中一個序列的功能 受到另一個的影響。例如，調(diào)控DNA序列被認(rèn)為"有效連接至"編碼RNA或多肽的DNA序列 或與之"相關(guān)聯(lián)"，如果該兩個序列處于這樣的狀態(tài)：該調(diào)控DNA序列影響該編碼DNA序列的 表達(dá)（即，該編碼序列或功能性RNA處于該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)。編碼序列可以有義或 反義取向有效連接至調(diào)控序列。當(dāng)核酸同另一個核酸序列被置于功能關(guān)系時，該核酸是"有 效連接的"。一般而言，"有效連接的"意指該連接的DNA序列是相鄰的。然而，增強(qiáng)子不必 是相鄰的。連接通過在便利的限制性位點(diǎn)的連接反應(yīng)來完成。如果此類位點(diǎn)不存在，則依 據(jù)常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。此外，該編碼酶的核酸的多個拷貝可以在 表達(dá)載體中連接在一起。此類多個核酸可以由接頭分隔。
[0047] "表達(dá)"是指細(xì)胞中內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，就反義構(gòu)建體而 言，表達(dá)可以僅指代該反義DNA的轉(zhuǎn)錄。另外，表達(dá)還指代有義（mRNA)或功能性RNA的轉(zhuǎn) 錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)也可以指代蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
[0048] 如本文所用，"表達(dá)盒"意指能夠指導(dǎo)具體核苷酸序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)的 DNA序列，所述DNA序列包括有效連接至目標(biāo)核苷酸序列的啟動子，所述目標(biāo)核苷酸序列有 效連接至終止信號。它通常也包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。該編碼區(qū)域通常編 碼目標(biāo)蛋白質(zhì)但也可以在有義或反義方向上編碼功能性目標(biāo)RNA，例如反義RNA或非翻譯 RNA。包含目標(biāo)核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，意味著其至少一個組分相對于其至少一 個其它組分是外源的。表達(dá)盒也可以是天然存在的但已經(jīng)以重組形式獲得而用于外源表 達(dá)。此類表達(dá)盒將包含連接至目標(biāo)核苷酸的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。可以連同眾多限制性位點(diǎn)提供這 樣的表達(dá)盒用于插入目標(biāo)基因使之處于調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。表達(dá)盒可以額外包含可 選擇的標(biāo)記基因。
[0049] 本公開也提供包含本文所述的載體的哺乳動物細(xì)胞。該細(xì)胞可以是人類的，并且 可以來自腦、脾、腎、肺、心臟或肝。該細(xì)胞類型可以是干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體。
[0050] 編碼治療組合物的核酸 本發(fā)明提供施用治療組合物的方法。在某些實(shí)施方案中，所述治療組合物是轉(zhuǎn)基因，所 述轉(zhuǎn)基因是編碼相對于逆轉(zhuǎn)錄病毒是外來的多肽的基因，載體主要源自所述逆轉(zhuǎn)錄病毒， 并且所述轉(zhuǎn)基因在其施用的生物體內(nèi)具有有用的生物活性(例如，治療基因）。如本文所用， 術(shù)語"治療基因"是指其表達(dá)是細(xì)胞所需以提供治療效果(例如，治療疾病）的基因。
[0051] 伸用方法 本公開提供通過施用含有上述分離的啟動子的載體以治療神經(jīng)退行性疾病的方法，所 述神經(jīng)退行性疾病如遺傳病如亨廷頓氏病、ALS、遺傳性痙攣性偏癱、原發(fā)性側(cè)索硬化、脊髓 性肌萎縮、肯尼迪病、老年癡呆癥、多聚谷氨酰胺重復(fù)疾病或病灶性暴露（focalexposure) (如帕金森病)。
[0052] 本公開的某些方面涉及多核苷酸、多肽、載體和基因改造的細(xì)胞(經(jīng)體內(nèi)修飾）及 其用途。具體來說，本公開涉及基因或蛋白質(zhì)治療的方法，所述基因或蛋白質(zhì)治療均能夠系 統(tǒng)遞送治療有效劑量的治療劑。
[0053] 現(xiàn)在將通過以下非限制性實(shí)施例說明本發(fā)明。
[0054] 實(shí)施例1 對于此實(shí)驗(yàn)，使用了得自6位不同