粒子操作方法以及粒子操作用器件的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于進(jìn)行目標(biāo)物質(zhì)的分離、提取、提純、反應(yīng)等化學(xué)操作的粒子的操作方法及其使用的操作用器件。
【背景技術(shù)】
[0002]在醫(yī)學(xué)檢查、食品安全衛(wèi)生上的管理、環(huán)境保護(hù)用的監(jiān)測(cè)等中，要求從含有多種多樣的夾雜物的試樣中，提取目標(biāo)物質(zhì)，并將其用于檢測(cè)、反應(yīng)。例如，在醫(yī)學(xué)檢查中，必須對(duì)從動(dòng)植物分離取得的血液、血清、細(xì)胞、尿、糞便等生物試樣中所含的核酸、蛋白質(zhì)、糖、月旨類、細(xì)菌、病毒、放射性物質(zhì)等進(jìn)行檢測(cè)、鑒定、定量。進(jìn)行這些檢查時(shí)，為了排除夾雜物引起的背景(background)等的負(fù)面影響，有時(shí)必須將目標(biāo)物質(zhì)分離、提純。
[0003]例如，在基因檢查中，使生物試樣中的核酸通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))等基因擴(kuò)增法擴(kuò)增，決定其排列。為了通過(guò)PCR等基因擴(kuò)增法有效地?cái)U(kuò)增核酸，必須從含有各種夾雜物的生物試樣中提取并純化核酸，并將其用于反應(yīng)。在提取并純化生物試樣中的核酸時(shí)，以往標(biāo)準(zhǔn)使用的是苯酚-氯仿法。但是，苯酚-氯仿法存在操作繁瑣、并且使用的試劑有害、廢液處理花費(fèi)成本的問(wèn)題。
[0004]在專利文獻(xiàn)1中，提出了利用核酸會(huì)特異性吸附到二氧化硅的性質(zhì)，通過(guò)粒子操作，從生物試樣中提取并純化核酸的方法(Boom法)。在該方法中，首先，將在蛋白酶以及表面活性劑的存在下處理試樣后得到的溶解液在胍鹽、碘化物鹽、尿素等離液序列高的物質(zhì)的存在下，與二氧化硅粒子混合，使核酸吸附至粒子表面。為了除去夾雜物，對(duì)核酸所吸附的二氧化硅粒子進(jìn)行數(shù)次清洗。然后，向鹽濃度低的溶液(洗脫液)中，投入二氧化硅粒子復(fù)合物的話，被提純的核酸洗脫至洗脫液中，得到核酸的提純?cè)嚇?。使用了此種粒子操作的化學(xué)操作除了以核酸為對(duì)象，也正在推進(jìn)向利用了抗原抗體反應(yīng)的免疫測(cè)定等的應(yīng)用(例如參照專利文獻(xiàn)2)。
[0005]在使用了粒子的操作中，必須適當(dāng)?shù)胤蛛x吸附了核酸等目標(biāo)試樣的粒子(固相)和含有未被粒子吸附的夾雜物的水基液體(液相)。作為此種分離操作(B/F分離)，提出有以下方法:使分散有粒子的水基液體作為液滴存在于不與水基液體混和的液體(例如油)中，在該水基液體的液滴中使核酸等吸附到粒子表面后，僅僅使得吸附了核酸的粒子從液滴移動(dòng)至油中。此外，基于使粒子的選擇性移動(dòng)變得容易的觀點(diǎn)，提出有以下方法:使用涂覆了二氧化硅的磁性粒子等，通過(guò)磁場(chǎng)操作，使粒子移動(dòng)。
[0006]水基液體在油中作為液滴存在時(shí)，油的流體阻力、油和水基液體界面的防水力、粒子表面的親水基與水基液體的相互作用等會(huì)成為保持液滴的位置和形狀的力。因此，即使僅僅要使磁性粒子從水基液體的液滴中移動(dòng)至油中而分離，由于液滴會(huì)伴著磁性粒子而追隨磁場(chǎng)，因此僅僅使粒子從水基液體的液滴中分離到油中是不容易的。
[0007]鑒于此種問(wèn)題，提出抑制水基液體的液滴移動(dòng)、選擇性地僅使粒子移動(dòng)至油中的方法。例如，專利文獻(xiàn)3中，公開(kāi)了通過(guò)在封入有液滴以及油的容器的內(nèi)面設(shè)置隔壁等物理結(jié)構(gòu)體來(lái)攔阻液滴，僅使磁性粒子從部分間隙移動(dòng)而分離的方法。但是，專利文獻(xiàn)3公開(kāi)的方法必須在油封入部分進(jìn)行特殊的微細(xì)加工，因此器件的結(jié)構(gòu)復(fù)雜。此外，即使設(shè)置物理結(jié)構(gòu)，也不能完全攔阻附著在粒子周圍的水基液體，因此B/F分離性稱不上充分。
[0008]專利文獻(xiàn)4中，公開(kāi)了通過(guò)在液滴的輸送面施加電場(chǎng)，使得液滴被固定在輸送面的規(guī)定位置，在此狀態(tài)下，僅僅使得磁性粒子分離的方法。但是，該方法必須始終對(duì)器件施加電場(chǎng)才能固定液滴，因此存在器件的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、且無(wú)法在電力等能量供給不足的環(huán)境下使用的問(wèn)題。因此，稱不上適用于發(fā)展中國(guó)家等基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)落后的環(huán)境、恐怖事件和災(zāi)害等緊急事態(tài)等需要在短時(shí)間內(nèi)檢查大量檢驗(yàn)體的環(huán)境下。此外，生物試樣的操作所使用的器件基于污染等不理想狀況的抑制、防止感染等的觀點(diǎn)，優(yōu)選為一次性的?；诖朔N觀點(diǎn)，要求開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)便、迅速、低成本、且可以在各種現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行提純和檢查等的化學(xué)操作方法及其所使用的器件。
[0009]專利文獻(xiàn)5中，公開(kāi)了在不與水基液體混和的液體(硅油等)中，添加羥基脂肪酸、糊精脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯等低分子凝膠劑，形成物理凝膠，將水基液體的液滴固定在油中的規(guī)定位置的方法。物理凝膠在高于溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的高溫下，成為具有流動(dòng)性的溶膠，在低于溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的低溫下，成為不具有流動(dòng)性的半固體的凝膠狀。因此，若向被加熱至溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度以上的溶膠狀油中投入水基液體后，通過(guò)冷卻使油凝膠化的話，水基液體的液滴被包埋固定在凝膠中。通過(guò)此方法，在將水基液體液滴固定在凝膠內(nèi)的規(guī)定位置的情況下，通過(guò)磁場(chǎng)操作，可以僅僅使得磁性粒子移動(dòng)至凝膠的內(nèi)部。因此，可以簡(jiǎn)便且高效地分離含有夾雜物的水基液體和固定有目標(biāo)試樣的粒子。
[0010]此外，專利文獻(xiàn)5的方法中，將油加熱而成為溶膠狀的話，液滴從包埋固定狀態(tài)解放，可以在溶膠狀的油中移動(dòng)。因此，通過(guò)在封入有物理凝膠的容器內(nèi)設(shè)置溫度梯度，使得油為凝膠狀態(tài)的區(qū)域和油為溶膠狀態(tài)的區(qū)域共存，可以在低溫的凝膠區(qū)域進(jìn)行核酸提取純化操作，在高溫的溶膠區(qū)域的油中使得液滴與粒子共同移動(dòng)，由此進(jìn)行PCR的溫度循環(huán)。通過(guò)此方法，需要將液滴固定在規(guī)定位置的核酸提取純化、以及需要液滴的移動(dòng)的PCR可以在保持密閉狀態(tài)下的一個(gè)器件內(nèi)進(jìn)行。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)1:日本專利特開(kāi)平2-289596號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:W02002/095407號(hào)國(guó)際公開(kāi)說(shuō)明書(shū)
專利文獻(xiàn)3:W02005/069015號(hào)國(guó)際公開(kāi)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)4:日本專利特開(kāi)2009-162580號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:日本專利特開(kāi)2011-232260號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0012]專利文獻(xiàn)5公開(kāi)的方法中，必須在加熱物理凝膠而使其溶膠化后封入液滴，因此在器件開(kāi)始使用時(shí)需要加熱單元。因此，難以稱得上適用于電力等能量供給不足的環(huán)境下。此外，制作器件時(shí)，為了在容器中封入凝膠，必須向油中添加凝膠劑，加熱至溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度以上并混和后，保持溶膠狀態(tài)封入容器內(nèi)，在容器內(nèi)凝膠化，因此凝膠的裝填操作繁瑣。
[0013]另外，專利文獻(xiàn)5公開(kāi)的發(fā)明通過(guò)使用會(huì)產(chǎn)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的物理凝膠，可以達(dá)成其目的，但由于物理凝膠在高溫環(huán)境下會(huì)溶膠化，因此在高溫環(huán)境中，有時(shí)無(wú)法達(dá)成“將水基液體的液滴包埋固定在凝膠中而分離水基液體和粒子”的期望目的。此外，物理凝膠因氫鍵、范德華力、疏水的相互作用、靜電引力等弱分子間結(jié)合力而形成三維網(wǎng)絡(luò)，因此即使在常溫環(huán)境下，因輸送時(shí)的振動(dòng)等而對(duì)凝膠施加了剪切力、壓力等外力的話，有時(shí)分子間結(jié)合網(wǎng)絡(luò)也會(huì)被破壞而產(chǎn)生溶膠化。
[0014]此外，根據(jù)本發(fā)明者們的研究確認(rèn):通過(guò)使用了物理凝膠的粒子操作，進(jìn)行核酸的分離.提純時(shí)，核酸溶液會(huì)有源自雜質(zhì)的吸收峰。在目標(biāo)物的檢測(cè)、鑒定、定量等解析作業(yè)中，有時(shí)此種雜質(zhì)會(huì)使得測(cè)定數(shù)據(jù)產(chǎn)生高背景，造成解析精度下降、誤判等問(wèn)題。
[0015]有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種能夠簡(jiǎn)便、迅速、低成本、并不被環(huán)境左右地使用的粒子操作方法以及用于進(jìn)行該粒子操作的器件。
用于解決問(wèn)題的手段
[0016]關(guān)于上述的使用了物理凝膠的粒子操作中的雜質(zhì)混入，本發(fā)明者們所研究的結(jié)果推測(cè)為，該雜質(zhì)來(lái)自于其他液體部分通過(guò)粒子透過(guò)凝膠時(shí)產(chǎn)生的穿孔而混入的液體、或者凝膠的構(gòu)成成分。另一方面，發(fā)現(xiàn)了將化學(xué)凝膠用作凝膠介質(zhì)的情況下，不僅凝膠的裝填操作容易，還消除了使用物理凝膠時(shí)的雜質(zhì)混入問(wèn)題，從而完成了本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明涉及粒子的操作方法。本發(fā)明的粒子的操作方法包括:使存在于水基液體中的粒子被移動(dòng)至不溶或難溶于水基液體的凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的步驟；以及使存在于凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的粒子被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)外部的步驟。優(yōu)選方式中，粒子向凝膠狀介質(zhì)的外部的移動(dòng)，是移動(dòng)至與最初含有粒子的水基液體不同的其他水基液體中。
[0018]上述粒子操作是在例如裝填有多個(gè)水基液體、各水基液體間隔著凝膠狀介質(zhì)的器件內(nèi)進(jìn)行的。優(yōu)選在該器件內(nèi)，使存在于水基液體中的粒子被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的步驟、以及使存在于凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的粒子被移動(dòng)至其他水基液體中的步驟被多次進(jìn)行。一實(shí)施方式中，器件內(nèi)的多個(gè)水基液體中，至少有2個(gè)水基液體具有互不相同的組成。該方式中，可以在1個(gè)器件內(nèi)進(jìn)行多種化學(xué)操作(分離、提取、提純、反應(yīng)等)。
[0019]凝膠狀介質(zhì)優(yōu)選為含有化學(xué)交聯(lián)聚合物的凝膠，例如，適宜使用含有交聯(lián)型有機(jī)聚硅氧烷的有機(jī)硅凝膠。此外，凝膠狀介質(zhì)的稠度優(yōu)選為340?475。一實(shí)施方式中，凝膠狀介質(zhì)還含有油劑。
[0020]本發(fā)明的粒子的操作方法中，優(yōu)選在使粒子從水基液體被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部時(shí)，以及粒子在凝膠狀介質(zhì)內(nèi)被移動(dòng)時(shí)，附隨在所述粒子上的水基液體從粒子被分離。
[0021 ] 本發(fā)明所使用的粒子優(yōu)選為可以選擇性地固定特定物質(zhì)的粒子。作為可以被選擇性固定在粒子上的物質(zhì)，可列舉出例如，核酸、蛋白質(zhì)、糖、脂類、抗體、受體、抗原、配體、細(xì)胞等生物來(lái)源物質(zhì)。另外，“生物來(lái)源物質(zhì)”指的是，不一定非要是來(lái)自從生物提取的試樣，也包含in vivo所得到的物質(zhì)(例如，通過(guò)PCR擴(kuò)增的核酸等)。
[0022]在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，作為粒子操作的對(duì)象的粒子是磁性粒子。此時(shí)，優(yōu)選通過(guò)磁場(chǎng)的操作，進(jìn)行粒子的移動(dòng)。
[0023]本發(fā)明的粒子操作可適用于例如被固定在粒子上的核酸的提取、粒子表面的抗原抗體反應(yīng)等。
[0024]另外，本發(fā)明涉及一種適用于上述粒子操作的器件。本發(fā)明的器件具有:水基液體、在水基液體中為不溶性或難溶性的凝膠狀介質(zhì)、保持水基液體以及凝膠狀介質(zhì)的容器、以及應(yīng)該在容器內(nèi)被移動(dòng)的粒子。
[0025]此外，本發(fā)明涉及一種用于制作上述器件的試劑盒(kit)。本發(fā)明的器件制作用試劑盒含有水基液體、凝膠狀介質(zhì)以及粒子。該試劑盒的這些構(gòu)成要素中的一部分也可以被預(yù)先裝填在規(guī)定的容器內(nèi)。
發(fā)明效果
[0026]本發(fā)明的粒子操作方法中，通過(guò)使得固定有目標(biāo)物質(zhì)的粒子與規(guī)定的凝膠接觸、或者使得固定有目標(biāo)物質(zhì)的粒子通過(guò)凝膠內(nèi)，在保持固定有目標(biāo)物質(zhì)的狀態(tài)的同時(shí)，附隨在所述粒子上的水基液體從粒子被分離。因此可以簡(jiǎn)便、迅速、低成本地實(shí)施B/F分離。此夕卜，由于幾乎不會(huì)產(chǎn)生源自凝膠的夾雜物，因此可以排除夾雜物所引起的背景等的負(fù)面影響。因此，可以正確且高效地進(jìn)行目標(biāo)物質(zhì)的分離、提純、反應(yīng)等化學(xué)操作。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，無(wú)需對(duì)裝填有凝膠和水基液體的容器進(jìn)行開(kāi)閉，可以在1個(gè)器件內(nèi)的密閉系統(tǒng)中進(jìn)行多個(gè)化學(xué)操作。因此，除了操作簡(jiǎn)便，還可以排除污染等的負(fù)面影響。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1是示出本發(fā)明的粒子操作方法的概要的模式圖。
圖2是示出通過(guò)磁場(chǎng)操作進(jìn)行粒子的移動(dòng)的實(shí)施方式的模式圖。