的亨廷頓氏病患者或5位對照健康個體的死亡后人 腦組織以分析5種不同聚合酶2啟動子的活性。提取RNA并應用定量PCR以便測量由這些 啟動子產生的內源RNA轉錄物的量。當與健康個體比較時，我們在亨廷頓氏病患者的腦中 發(fā)現(xiàn)全部五種啟動子的顯著上調。圖1。
[0055] 在6和11周大時(癥狀前）和在19周大時（出現(xiàn)癥狀）處死野生型和HD小鼠。從 紋狀體樣品中分離總RNA并且通過使用實時Q-PCR確定小鼠NfyC、H2afy、Usp31和Chop基 因的表達。在6和11周大時，沒有基因上調，然而在19周大時，Nfyc和H2afy的表達有顯 著上調。參與測試的小鼠數目為每組4只。圖2A-2C。
[0056] 在編碼螢火蟲熒光素酶的報告基因的上游克隆了每種所述基因啟動子序列。在人 類培養(yǎng)細胞中瞬時表達這些構建體從而確認其在基礎狀態(tài)下的轉錄活性。圖3。
[0057] 將示于附件4中的啟動子構建體瞬時轉染到對照或源自亨廷頓氏病的培養(yǎng)成纖 維細胞中。當與對照成纖維細胞比較時，我們在亨廷頓氏病成纖維細胞中觀察到所述克隆 的基因啟動子序列的活性增加。圖4。
[0058] 全部的出版物、專利和專利申請均以引用方式并入于此。盡管在前述說明書中結 合其某些優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行了描述，并且出于說明目的闡明了許多細節(jié)，對本領 域技術人員顯而易見的將是：本發(fā)明允許另外的實施方案并且本文所述的某些細節(jié)可以在 不背離本發(fā)明基本原則的情況下發(fā)生相當大的改變。
[0059] 除非在本文中另外指明或與上下文明顯抵觸，術語"一"和"該"及類似指稱在描 述本發(fā)明的語境中的使用應理解為同時覆蓋單數和復數形式。除非另行注明，術語"包含"、 "具有"、"包括"和"含有"應理解為開放式術語(即，意味著"包括但不限于")。除非在本文 中另外指明，本文中對數值范圍的列舉僅僅意在作為速記法來分別指代落在該范圍內的每 個單獨數值，并且每個單獨數值如同在本文中單獨列舉那樣并入說明書。除非在本文中另 外指明或與上下文明顯抵觸，本文中所述的全部方法可以任何適合的順序實施。本文所提 供的任何和全部實施例，或示例性用語(例如，"諸如")，除非另行要求，其使用僅僅意在更 好地說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明的范圍。說明書中的用語不應當理解為暗示任何未要求保 護的要素為實踐本發(fā)明所必需的。
[0060] 本文所述的本發(fā)明的實施方案包括本發(fā)明人所知的實施本發(fā)明的最佳方式。通過 閱讀前述說明書，那些實施方案的變型對于本領域普通技術人員會變得顯而易見。本發(fā)明 人預期熟練的技術人員將會酌情采用此類變型，并且本發(fā)明人預計本發(fā)明將以本文所具體 描述的以外的方式實施。因此，本發(fā)明包括適用法律允許的所附權利要求中列舉的該主題 的全部修改方式和等同形式。同時，除非在本文中另外指明或與上下文明顯抵觸，否則本發(fā) 明涵蓋了上述要素在其全部可能的變型中的任意組合。
【主權項】
1. 分離的啟動子序列，其包括長度在500至1700個核苷酸之間的核酸，所述核酸與SEQ IDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQID NO:7具有至少90%的同一性。2. 分離的啟動子序列，其由長度在500至1700個核苷酸之間的核酸組成，所述核酸與 SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或 SEQIDNO:7具有至少90%的同一性。3. 根據權利要求1或2的分離的啟動子序列，其中所述核酸與SEQIDNO:1、SEQID NO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQIDNO:7 具有至少 95%的同一性。4. 分離的啟動子序列，其包括長度在1500至1700個核苷酸之間的核酸，所述核酸與 SEQIDNO:1具有至少90%的同一性。5. 分離的啟動子序列，其包括長度在600至800個核苷酸之間的核酸，所述核酸與SEQ IDNO: 2具有至少90%的同一性。6. 分離的啟動子序列，其包括長度在1300至1400個核苷酸之間的核酸，所述核酸與 SEQIDNO: 3具有至少90%的同一性。7. 分離的啟動子序列，其包括長度在1300至1500個核苷酸之間的核酸，所述核酸與 SEQIDNO:4具有至少90%的同一性。8. 分離的啟動子序列，其包括長度在1000至1200個核苷酸之間的核酸，所述核酸與 SEQIDNO: 5具有至少90%的同一性。9. 分離的啟動子序列，其包括長度在500至700個核苷酸之間的核酸，所述核酸與SEQ IDNO:6具有至少90%的同一性。10. 分離的啟動子序列，其包括長度在900至1700個核苷酸之間的核酸，所述核酸與 SEQIDNO: 7具有至少90%的同一性。11. 表達盒，其包括根據權利要求1至10中任一項的啟動子，所述啟動子有效連接至編 碼蛋白質或RNA轉錄物的預選的DNA區(qū)段而在轉化細胞中起作用。12. 根據權利要求11的表達盒，其中所述預選的DNA區(qū)段包含選擇標記基因或報告基 因。13. 根據權利要求11的表達盒，其中所述預選的DNA區(qū)段編碼治療組合物。14. 根據權利要求13的表達盒，其中所述治療組合物為RNAi分子。15. 載體，其包含根據權利要求11至14中任一項的表達盒。16. 根據權利要求15的載體，其中所述載體為腺相關病毒（AAV)載體。17. 轉化細胞，其包含根據權利要求11至14中任一項的表達盒或根據權利要求15或 16的載體。18. 根據權利要求17的轉化細胞，其中所述宿主細胞為真核細胞。19. 根據權利要求18的轉化細胞，其中所述真核細胞為動物細胞。20. 根據權利要求19的轉化細胞，其中所述動物細胞為哺乳動物細胞。21. 根據權利要求20的轉化細胞，其中所述哺乳動物細胞為人類細胞。22. 產生轉化細胞的方法，其包括步驟：（i)將重組DNA引入細胞以便產生轉化細胞， 所述重組DNA包含根據權利要求1至10中任一項的啟動子，所述啟動子有效連接至DNA區(qū) 段；和（ii)鑒定或選擇轉化細胞系。23. 根據權利要求22的方法，其中表達所述重組DNA以便將表型特征賦予所述轉化細 胞。24. 根據權利要求22的方法，其中當將其引入源自亨廷頓氏病患者的細胞時，相比源 自對照個體的細胞，所述轉化細胞表現(xiàn)出顯著增加的報告基因表達。25. 轉化細胞，其由根據權利要求22至24中任一項的方法制得。26. 轉化細胞，其包括根據權利要求1至10中任一項的分離的啟動子。27. 轉化細胞，其包括根據權利要求11至14中任一項的表達盒。28. 在哺乳動物中治療神經退行性疾病的方法，其包括施用（a)根據權利要求15或16 的載體，或（b)根據權利要求25至27中任一項的轉化細胞。29. 根據權利要求1至10中任一項的分離的啟動子的用途，其中所述啟動子在神經退 行性障礙發(fā)作時或神經退行性障礙病理進展期間激活、增強或抑制基因序列的表達。
【專利摘要】一種分離的啟動子序列，其包括長度在600至1700個核苷酸之間的核酸，所述核酸與SEQ？ID？NO：1、SEQ？ID？NO：2、SEQ？ID？NO：3、SEQ？ID？NO：4、SEQ？ID？NO：5、SEQ？ID？NO：6或SEQ？ID？NO：7具有至少90%的同一性。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/63, C12N15/79
【公開號】CN105358690
【申請?zhí)枴緾N201480027707
【發(fā)明人】B.L.戴維森, E.羅德里格斯, A.馬斯蒙泰斯
【申請人】衣阿華大學研究基金會
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2014年3月6日
【公告號】CA2906315A1, EP2970969A1, US20160022837, WO2014149882A1