0%或更高，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的CCT啟 動子活性，所述CCT啟動子包含SEQIDN0:1或SEQIDN0:2。該啟動子活性可通過本領域 熟知的方法確定。例如，參見Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual (1989)。本發(fā)明中不同于SEQIDNO:1或SEQIDNO:2但保留了可比較的生物活性的啟動 子被稱為變體啟動子。本發(fā)明的核苷酸序列包括天然存在的序列以及重組形式。
[0022] 本發(fā)明涵蓋分離的或基本上純化的核酸組合物。在本發(fā)明的語境中，"分離的"或 "純化的"DNA分子或RNA分子是脫離其天然環(huán)境而存在的DNA分子或RNA分子，并且因此 不是天然的產(chǎn)物。分離的DNA分子或RNA分子可以純化的形式存在或可存在于非天然環(huán)境 諸如，例如，轉(zhuǎn)基因宿主細胞。例如，"分離的"或"純化的"核酸分子或其生物活性部分，當 通過重組技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含其它細胞材料或細胞培養(yǎng)基，或當化學合成時基本上不含 化學前體或其它化學物質(zhì)。在一個實施方案中，"分離的"核酸不含在該核酸的來源生物體 的基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)面(S卩，位于該核酸的5'和3'端的序列）的序列。例如， 在多個實施方案中，該分離的核酸分子可以含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb 或0. 1kb的在該核酸的來源細胞的基因組DNA中天然位于該核酸分子側(cè)面的核苷酸序列。 本發(fā)明也涵蓋了所公開的核苷酸序列的片段和變體。所謂"片段"或"部分"意指全長或小 于全長的該核苷酸序列。
[0023] 術(shù)語"核酸"是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)及其聚 合物，其由包含糖、磷酸鹽和堿基(嘌呤或嘧啶）的單體(核苷酸）構(gòu)成。除非具體限定，該術(shù) 語涵蓋包含天然核苷酸的已知類似物的核酸，其具有與參考核酸相似的結(jié)合特性并且以與 天然存在的核苷酸相似的方式代謝。除非另外指明，具體的核酸序列也涵蓋其保守修飾的 變體(例如，簡并密碼子置換）和互補序列，以及明確指明的序列。具體地，簡并密碼子置換 可以通過產(chǎn)生其中一個或多個選定的(或全部)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷 殘基置換的序列來實現(xiàn)。"核酸片段"是給定核酸分子的一部分。
[0024] "天然存在的"、"天然的"或"野生型"用于描述可以在自然界中找到并且有別于人 造的對象。例如，存在于生物體(包括病毒)中的、可以從天然來源分離的并且還未被人在實 驗室中有意修飾的蛋白質(zhì)或核酸序列是天然存在的。
[0025]載體和表汰倉 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含上述啟動子的載體和表達盒。
[0026] 載體 "載體"定義為包括：尤其是任何病毒載體，以及任何質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或雙鏈或單鏈 的線形或環(huán)狀的雙元載體，所述載體可以或不可以是可自傳遞的或可移動的，并且可以通 過整合進細胞基因組或存在于染色體外(例如，具有復制起點的自發(fā)復制質(zhì)粒）來轉(zhuǎn)化原核 或真核宿主。
[0027]用于在細胞中表達特定的治療組合物(例如，蛋白質(zhì)）的具體表達載體的選擇和優(yōu) 化可以通過下述方法完成：得到編碼該蛋白質(zhì)的、可能具有一個或多個適當?shù)目刂茀^(qū)域(例 如，啟動子、插入序列）的核酸序列；制備包含插入有編碼該蛋白質(zhì)的核酸序列的載體的載 體構(gòu)建體；用該載體構(gòu)建體在體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導培養(yǎng)的細胞；并確定該蛋白質(zhì)是否存在于培 養(yǎng)的細胞中。
[0028]用于細胞基因治療的載體包括病毒，諸如復制缺陷型病毒。復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病 毒能夠指導所有病毒粒子蛋白質(zhì)的合成，但不能制造感染性粒子。因此，這些經(jīng)遺傳改造 的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體具有在培養(yǎng)的細胞中高效轉(zhuǎn)導核酸序列的一般實用性，和用于本發(fā) 明方法的特定實用性。此類逆轉(zhuǎn)錄病毒還具有在體內(nèi)將核酸序列有效轉(zhuǎn)導進入細胞的實用 性。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被廣泛用于將核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)移進入細胞。產(chǎn)生復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的方 案(包括步驟：將外源核酸材料摻入質(zhì)粒；用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細胞系；通過該包裝細胞系產(chǎn)生 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒；從組織培養(yǎng)基中收集病毒顆粒；和用該病毒顆粒感染靶細胞)是本領域熟 知的。
[0029] 將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因治療的優(yōu)勢在于：病毒將編碼靶蛋白質(zhì)的核酸序列插入 宿主細胞基因組，從而允許該編碼靶蛋白質(zhì)的核酸序列在細胞分裂時被傳遞到該細胞的子 代。LTR區(qū)域中的啟動子序列可以增強插入的編碼序列在多種細胞類型中的表達。
[0030] 另一個可用作細胞轉(zhuǎn)化的表達載體的病毒候選者是腺病毒（Ad)，所述腺病毒是雙 鏈DNA病毒。腺病毒對寬范圍的細胞類型(包括，例如，肌肉和內(nèi)皮細胞)具有感染性。腺病 毒是具有36kb基因組的雙鏈線形DNA病毒。腺病毒的若干特征已使其可作為轉(zhuǎn)基因遞送 載體用于治療應用，如促進體內(nèi)基因遞送。重組腺病毒載體已顯示能夠在原位將基因有效 轉(zhuǎn)移至多種器官(包括：肺、腦、胰腺、膽囊和肝）的實質(zhì)細胞。這已允許了將這些載體用于 治療遺傳性基因疾病(如囊性纖維化）的方法，其中可將載體遞送到靶器官。
[0031] 與逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣，腺病毒基因組適合用作基因治療的表達載體，即，通過移除控 制該病毒自身的產(chǎn)生的遺傳信息。因為腺病毒在染色體外發(fā)揮作用，所以重組腺病毒沒有 理論上的插入誘變問題。
[0032] 傳統(tǒng)上已使用若干方法生成重組腺病毒。一種方法涉及將含有目標核酸序列的限 制性內(nèi)切酶片段直接連接至該腺病毒基因組的部分?；蛘?，可通過同源重組結(jié)果將目標核 酸序列插入到有缺陷的腺病毒中。通過篩選在互補細胞菌苔上生成的個體菌斑以鑒定所期 望的重組。
[0033] 合適的載體的例子包括：DNA病毒(例如，腺病毒)、慢病毒、腺相關病毒（AAV)、 脊髓灰質(zhì)炎病毒、HSV、或基于莫洛尼鼠的病毒載體，源自哈維肉瘤病毒（HarveySarcoma virus)、勞氏肉瘤病毒（ROUSSarcomavirus)、MPSV的病毒載體，或基于復合轉(zhuǎn)座子的載 體。在一個實施方案中，該載體是AAV。AAV是細小病毒科家族的小型非致病性病毒。AAV 有別于該家族其他成員的地方在于其復制依賴于輔助病毒。該約5kb的AAV基因組由正 或負極性的單鏈DNA區(qū)段組成。該基因組的末端為短的反向末端重復序列，所述反向末端 重復序列可以折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并充作病毒DNA復制的起點。從物理上，該細小病毒病毒粒 子是非包膜的并且其二十面體衣殼的直徑為約20nm。
[0034] 到目前為止，已經(jīng)從人類或靈長類識別和分離出許多在血清學上有差異的AAV。例 如，AAV2的基因組長度為4680個核苷酸并且包含兩個開放閱讀框（0RF)。左側(cè)的0RF編碼 非結(jié)構(gòu)性的Rep蛋白質(zhì)：Rep40、Rep52、Rep68和Rep78,所述Rep蛋白質(zhì)在產(chǎn)生單鏈子 代基因組之外還涉及復制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。R印68/78也已顯示出具備NTP結(jié)合活性以及DNA 和RNA解旋酶活性。Rep蛋白質(zhì)具有核定位信號以及若干潛在的磷酸化位點。在這些激酶 位點之一的突變導致了復制活性的喪失。
[0035] 該基因組的末端為短的反向末端重復序列（ITR)，所述反向末端重復序列具有折 疊成T-狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)以充作病毒DNA復制的起點的潛力。在該ITR區(qū)域內(nèi)，已經(jīng)描述了對 ITR的功能至關重要的兩個元件：GAGC重復基序和末端分解位點（trs)。已表明：當ITR為 線形或發(fā)夾構(gòu)象時，該重復基序結(jié)合R印。此結(jié)合用于位置R印68/78在trs處的裂解，所 述裂解以位點和鏈特異性的方式發(fā)生。AAV載體具有若干特征使其成為用于基因轉(zhuǎn)移的有 吸引力的載體，所述特征如：具有寬廣的宿主范圍、能夠在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導分裂和非分裂細 胞、并且能夠維持經(jīng)轉(zhuǎn)導基因的高水平表達。
[0036] 在某些實施方案中，該病毒載體為AAV載體。"AAV"載體是指腺相關病毒，并且可 用于指代天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。除了另行要求之處，該術(shù)語覆蓋所有的 亞型、血清型和假型，并覆蓋天然存