本發(fā)明涉及編碼共有前列腺蛋白及其片段的核酸分子；改進的前列腺癌疫苗、改進的用于誘導(dǎo)針對前列腺癌細胞的免疫反應(yīng)的方法、改進的用于預(yù)防性和/或治療性免疫個體以抗前列腺癌的方法。

發(fā)明背景

前列腺癌是重要治療免疫靶。免疫治療法的發(fā)展非常復(fù)雜，因為需要開發(fā)能夠誘導(dǎo)強免疫反應(yīng)，包括優(yōu)選CTL反應(yīng)的免疫原。

已研究了直接施用核酸序列以針對動物和人疾病接種疫苗，并且許多努力集中在核酸遞送的有效和高效方法，以產(chǎn)生期望的抗原的必需表達，從而導(dǎo)致免疫原性反應(yīng)和最終該技術(shù)的成功。

DNA疫苗具有許多優(yōu)于常規(guī)接種法例如活減毒病毒和基于重組蛋白質(zhì)的疫苗的概念上的有利方面。DNA疫苗是安全的，穩(wěn)定的，容易產(chǎn)生的，并且在人中可被良好地耐受的，臨床前試驗顯示幾乎無質(zhì)粒整合的證據(jù)[Martin,T.,等人,質(zhì)粒DNA瘧疾疫苗:肌內(nèi)注射后基因組整合的潛能.Hum Gene Ther,1999.10(5):第759-68頁；Nichols,W.W.,等人,至宿主基因組內(nèi)的潛在DNA疫苗整合.Ann N Y Acad Sci,1995.772:第30-9頁]。此外，DNA疫苗因疫苗的效力不受預(yù)先存在的針對載體的抗體滴度的影響的事實而十分適合重復(fù)施用[Chattergoon,M.,J.Boyer和D.B.Weiner,基因免疫：疫苗和免疫治療劑的新紀(jì)元.FASEB J,1997.11(10):第753-63頁]。然而，DNA疫苗的臨床采用的一個主要障礙一直以來為當(dāng)轉(zhuǎn)移至更大的動物時平臺 的免疫原性減弱[Liu,M.A.和J.B.Ulmer,質(zhì)粒DNA疫苗的人臨床試驗.Adv Genet,2005.55:第25-40頁]。DNA疫苗免疫原的工程的最近技術(shù)進展例如密碼子最優(yōu)化、RNA最優(yōu)化和免疫球蛋白前導(dǎo)序列的添加已提高了DNA疫苗的表達和免疫原性[Andre,S.,等人,通過利用具有最優(yōu)化的密碼子選擇的合成gp120序列進行DNA接種引發(fā)的增強的免疫反應(yīng).J Virol,1998.72(2):第1497-503頁；Deml,L.,等人,密碼子選擇最優(yōu)化對編碼人免疫缺陷病毒1型Gag蛋白DNA候選疫苗的表達和免疫原性的多重效應(yīng).J Virol,2001.75(22):第10991-1001頁；Laddy,D.J.,等人,基于共有序列的抗禽流感新型DNA疫苗的免疫原性.Vaccine,2007.25(16):第2984-9頁；Frelin,L.,等人,密碼子最優(yōu)化和mRNA擴增有效地增強丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)3/4A基因的免疫原性.Gene Ther,2004.11(6):第522-33頁]。

質(zhì)粒遞送系統(tǒng)的最近技術(shù)進步已提高了DNA疫苗的表達和免疫原性，包括技術(shù)例如電穿孔[Hirao,L.A.,等人,通過電穿孔進行的真皮內(nèi)/皮下免疫提高了質(zhì)粒疫苗在豬和獼猴中的遞送和潛能.Vaccine,2008.26(3):第440-8頁；Luckay,A.,等人,質(zhì)粒DNA疫苗設(shè)計和體內(nèi)電穿孔對獼猴中所得的疫苗特異性免疫反應(yīng)的效應(yīng).J Virol,2007.81(10):第5257-69頁；Ahlen,G.,等人,體內(nèi)電穿孔通過增加的局部DNA攝入增強丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)3/4A DNA的免疫原性、蛋白質(zhì)表達、炎癥和CD3+T細胞的浸潤.J Immunol,2007.179(7):第4741-53頁]。

此外，研究已表明共有免疫原的使用可以能夠相較于單獨的天然抗原增加細胞免疫反應(yīng)的寬度(breadth)[Yan,J.,等人,由基于工程HIV-1亞型B共有序列的包膜DAN疫苗引發(fā)的增強的細胞免疫反應(yīng).Mol Ther,2007.15(2):第411-21頁；Rolland,M.,等人,人免疫缺陷病毒1型蛋白的祖先樹中心的構(gòu)建和功能.J Virol,2007.81(16):第8507-14頁]。然而，應(yīng)承認(rèn)打破癌癥抗原的免疫耐受性和產(chǎn)生自身免疫是癌癥疫苗的主要障礙。

仍然需要編碼前列腺癌抗原的核酸構(gòu)建體和用于誘導(dǎo)抗前列腺癌抗原的免疫反應(yīng)，從而打破免疫耐受性的組合物。仍然存在對經(jīng)濟有效的抗前列腺癌的有效的預(yù)防性和治療。

優(yōu)選實施方案的概述

本發(fā)明的方面包括包含編碼一種或多種蛋白質(zhì)的編碼序列的核酸分子，所述蛋白質(zhì)選自：a)SEQ ID NO:2；與SEQ ID NO:2具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:2的至少256個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:2的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；b)SEQ ID NO:4；與SEQ ID NO:4具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:4的至少274個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:4的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275保守的；c)SEQ ID NO:6；與SEQ ID NO:6具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:6的至少735個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:6的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；d)SEQ ID NO:8；與SEQ ID NO:8具有至少98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:8的至少752個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:8的免疫原性片段， 只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；e)SEQ ID NO:10；與SEQ ID NO:10具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:10的至少333個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:10的免疫原性片段；f)SEQ ID NO:12；與SEQ ID NO:12具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:12的至少349個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:12的免疫原性片段；g)SEQ ID NO:14；與SEQ ID NO:14具有98％的同源性的蛋白質(zhì)或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:14的至少129個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:14的免疫原性片段；或h)連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的信號肽；具有連接至與SEQ ID NO:14的氨基酸19-131具有98％的同源性的氨基酸序列的信號肽的蛋白質(zhì)；或具有連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的免疫原性片段的信號肽、包含SEQ ID NO:14的至少110個氨基酸殘基并且連接至信號肽的片段的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，核酸分子選自編碼蛋白質(zhì)a)、b)、c)或d)的核酸分子。

在另一個方面，本發(fā)明包括治療經(jīng)診斷患有前列腺癌的個體的方法，所述方法包括給個體施用本文中描述的核酸分子。

在另一個方面，提供了蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自：a)SEQ ID NO:2；與SEQ ID NO:2具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:2的至少261個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:2的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；b)SEQ ID NO:4；與SEQ ID NO:4具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:4的至少274個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:4的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:4 的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275保守的；c)SEQ ID NO:6；與SEQ ID NO:6具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:6的至少735個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:6的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；d)SEQ ID NO:8；與SEQ ID NO:8具有至少98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:8的至少752個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:8的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；e)SEQ ID NO:10；與SEQ ID NO:10具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:10的至少333個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:10的免疫原性片段；f)SEQ ID NO:12；與SEQ ID NO:12具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:12的至少349個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:12的免疫原性片段；g)SEQ ID NO:14；與SEQ ID NO:14具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:14的至少129個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:14的免疫原性片段；或h)連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的信號肽；具有連接至與SEQ ID NO:14的氨基酸19-131具有98％的同源性的氨基酸序列的信號肽的蛋白質(zhì)；或具有連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的免疫原性片段的信號肽、包含SEQ ID NO:14的至少110個氨基酸殘基并且連接至信號肽的片段的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)選自蛋白質(zhì)a)、b)、c)或d)。

本發(fā)明的一些方面包括治療經(jīng)診斷患有前列腺癌的個體的方法， 包括給所述個體遞送本文中描述的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的其它方面是包含本文中提供的核酸分子和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。

附圖概述

圖1顯示來自被進行以確認(rèn)PSA和PSMA抗原的表達的體外翻譯的結(jié)果。

圖2A顯示細胞免疫原性數(shù)據(jù)。PSA抗原的細胞免疫原性通過干擾素-γELISpot來進行測定。

圖2B顯示細胞免疫原性數(shù)據(jù)。PSA抗原的細胞免疫原性通過干擾素-γELISpot來進行測定。

圖3A-C顯示利用流式細胞術(shù)，通過展示顯示PSA特異性(左圖框)、PSMA特異性(中間圖框)和總的疫苗特異性(右圖框)細胞因子產(chǎn)生的圖表表征的CD4+T細胞反應(yīng)：產(chǎn)生IFNγ的CD4+T細胞％(圖3A)；產(chǎn)生IL-2的細胞CD4+T的％(圖3B)；和產(chǎn)生TNFα的CD4+T細胞％(圖3C)。

圖4A-C顯示利用流式細胞術(shù)，通過展示顯示PSA特異性(左圖框)、PSMA特異性(中間圖框)和總的疫苗特異性(右圖框)細胞因子產(chǎn)生的圖表表征的CD8+T細胞反應(yīng)：產(chǎn)生IFNγ的CD8+T細胞％(圖4A)；產(chǎn)生IL-2的CD8+T細胞％(圖4B)；和產(chǎn)生TNFa的CD8+T細胞％(圖4C)。

圖5A-B顯示在最終的免疫后一周PSA特異性抗體的ELISA數(shù)據(jù)，PSA特異性IgG血清轉(zhuǎn)化。(圖5A)PSA IgG終點滴度。(圖5B)代表性IgG滴定曲線。

詳細描述

本文中提供了前列腺蛋白質(zhì)的共有序列和編碼它們，特別地前列 腺抗原前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺抗原的六跨膜上皮細胞抗原(STEAP)和前列腺特異性干細胞抗原(PSCA)的分離的核酸分子。

本文中描述的前列腺癌抗原是來源于跨多個物種(包括疫苗所靶向的物種)的同源抗原的庫的共有序列。應(yīng)基于系統(tǒng)發(fā)生樹(phylogenic tree)上物種的距離接近來選擇將來自其的抗原序列對齊以形成共有序列的選擇的物種，例如，智人(人)、獼猴(恒河猴)和食蟹猴(食蟹猴(cynomolgus monkey))。共有抗原與天然前列腺抗原不完全相同但具有相近的同一性，其序列共有至少85％，優(yōu)選90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。此類描述的共有癌癥抗原能夠打破被靶向物種的耐受性(或引起自身免疫)并且產(chǎn)生有效的抗前列腺癌抗原免疫反應(yīng)。本文中提供了產(chǎn)生基于共有癌癥抗原的DNA疫苗的方法。

本發(fā)明的方面包括包含編碼一種或多種蛋白質(zhì)的編碼序列的核酸分子，所述蛋白質(zhì)選自：a)SEQ ID NO:2；與SEQ ID NO:2具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:2的至少256個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:2的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；b)SEQ ID NO:4；與SEQ ID NO:4具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:4的至少274個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:4的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275保守的；c)SEQ ID NO:6；與SEQ ID NO:6具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:6的至少735個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:6的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；d)SEQ ID NO:8；與SEQ ID NO:8具有至少98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:8的至少752個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:8的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；e)SEQ ID NO:10；與SEQ ID NO:10具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:10的至少333個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:10的免疫原性片段；f)SEQ ID NO:12；與SEQ ID NO:12具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:12的至少349個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:12的免疫原性片段；g)SEQ ID NO:14；與SEQ ID NO:14具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:14的至少129個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:14的免疫原性片段；或包含SEQ ID NO:14的至少129個氨基酸殘基的SEQ ID NO:14的免疫原性片段；或h)連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的信號肽；具有連接至與SEQ ID NO:14的氨基酸19-131具有98％的同源性的氨基酸序列的信號肽的蛋白質(zhì)；或具有連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的免疫原性片段的信號肽、包含SEQ ID NO:14的至少110個氨基酸殘基并且連接至信號肽的片段的蛋白質(zhì)。公開了PSA的兩個共有蛋白質(zhì)序列：PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:2)和PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:4)。公開了PSMA的兩個共有蛋白質(zhì)序列：PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:6)和PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:8)。公開了STEAP(在本文中也稱為STEAP1)的兩個共有蛋白質(zhì)序列：STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:10)和STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:12)。公開了PSCA的一個共有蛋白質(zhì)序列：PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:14)。SEQ ID NO:14包括IgE信號肽。在一些實施方案中，PSCA共有抗原可包括連接至除SEQ ID NO:14的IgE信號外的信號序列的SEQ ID NO:14的氨基酸19-131。在一些實施方案中，核酸分子選自編碼上述蛋白質(zhì)a)、b)、c)或d)的核酸分子。在其它實施方案中，核酸分子是編碼一種或多種蛋白質(zhì)的核酸分子，所述核酸分子選自：選自編碼蛋白質(zhì)a)或b)的核酸分子的至少一種，和選自編碼蛋白質(zhì)c)或d)的核酸分子的至少一種。

核酸分子還可以是編碼一種或多種蛋白質(zhì)的分子，所述蛋白質(zhì)選自：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12；或SEQ ID NO:14；優(yōu)選地，SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。在一些實施方案中，核酸分子可以是編碼一種或多種蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)選自：選自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的至少一種，和選自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的至少一種。

在另一個方面，提供了蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自：a)SEQ ID NO:2；與SEQ ID NO:2具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:2的至少256個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:2的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的；b)SEQ ID NO:4；與SEQ ID NO:4具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:4的至少274個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:4的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275保守的；c)SEQ ID NO:6；與SEQ ID NO:6具有98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:6的至少735個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:6的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的；d)SEQ ID NO:8；與SEQ ID NO:8具有至少98％的同源性的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:8的至少752個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:8的免疫原性片段，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的；e)SEQ ID NO:10；與SEQ ID NO:10具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:10的至少333個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:10的免疫原性片段；f)SEQ ID NO:12；與SEQ ID NO:12具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:12的至少349個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:12的免疫原性片段；g)SEQ ID NO:14；與SEQ ID NO:14具有98％的同源性的蛋白質(zhì)；或包含相應(yīng)于SEQ ID NO:14的至少129個氨基酸殘基的氨基酸的SEQ ID NO:14的免疫原性片段；或h)連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的信號肽；具有連接至與SEQ ID NO:14的氨基酸19-131具有98％的同源性的氨基酸序列的信號肽的蛋白質(zhì)；或具有連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的免疫原性片段的信號肽、包含SEQ ID NO:14的至少110個氨基酸殘基并且連接至信號肽的片段的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)選自：蛋白質(zhì)a)、b)、c)或d)。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)編碼一種或多種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其選自：選自蛋白質(zhì)a)或b)的至少一種，和選自蛋白質(zhì)c)或d)的至少一種。

蛋白質(zhì)還可以是選自SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14；優(yōu) 選地，SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)可以是選自如下蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)：選自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的至少一種，和選自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8至少一種。

核酸編碼序列已被產(chǎn)生來提高和最優(yōu)化表達。此類核酸分子中使用的密碼子被選擇來產(chǎn)生具有減少的因分子內(nèi)雜交而導(dǎo)致的二級結(jié)構(gòu)形成的RNA。公開了編碼PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:1)和PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:3)的核酸序列。同樣地，提供了PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的核苷酸1-2250)和PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2301)以及STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:9)、STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:11)和PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:13)的核酸編碼序列。還提供了與SEQ ID NO:1具有98％的同源性，并且編碼PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:2)或與SEQ ID NO:2具有高達98％的同源性的蛋白質(zhì)(優(yōu)選包括SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248)的核酸序列，和與SEQ ID NO:3具有98％的同源性，并且編碼PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:4)或與SEQ ID NO:4具有高達98％的同源性的蛋白質(zhì)(優(yōu)選包括SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275)的核酸序列。同樣地，與SEQ ID NO:5的核苷酸2250具有至少98％的同源性，并且編碼PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:6)或與SEQ ID NO:6的具有高達98％的同源性的蛋白質(zhì)(優(yōu)選包括SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734)的核酸序列，或與SEQ ID NO:7的核苷酸2301具有98％的同源性，并且編碼PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:8)或與SEQ ID NO:8具有高達98％的同源性的蛋白質(zhì)(優(yōu)選包括SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751)的核酸序列，以及與SEQ ID NO 9具有98％的同源性，并且編碼STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:10)或與SEQ ID NO:10具有高達98％的同源性的蛋白質(zhì)的核苷酸，與SEQ ID NO:11具有98％的同源性，并且編碼STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:12)或與SEQ ID NO:12具有高達98％的同源性的蛋白質(zhì)的核苷酸，以及與SEQ ID NO:13具有98％的同源性，并且編碼PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:14)或與SEQ ID NO:14具有高達98％的同源性的蛋白質(zhì)核苷酸。在一些實施方案中，核酸分子編碼包含IgE信號肽的蛋白質(zhì)(例如，編碼SEQ ID NO:4的SEQ ID NO:3；編碼SEQ ID NO:8的SEQ ID NO:7的核苷酸1-2301；編碼SEQ ID NO:12的SEQ ID NO:11和編碼SEQ ID NO:14的SEQ ID NO:13)。

包含含有本文中提供了的分離的核酸分子的編碼序列的核酸分子的組合物可用于誘導(dǎo)針對前列腺蛋白的免疫反應(yīng)(當(dāng)施用至動物體內(nèi)時)。包含此類核酸序列的一個或多個的組合物可用作疫苗或疫苗組分來預(yù)防性或治療性引發(fā)對前列腺癌的免疫。同樣地，當(dāng)施用至動物體內(nèi)時，包含共有蛋白質(zhì)的組合物可用于誘導(dǎo)針對前列腺蛋白的免疫反應(yīng)。包含含有本文中提供的分離的核酸分子的編碼序列的核酸分子的組合物的組合可用于誘導(dǎo)針對前列腺蛋白的免疫反應(yīng)，并且可一起用作疫苗或疫苗組分來預(yù)防性或治療性地引發(fā)針對前列腺癌的免疫。同樣地，當(dāng)施用至動物體內(nèi)時，包含共有蛋白質(zhì)的組合物可用于誘導(dǎo)針對前列腺蛋白的免疫反應(yīng)。包含此類共有蛋白質(zhì)的一種或多種的組合物可用作疫苗或疫苗組分來預(yù)防性或治療性引發(fā)針對前列腺癌的免疫。

提供了包含本文中提供了的核酸序列的疫苗。在一些實施方案中，提供了包含編碼一種或多種選自如下抗原的共有前列腺抗原的核酸序列的疫苗：共有PSA抗原1、共有PSA抗原2、共有PSMA抗原1、共有PSMA抗原2、共有STEAP抗原1、共有STEAP抗原2和共有PSCA。提供了使用編碼一種或多種前列腺抗原的核酸序列誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，所述前列腺抗原選自：共有PSA抗原1、共有PSA抗原2、共有PSMA抗原1、共有PSMA抗原2、共有STEAP抗原1、共有STEAP抗原2和共有PSCA。

還提供了包含共有PSA抗原1、共有PSA抗原2、共有PSMA抗原1、共有PSMA抗原2、共有STEAP抗原1、共有STEAP抗原2和共有PSCA的一種或多種的疫苗。還提供了使用共有PSA抗原1、共有PSA抗原2、共有PSMA抗原1、共有PSMA抗原2、共有STEAP抗原1、共有STEAP抗原2和共有PSCA的一種或多種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法。

提供了保護個體免受前列腺癌或治療已被鑒定為患有前列腺癌的個體的方法。方法包括步驟：給所述個體施用有效量的包含一種或多種本文中提供的核酸分子的一種或多種核酸分子。在一些方法中，通過靶向組織或接受核酸分子的組織的電穿孔來促進核酸分子的遞送。核酸序列在個體的細胞中表達，誘導(dǎo)針對由核酸序列編碼的前列腺蛋白的免疫反應(yīng)。

1.定義

本文中使用的術(shù)語僅為了描述具體的實施方案而并非旨在限制。如說明書和所附權(quán)利要求中所用的，除非另外明確地指出，否則單數(shù)形式“一個/一種(a)”、“一個/一種(an)”和“該/所述(the)”包括復(fù)數(shù)所指物。

對于本文中數(shù)值范圍的引述，明確地包括相同精度的介于其間的每一個介入數(shù)字。例如，對于6-9的范圍，除了6和9以外還包括數(shù)字7和8，對于6.0-7.0的范圍，明確地包括數(shù)字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

a.佐劑

如本文中所用，“佐劑”意指添加中至本文中描述的DNA質(zhì)粒疫苗以增強由DNA質(zhì)粒和下文中描述的編碼核酸序列編碼的抗原的免 疫原性的任何分子。

b.抗體

如本文中所用，“抗體”意指種類IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗體或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和單鏈抗體、雙鏈抗體(diabody)、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物?？贵w可以是從哺乳動物的血清樣品分離的抗體、多克隆抗體、親和純化的抗體或其混合物，所述抗體顯示充足的對期望的表位或來源于其的序列的結(jié)合特異性。

c.編碼序列

如本文中所用，“編碼序列”或“編碼核酸”意指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列還可包括有效地連接至能夠在核酸被施用至的個體或哺乳動物的細胞中指導(dǎo)表達的調(diào)控元件(包括啟動子和多腺苷酸化信號)的起始和終止信號。

d.互補

如本文中所用，“互補”或“互補的”意指可進行核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的沃爾森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦堿基配對(Hoogsteen base pairing)的核酸。

e.共有或共有序列

如本文中所用，“共有”或“共有序列”意指基于特定前列腺抗原的多個亞型的比對的分析的多肽序列?？芍苽渚幋a共有多肽序列的核酸序列?？蓪泄灿行蛄械牡鞍踪|(zhì)和/或編碼此類蛋白質(zhì)的核酸分子的疫苗用于誘導(dǎo)針對特定前列腺抗原的廣泛免疫。

f.電穿孔

如本文中可互換使用的，“電穿孔”、“電透化(electro-permeabilization)”或“電動強化(electro-kinetic enhancement)”(“EP”)意指使用跨膜電場脈沖在生物膜中誘導(dǎo)微觀路徑(孔)；它們的存在允許生物分子例如質(zhì)粒、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子和水從細胞膜的一側(cè)穿過至另一側(cè)。

g.片段

如本文中對于核酸序列所用的，“片段”意指編碼能夠引發(fā)哺乳動物的免疫反應(yīng)，與全長前列腺抗原交叉反應(yīng)的多肽的核酸序列或其部分。片段可以是選自各種核苷酸序列的至少一種的DNA片段，所述核苷酸序列編碼共有氨基酸序列和包含此類序列的構(gòu)建體。DNA片段可包含免疫球蛋白前導(dǎo)序列例如IgE或IgG序列的編碼序列。DNA片段可編碼下文中所示的蛋白質(zhì)片段。

關(guān)于多肽序列的“片段”意指能夠引發(fā)哺乳動物的免疫反應(yīng)的多肽，所述多肽與前列腺抗原(包括例如PSA、PSMA、STEAP和PSCA)交叉反應(yīng)。

人PSA序列為約261個氨基酸。PSA共有抗原1的片段可包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，優(yōu)選98％或99％的SEQ ID NO:2，只要片段包含氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248的一個或多個。PSA共有抗原1的片段可包含SEQ ID NO:2的255、256、257、258、259或260個氨基酸，但優(yōu)選256個氨基酸或更多個氨基酸。PSA共有抗原2的片段可包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，優(yōu)選98％或99％的SEQ ID NO:4，只要片段包括氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275的一個或多個。PSA共有抗原2的所有此類片段還可任選地排除氨基酸1-17。在一些實施方案中，PSA共有抗原2的片段可任選地包括氨基酸1-17的一個或多個，以及來自氨基酸18至氨基酸278的氨基酸的一個或多個，PSA 共有抗原2的片段還可包括SEQ ID NO:4的255、256、257、258、259或260個氨基酸，但優(yōu)選274個氨基酸或更多個氨基酸。

人PSMA序列為約749-750個氨基酸。PSMA共有抗原1的片段可包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，優(yōu)選98％或99％的SEQ ID NO:6，只要片段包括氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734的一個或多個。PSMA共有抗原1的片段可包含SEQ ID NO:6的745、746、747、748或749個氨基酸，但優(yōu)選735個氨基酸或更多個氨基酸。PSMA共有抗原2的片段可包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，優(yōu)選98％或99％的SEQ ID NO:8，只要片段包括氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751的一個或多個。PSA共有抗原2的所有此類片段還可任選地排除氨基酸1-17。在一些實施方案中，PSA共有抗原2的片段可任選地包含氨基酸1-17的一個或多個以及來自氨基酸18至氨基酸767的氨基酸的一個或多個，PSMA共有抗原2的片段還可包括SEQ ID NO:8的761、762、763、764、765或766個氨基酸，但優(yōu)選752個氨基酸或更多個氨基酸。

人STEAP序列為約339個氨基酸。共有STEAP序列可包含免疫球蛋白前導(dǎo)序列例如IgE或IgG的氨基酸序列。共有STEAP抗原2在位置1上包含18個氨基酸前導(dǎo)序列以替代甲硫氨酸。PSMA共有抗原2的片段可包含前導(dǎo)序列和至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，優(yōu)選98％或99％的SEQ ID NO:12的氨基酸18-356。PSMA共有抗原1的片段可包含SEQ ID NO:12的氨基酸1-350、1-351、1-352、1-353、1-354或1-355。

人PSCA序列為約114個氨基酸。共有STEAP序列可包含免疫球蛋白前導(dǎo)序列例如IgE或IgG的氨基酸序列。共有PSCA抗原在位置1上包含18個氨基酸前導(dǎo)序列以替代甲硫氨酸。PSCA共有抗原 的片段可包含前導(dǎo)序列和至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，優(yōu)選98％或99％的SEQ ID NO:14的氨基酸18-131。PSMA共有抗原1的片段可包含SEQ ID NO:14的氨基酸1-125、1-126、1-127、1-128、1-129或1-130。

h.基因構(gòu)建體

如本文中所用，術(shù)語“基因構(gòu)建體”是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列包括有效地連接至能夠在核酸分子所施用至的個體的細胞中指導(dǎo)表達的調(diào)控元件(包括啟動子和多腺苷酸化信號)的起始和終止信號。如本文中所用，術(shù)語“可表達形式”是指包含有效地連接至編碼蛋白質(zhì)的編碼序列的必需調(diào)控元件(以便當(dāng)存在于個體的細胞中時可表達編碼序列)的基因構(gòu)建體。

i.同源性

使用ClustalW(DNA或蛋白質(zhì)的一般性目的多序列比對程序)產(chǎn)生多序列比對的同源性和系統(tǒng)發(fā)育圖(phylogram)。

j.同一的

如本文中所用，“同一的”或“同一性”，在兩個或更多個核酸或多肽序列的背景中，意指序列具有指定百分比的在指定的區(qū)域上為相同的殘基。可如下計算百分比：最佳地對齊兩個序列，在指定的區(qū)域上比較兩個序列，測定兩條序列中在其上存在相同殘基的位置的數(shù)目，以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以指定的區(qū)域中位置的總數(shù)，然后將結(jié)果乘以100來產(chǎn)生序列同一性的百分比。在其中兩個序列具有不同長度或比對產(chǎn)生一個或多個交錯末端以及指定的比較區(qū)域僅包括單個序列的情況下，將單個序列的殘基包括在計算的分母中而非分子中。當(dāng)比較DNA與RNA時，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可被認(rèn)為是等同的?？赏ㄟ^人工或使用計算機序列算法例如BLAST或BLAST 2.0來計算同一性。

k.免疫反應(yīng)

如本文中所用，“免疫反應(yīng)”意指宿主免疫系統(tǒng)例如哺乳動物的免疫系統(tǒng)響應(yīng)抗原例如前列腺共有抗原的引入的活化。免疫反應(yīng)可以以細胞或體液反應(yīng)或兩者的形式存在。

l.核酸

如本文中所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共價連接在一起的至少兩個核苷酸。單鏈的描述也確定了互補鏈的序列。因此，核酸還包括描述的單鏈的互補鏈。核酸的許多變體可用于與給定的核酸相同的目的。因此，核酸還包括大體上同一的核酸及其互補序列。單鏈提供了可在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴(yán)格雜交條件下雜交的探針。

核酸可以是單鏈或雙鏈的，或可包含雙鏈和單鏈序列的部分。核酸可以是DNA(基因組DNA和cDNA)、RNA或雜交體，其中核酸可包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及堿基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥嘌呤)的組合。核酸可通過化學(xué)合成法或通過重組法獲得。

m.有效連接的

如本文中所用，“有效連接的”意指基因的表達處于在空間上與其連接的啟動子的控制之下。啟動子可位于處于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。啟動子與基因之間的距離可與啟動子所源自的基因中啟動子與其控制的基因之間的距離大致相同。如在本領(lǐng)域中是已知的，該距離的變化可被調(diào)節(jié)而不喪失啟動子功能。

n.啟動子

如本文中所用，“啟動子”意指能在細胞中夠賦予核酸的表達、激 活或增強所述表達的合成或天然來源的分子。啟動子可包括一個或多個特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列來進一步增強所述基因的表達和/或改變其空間表達和/或時間表達。啟動子還可包括遠端增強子或阻遏物元件，所述元件可位于遠離轉(zhuǎn)錄起始位點多達數(shù)千個堿基對。啟動子可來源于包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲和動物的來源。啟動子對于其中發(fā)生表達的細胞、組織或器官或?qū)τ诒磉_發(fā)生所處的發(fā)育階段，或響應(yīng)外界刺激例如生理應(yīng)激、病原體、金屬離子或誘導(dǎo)劑，可組成型地或差異地調(diào)節(jié)基因組件(gene component)的表達。啟動子的代表性實例包括噬菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、lac操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或SV40早期啟動子和CMV IE啟動子。

o.嚴(yán)格雜交條件

如本文中所用，“嚴(yán)格雜交條件”意指在其下第一核酸序列(例如，探針)將與第二核酸序列(例如，靶)例如在核酸的復(fù)雜混合物中雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同的環(huán)境中是不同的。嚴(yán)格條件可經(jīng)選擇比確定離子強度pH下特定序列的熱解鏈溫度(Tm)約5-10℃。Tm可以是(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)50％的與靶互補的探針與靶序列平衡雜交時所處的溫度(當(dāng)靶序列過量存在時，在Tm下，50％的探針被平衡地占據(jù))。嚴(yán)格條件可以是這樣的條件，其中在pH 7.0至8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子，例如約0.01-1.0M的鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度為至少約30℃(對于短探針，例如約10-50個核苷酸)和至少約60℃(對于長探針，例如，大于約50個核苷酸)。嚴(yán)格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號可以為本底雜交的至少2至10倍。示例性嚴(yán)格雜交條件包括下列：50％的甲酰胺、5x SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5x SSC，1％SDS，在65℃下孵育，在65℃下于0.2x SSC和0.1％SDS中洗滌。

p.大體上互補

如本文中所用，“大體上互補”意指第一序列與第二序列的互補序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070或更多個核苷酸或氨基酸的區(qū)域范圍內(nèi)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或兩個序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。

q.大體上同一的

如本文中所用，“大體上同一的”意指第一序列與第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070或更多個核苷酸或氨基酸的區(qū)域范圍內(nèi)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或就核酸而言，第一序列與第二序列的互補序列大體上互補的情況。

r.亞型或血清型

如本文中所用，“亞型”或“血清型”可互換使用，當(dāng)提及前列腺癌抗原時，意指前列腺癌抗原的遺傳變體(genetic variant)，以便一個亞型(或變體)被免疫系統(tǒng)識別而與不同亞型分開。

s.變體

如本文中所用，關(guān)于核酸的“變體”意指(i)參照核酸序列的部分或片段；(ii)參照核苷酸序列或其部分的互補序列；(iii)與參照核酸或其互補序列大體上同一的核酸；或(iv)在嚴(yán)格條件下與參照核酸、其互 補序列或與其大體上同一的序列雜交的核酸。

“變體”是指在氨基酸序列上差異在于氨基酸的插入、缺失或保守置換但保持至少一種生物活性的肽或多肽。變體還可意指其氨基酸序列與參考的蛋白質(zhì)的氨基酸序列大體上同一的蛋白質(zhì)，其保留至少一種生物活性。氨基酸的保守置換，即用具有相似性質(zhì)(例如，親水性、帶電荷區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本領(lǐng)域通常被認(rèn)為包括小的變化。這些小的變化可部分地通過考慮氨基酸的親水指數(shù)來鑒定，如本領(lǐng)域中所理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的親水指數(shù)基于其疏水性和電荷的考慮。在本領(lǐng)域中已知具有相似親水指數(shù)的氨基酸可被置換并且仍然保留蛋白質(zhì)功能。在一個方面，具有±2的親水指數(shù)的氨基酸被置換。氨基酸的親水性還可用于揭示可產(chǎn)生保留生物功能的蛋白質(zhì)的置換。在肽的上下文中氨基酸的親水性的考慮允許計算該肽的最大局部平均親水性，已報道與抗原性和免疫原性相關(guān)的有用的測量。美國專利No.4,554,101，通過引用整體并入本文。具有相似親水性值的氨基酸的置換可產(chǎn)生保留生物活性例如免疫原性的肽，這在本領(lǐng)域中是被理解的?？衫镁哂性凇?內(nèi)的親水性值的氨基酸彼此進行置換。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值受該氨基酸的具體側(cè)鏈影響。與該觀察一致，應(yīng)理解與生物功能相容的氨基酸置換依賴于氨基酸的相對相似性，特別地所述所氨基酸的側(cè)鏈的相對相似性，如通過疏水性、親水性、電荷、大小和其它性質(zhì)顯示的。

t.載體

如本文中所用，“載體”意指包含復(fù)制起點的核酸序列。載體可以是載體、噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以是自主復(fù)制的染色體外載體，優(yōu)選為DNA質(zhì)粒。

2.共有前列腺抗原

本文提供了能夠引發(fā)哺乳動物的針對前列腺抗原的免疫反應(yīng)的共有抗原。共有抗原可包含使得它們成為可對其誘導(dǎo)針對前列腺癌細胞的特別有效的免疫原的表位。共有前列腺抗原可包含全長翻譯產(chǎn)物、其變體、其片段或其組合。

已設(shè)計了七種不同的共有前列腺抗原。所述共有前列腺抗原中的兩種是共有PSA抗原1(SEQ ID NO:2)和共有PSA抗原2(SEQ ID NO:4)。所述共有前列腺抗原中的兩種是共有PSMA抗原1(SEQ ID NO:6)和共有PSMA抗原2(SEQ ID NO:8)。所述共有前列腺抗原中的兩種是是共有STEAP抗原1(SEQ ID NO:10)和共有STEAP抗原2(SEQ ID NO:12)。所述共有前列腺抗原中的一種是共有PSCA抗原(SEQ ID NO:14)。蛋白質(zhì)可包含與前列腺抗原同源的序列、前列抗原的片段以及具有與前列腺抗原的片段同源的序列的蛋白質(zhì)。

共有PSA抗原1(SEQ ID NO:2)與人PSA序列具有約91％的同源性，與食蟹猴PSA具有約95％的同源性以及與獼猴PSA具有約96％的同源性。共有PSA抗原1與人PSA序列差異在于SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248。

共有PSA抗原2(SEQ ID NO:4)與人PSA序列具有約90-91％的同源性，與食蟹猴PSA具有約95％的同源性以及與獼猴PSA具有約95％的同源性。共有PSA抗原2在其N末端具有前導(dǎo)序列。共有PSA抗原2還與人PSA序列差異在于SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275。

共有PSMA抗原1(SEQ ID NO:6)與人PSMA序列具有約96％的同源性，與獼猴PSMA具有約94％的同源性。共有PSMA抗原1與人PSMA序列差異在于SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734。

共有PSMA抗原2(SEQ ID NO:8)與人PSA序列具有約96％的同源性，與獼猴PSA具有約94％的同源性。共有PSMA抗原2在其N末端包含前導(dǎo)序列。共有PSMA抗原2還與人PSA序列差異在于SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751。

共有STEAP抗原1(SEQ ID NO:10)與一些人STEAP序列具有約94％的同源性，與其它人STEAP序列具有約99％的同源性。共有STEAP抗原1(SEQ ID NO:10)還與獼猴PSMA具有約94％的同源性。

共有STEAP抗原2(SEQ ID NO:12)與人STEAP序列具有約88％的同源性，與其它人STEAP序列具有約94％的同源性。共有STEAP抗原2(SEQ ID NO:12)還與獼猴PSMA具有約94％的同源性。共有STEAP抗原2在其N末端包含前導(dǎo)序列。

共有PSCA抗原(SEQ ID NO:14)與人PSCA具有約87％的同源性。共有PSCA抗原(SEQ ID NO:14)與人PSCA差異在于在其N末端包含前導(dǎo)序列。

蛋白質(zhì)可具有與PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:2)、PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:4)、PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:6)、PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:8)、STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:10)、STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:12)或PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:14)具有98％的同源性的序列。

蛋白質(zhì)可具有與PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:2)、PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:4)、PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:6)、PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:8)、STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:10)、STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:12)或PSCA共有抗原序 列(SEQ ID NO:14)具有99％的同源性的序列。

如上文中所指出的，一些實施方案在N末端上包含前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列是為SEQ ID NO:16的IgE前導(dǎo)序列。在本文中提供的蛋白質(zhì)序列的一些實施方案中，從其上除去SEQ ID NO:16。同樣地，在本文中提供的核酸序列的一些實施方案中，從其上除去SEQ ID NO:15(其編碼SEQ ID NO:16)。

因此，一些實施方案涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10以替代所述權(quán)利要求中所示的N末端甲硫氨酸(信號肽的編碼序列通常包括編碼N末端甲硫氨酸的起始密碼子)的信號肽。一些實施方案涉及包含連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的信號肽的蛋白質(zhì)。一些實施方案涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至與SEQ ID NO:2具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的。一些實施方案涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至與SEQ ID NO:6具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的。一些實施方案涉及包含連接至與SEQ ID NO:10具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽的蛋白質(zhì)，在其中信號肽以其N末端連接的每一種情況下，其被連接以替代所述權(quán)利要求中所示的N末端甲硫氨酸(信號肽的編碼序列通常包括編碼N末端甲硫氨酸的起始密碼子)。一些實施方案涉及包含連接至與SEQ ID NO:14的氨基酸19-131具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽的蛋白質(zhì)。一些實施方案涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:2的免疫原性片段(包含相應(yīng)于SEQ ID NO:2的至少256個氨基酸殘基的氨基酸)的信號肽，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的。一些實施方案涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:6的免疫原性片段(包含相應(yīng)于SEQ ID NO:6的至少735個氨基酸殘基 的氨基酸)的信號肽，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的。一些實施方案涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:10的免疫原性片段(包含相應(yīng)于SEQ ID NO:10的至少333個氨基酸殘基的氨基酸)的信號肽。一些實施方案涉及蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至具有連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的免疫原性片段、包含SEQ ID NO:14的至少110個氨基酸殘基的片段的信號肽的蛋白質(zhì)的信號肽。

3.基因序列、構(gòu)建體和質(zhì)粒

產(chǎn)生編碼共有氨基酸序列的核酸分子以最優(yōu)化在人中的穩(wěn)定性和表達?；诔渌酝?，最小化分子內(nèi)相互作用和二級結(jié)構(gòu)的形成以及使用導(dǎo)致提高的表達的密碼子來確定密碼子選擇。疫苗可包含一種或多種核酸序列，所述核酸序列編碼選自該組產(chǎn)生來最優(yōu)化在人中的穩(wěn)定性和表達的序列的免疫原性蛋白質(zhì)的共有形式的一種或多種形式。產(chǎn)生在最優(yōu)化的共有編碼核酸序列的5’末端包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列的核酸序列，所述核酸序列編碼在共有氨基酸序列的N末端具有IgE前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，編碼IgE前導(dǎo)序列的核酸序列是SEQ ID NO:15。

提供了核酸序列，所述核酸序列編碼PSA共有抗原序列1(蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:2；核酸序列SEQ ID NO:1)、PSA共有抗原序列2(蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:4；核酸序列SEQ ID NO:3)、PSMA共有抗原序列1(蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:6；具有SEQ ID NO:5的核苷酸1-2250的核酸序列)、PSMA共有抗原序列2(蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:8；具有SEQ ID NO:7的核苷酸1-2301的核酸序列)、STEAP共有抗原序列1(蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:10；核酸序列SEQ ID NO:9)、STEAP共有抗原序列2(蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:12；核酸序列SEQ ID NO:11)或PSCA共有抗原序列(蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:14；核酸序列SEQ ID NO:13)。除PSMA編碼核苷酸外，編碼PSMA共有抗原序列1的核酸序列SEQ ID NO:5還包含正好在終止密碼子前的額外9個密碼子(27個核苷酸)，其編碼HA標(biāo)記(SEQ ID NO:32)，未顯示于SEQ ID NO:6中。HA標(biāo)記是相應(yīng)于用于除其它以外蛋白質(zhì)表達的檢測(使用商購可得的抗-HA標(biāo)記抗體進行的)的流感表位(influenza epitope)的肽序列。SEQ ID NO:5編碼SEQ ID NO:6和以其N末端連接至SEQ ID NO:6的C末端的額外9個氨基酸的序列SEQ ID NO:32。在一些實施方案中，PSMA-1共有抗原由SEQ ID NO:5編碼，并且包含具有以其C末端連接至SEQ ID NO:32的N末端的SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，PSMA-1共有抗原由SEQ ID NO:5的核苷酸1-2250編碼，并且包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。具有SEQ ID NO:5的核苷酸1-2250的編碼序列在其3’末端具有一個或多個終止密碼子。除編碼連接至PSMA的IgE信號的核苷酸外，編碼PSMA共有抗原序列2的核酸序列SEQ ID NO:7還包含蛋白質(zhì)和正好在終止密碼子之前的額外9個密碼子(27個核苷酸)，所述9個密碼子編碼HA標(biāo)記(SEQ ID NO:32)，未顯示于SEQ ID NO:8中。SEQ ID NO:7編碼SEQ ID NO:8和以其N末端連接至SEQ ID NO:8的C末端的額外9個氨基酸的序列SEQ ID NO:32。在一些實施方案中，PSMA-2共有抗原由SEQ ID NO:7編碼并且包括具有以其C末端連接至SEQ ID NO:32的N末端的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，PSMA-2共有抗原由SEQ ID NO:7的核苷酸1-2301編碼，并且包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。具有SEQ ID NO:7的核苷酸1-2301的編碼序列在其3’末端具有一個或多個終止密碼子。

分離的核酸分子可編碼具有與PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:2)具有98％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的，具有與PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:4)具有98％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275是保守的，具有與PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:6)具有98％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的，具有與PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:8)具有98％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的，具有與STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:10)、與STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:12)或與PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:14)具有98％的同源性的序列的蛋白質(zhì)。

分離的核酸分子可編碼具有與PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:2)具有99％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的，具有與PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:4)具有99％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:4的氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271和275是保守的，具有與PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:6)具有99％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的，具有與PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:8)具有99％的同源性的序列的蛋白質(zhì)，只要SEQ ID NO:8的氨基酸21、31、32、49、64、75、96、128、174、240、337、367、492、516、565、586、630、641、670、677、680、750和751是保守的，具有與STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:10)、與STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:12)或與PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:14)具有99％的同源性的序列的蛋白質(zhì)。

分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有與編碼PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:1)、PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:3)、PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:5或優(yōu)選SEQ ID NO:5的核苷酸1-2250)、PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:7或優(yōu)選SEQ ID NO:7的核苷酸1-2301)、STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:9)、STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:11)或PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:13)的序列具有98％的同源性的序列。

分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有與編碼PSA共有抗原序列1(SEQ ID NO:1)、PSA共有抗原序列2(SEQ ID NO:3)、PSMA共有抗原序列1(SEQ ID NO:5或優(yōu)選SEQ ID NO:5的核苷酸1-2250)、PSMA共有抗原序列2(SEQ ID NO:7或優(yōu)選SEQ ID NO:7的核苷酸1-2301)、STEAP共有抗原序列1(SEQ ID NO:9)、STEAP共有抗原序列2(SEQ ID NO:11)或PSCA共有抗原序列(SEQ ID NO:13)的序列具有99％的同源性的序列。

分離的核酸分子可編碼在N末端包含前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，核酸分子可編碼為SEQ ID NO:16的IgE前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10以替代所述權(quán)利要求中所示的N末端甲硫氨酸的信號肽(信號肽的編碼序列通常包括編碼N末端甲硫氨酸的起始密碼子)。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼包含連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的信號肽的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至與SEQ ID NO:2具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至與SEQ ID NO:6具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的。在一些實施方案中，分離的核酸序列可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至與SEQ ID NO:10具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽。在其中提供信號肽的編碼序列的情況下，將信號肽連接至肽序列以替代顯示的 序列中所示的N末端甲硫氨酸(信號肽的編碼序列通常包括編碼N末端甲硫氨酸的起始密碼子)。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至與SEQ ID NO:14的氨基酸19-131具有98％的同源性的蛋白質(zhì)的信號肽。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:2的免疫原性片段(包含相應(yīng)于SEQ ID NO:2的至少256個氨基酸殘基的氨基酸)的信號肽，只要SEQ ID NO:2的氨基酸69、78、80、82、102、110、137、139、165、189、203、220、232和248是保守的。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:6的免疫原性片段(包含相應(yīng)于SEQ ID NO:6的至少735個氨基酸殘基的氨基酸)的信號肽，只要SEQ ID NO:6的氨基酸14、15、32、47、58、79、111、157、223、320、350、475、499、569、613、624、653、660、663、733和734是保守的。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至SEQ ID NO:10的免疫原性片段(包含相應(yīng)于SEQ ID NO:10的至少333個氨基酸殘基的氨基酸)的信號肽。在一些實施方案中，分離的核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至具有連接至SEQ ID NO:14的氨基酸19-131的免疫原性片段、包含SEQ ID NO:14的至少110個氨基酸殘基的信號肽的蛋白質(zhì)的信號肽。

本文中提供了可包含核酸序列的基因構(gòu)建體，所述核酸序列編碼本文中公開的共有前列腺抗原，包括共有蛋白質(zhì)序列、與共有蛋白質(zhì)序列具有同源性的序列、共有蛋白質(zhì)序列的片段和與共有蛋白質(zhì)序列的片段同源的序列?；驑?gòu)建體可作為具有功能的染色體外分子存在于細胞中?；驑?gòu)建體可以是線性微型染色體(minichromosome)，包括著絲粒、端?；蛸|(zhì)粒或粘粒。

基因構(gòu)建體還可以是重組病毒載體(重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組痘苗病毒)的基因組的部分?；驑?gòu)建體可以是減毒活微生物中的遺傳材料的部分或活在細胞中的重組微生物載體。

基因構(gòu)建體可包含用于核酸的編碼序列的基因表達的調(diào)控元件。調(diào)控元件可以是啟動子、增強子、起始密碼子、終止密碼子或多腺苷酸化信號。

核酸序列可組成可以是載體的基因構(gòu)建體。載體可以能夠在哺乳動物的細胞中以有效地引發(fā)哺乳動物的免疫反應(yīng)的量表達抗原。載體可以是重組的。載體可包含編碼抗原的異源核酸。載體可以是質(zhì)粒。載體可用于利用編碼抗原的核酸轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的宿主細胞，在其中可表達抗原的條件下維持所述細胞。

在一些實施方案中，在單個載體上提供單個共有前列腺抗原的編碼序列。在一些實施方案中，在單個載體上提供多個共有前列腺抗原的編碼序列。在一些實施方案中，提供了在多個載體上包含多個共有前列腺抗原(每載體一個抗原或每載體多個抗原)的編碼序列的組合物。

在一些實施方案中，可在單個載體上提供兩個或更多個不同共有前列腺抗原的編碼序列。在一些實施方案中，編碼序列可具有分開的控制表達的啟動子。在一些實施方案中，編碼序列可具有單個控制表達的啟動子和分開編碼序列的IRES序列。IRES序列的存在導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分開翻譯。在一些實施方案中，編碼序列可具有單個控制表達的啟動子和編碼分開抗原的編碼序列的蛋白水解切割肽序列的編碼序列。產(chǎn)生單個翻譯產(chǎn)物，該產(chǎn)物隨后被識別蛋白酶切割位點的蛋白酶加工，以產(chǎn)生分開的蛋白質(zhì)分子。使用的蛋白酶切割位點通常被內(nèi)源地存在于其中表達發(fā)生的細胞中的蛋白酶識別。在一些實施方案中，可包括分開的蛋白酶的編碼序列以提供加工多蛋白翻譯產(chǎn)物所需的蛋白酶的產(chǎn)生。在一些實施方案中，載體包含1、2、3、4、5、6或全部7個共有前列腺抗原的編碼序列。

在本文中所示的每一個和每一種情況下，可最優(yōu)化編碼序列的穩(wěn)定性和高表達水平。在一些情況下，選擇密碼子以減少RNA的二級 結(jié)構(gòu)形成(例如因分子內(nèi)鍵合而形成的)。

載體可包含編碼抗原的異源核酸并且還可包含起始密碼子，其可位于抗原編碼序列的上游，和終止密碼子，其可位于抗原編碼序列的下游。起始和終止密碼子可與抗原編碼序列在讀框內(nèi)。載體還可包含有效地連接至抗原編碼序列的啟動子。有效地連接至抗原編碼序列的啟動子可以是來自猿猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子、莫洛尼病毒啟動子、禽類白血病病毒(ALV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子例如CMV早早期啟動子、EB病毒(EBV)啟動子或勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子。啟動子還可以是來自人基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或人金屬硫蛋白的啟動子。啟動子還可以是組織特異性啟動子，例如肌肉或皮膚特異性啟動子，天然或合成的。此類啟動子的實例描述于美國專利申請公布no.US20040175727，將其內(nèi)容通過引用整體并入本文。

載體還可包含多聚腺苷酸化信號，其可在共有前列腺抗原編碼序列的下游。多聚腺苷酸化信號可以是SV40多聚腺苷酸化信號、LTR多聚腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)多聚腺苷酸化信號、人生長激素(hGH)多聚腺苷酸化信號或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信號。SV40多聚腺苷酸化信號可以是來自pCEP4載體的多聚腺苷酸化信號(茵維特羅根，圣地亞哥，加利福尼亞州)。

載體還可在共有前列腺抗原編碼序列的上游包含增強子。增強子可以是DNA表達所必需的。增強子可以是人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或病毒增強子例如來自CMV、HA、RSV或EBV的增強子。在美國專利No.5,593,972、5,962,428和WO94/016737(將每一個專利的內(nèi)容通過引用整體并入本文)中描述了多核苷酸功能增強。

載體還可包含哺乳動物復(fù)制起點以便在細胞中使載體保持于染色體外并且產(chǎn)生多個載體的拷貝。質(zhì)粒可以是來自茵維特羅根(圣地亞哥，加利福尼亞州)的pVAX1、pCEP4或pREP4，其可包含EB病毒復(fù)制起點和核抗原EBNA-1編碼區(qū)，其可產(chǎn)生高拷貝游離型復(fù)制而不整合。載體的主鏈可以是pAV0242。載體可以是復(fù)制缺陷型腺病毒5型(Ad5)載體。

載體還可包含良好地適應(yīng)于在向其施用了載體的哺乳動物或人細胞中的基因表達的調(diào)控序列。共有前列腺抗原編碼序列可包含可允許在宿主細胞中更高效地轉(zhuǎn)錄編碼序列的密碼子。

載體可以是pSE420(茵維特羅根，圣地亞哥，加利福尼亞州)，其可用于在大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體還可以是pYES2(茵維特羅根，圣地亞哥，加利福尼亞州)，其可用于在酵母的釀酒酵母株系中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體還可以具有MAXBAC^TM完全桿狀病毒表達系統(tǒng)(茵維特羅根，圣地亞哥，加利福尼亞州)，其可用于在昆蟲細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體還可以是pcDNA I或pcDNA3(茵維特羅根，圣地亞哥，加利福尼亞州)，其可用于在哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體可以是通過常規(guī)技術(shù)和可容易獲得的起始材料，包括Sambrook等人,分子克隆和實驗室手冊，第2版，冷泉港(1989)(將所述手冊通過引用整體并入本文)，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的表達載體或系統(tǒng)。

疫苗可包含本文中顯示的前列腺抗原的一種或多種和/或疫苗可包含編碼選自該組的共有前列腺抗原的一種或多種的一種或多種核酸序列。疫苗可包含與本文中顯示的共有前列腺抗原的一種或多種與具有除本文中描述的共有序列外(包括天然序列)的序列的其它免疫原性前列腺蛋白的組合，和/或疫苗可包含編碼選自該組的共有前列腺抗原的一種或多種的一種或多種核酸序列與編碼具有除本文中描述的共有序列外的序列的其它前列腺抗原的核酸分子的組合。

然而不受科學(xué)理論束縛，可用于引發(fā)廣泛地針對前列腺癌細胞的免疫反應(yīng)(體液、細胞或兩者)的疫苗可包含下列核酸序列的一種或多種，所述核酸序列編碼一種或多種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自：共有PSA抗原1、共有PSA抗原2、共有PSMA抗原1、共有PSMA抗原2、共有STEAP抗原1、共有STEAP抗原2和共有PSCA抗原1。編碼序列還可包括本文中提供的包含同源序列、片段以及片段的同源序列的那些編碼序列。

一些實施方案提供了產(chǎn)生針對前列腺癌細胞的免疫反應(yīng)的方法，包括給個體施用一種或多種共同包含一種或多種本文中描述的編碼序列或組合的組合物。一些實施方案提供了給個體預(yù)防性接種前列腺癌疫苗的方法，包括施用一種或多種共同包含一種或多種本文中描述的編碼序列或組合的組合物。一些實施方案提供了治療性接種患有前列腺癌的個體的方法，所述方法包括施用一種或多種共同包含一種或多種本文中描述的編碼序列或組合的組合物。

4.藥物組合物

本文中提供了根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其包含約1納克至約10mg的DNA。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含：1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100納克，或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多；和2)高達并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100納克，高達并且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或高達并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約10mg的DNA。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約25納克至約5mg的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約50納克至約1mg的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約0.1至約500微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約1至約350微克的DNA。 在一些實施方案中，藥物組合物包含約5至約250微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約10至約200微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約15至約150微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約20至約100微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約25至約75微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約30至約50微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約35至約40微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約10微克至約100微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約20微克至約80微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約25微克至約60微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約30納克至約50微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約35納克至約45微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約0.1至約500微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約1至約350微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約25至約250微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA。

根據(jù)待使用的施用模式配制根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在其中藥物組合物是可注射藥物組合物的情況下，它們是無菌、無熱原和無顆粒的。優(yōu)選使用等滲制劑。一般而言，用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情況下，等滲溶液例如磷酸鹽緩沖鹽溶液是優(yōu)選的。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中，將血管收縮劑添加至制劑中。

優(yōu)選地藥物組合物是疫苗，更優(yōu)選是DNA疫苗。

疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗可包含多種相同或不同的包含一種或多種共有前列腺抗原的核酸編碼序列的質(zhì)粒。DNA疫苗可包含編碼一種或多種共有前列腺抗原的一種或多種核酸序列。當(dāng)DNA疫苗包含超過一種共有前列腺抗原的編碼序列時，所有此類序列可存 在于單個質(zhì)粒上，或每一個這樣的序列可存在于不同質(zhì)粒上。

在一些實施方案中，疫苗可包含與共有前列腺抗原的一種或多種組合的編碼共有前列腺抗原的一種或多種的核酸序列。

DNA疫苗公開于美國專利No.5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594(將所述美國專利通過引用整體并入本文)中。DNA疫苗還可包含抑制其整合進入染色體的元件或試劑。疫苗可以是前列腺抗原的RNA?？蓪NA疫苗引入細胞。

疫苗可以是包含上述基因構(gòu)建體或抗原的重組疫苗。疫苗還可包含以一種或多種蛋白質(zhì)亞單位形式存在的一種或多種共有前列腺抗原，或包含一種或多種共有前列腺抗原的一種或多種減毒病毒顆粒。減毒疫苗可以是減毒的活疫苗、殺死的疫苗和使用重組載體遞送編碼一種或多種共有前列腺抗原的外來基因的疫苗，以及亞單位和糖蛋白疫苗。減毒活疫苗、使用重組載體遞送前列腺抗原的疫苗、亞單位疫苗和糖蛋白疫苗的實例描述于美國專利No.:4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,3 64；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529(將所述專利各自通過引用并入本文)中。

提供的疫苗可用于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，包括治療性或預(yù)防性免疫反應(yīng)?？僧a(chǎn)生針對共有前列腺抗原的抗體和/或殺傷T細胞?？煞蛛x此類抗體和細胞。

疫苗還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是功能性分子如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的賦 形劑可以是轉(zhuǎn)染促進劑，其可包含表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物，包括單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰肽、醌類似物、小囊泡(vesicles)例如角鯊烯和角鯊烯、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒或其它已知的轉(zhuǎn)染促進劑。

轉(zhuǎn)染促進劑為聚陰離子、聚陽離子，包括多聚L-谷氨酸(LGS)或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促進劑為聚L-谷氨酸鹽，更優(yōu)選聚L-谷氨酸鹽以低于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn)染促進劑還可包括表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物，包括單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰肽、醌類似物和小囊泡例如角鯊烯和角鯊烯，并且也可將透明質(zhì)酸與基因構(gòu)建體一同施用。在一些實施方案中，DNA載體疫苗還可包含轉(zhuǎn)染促進劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體，包括作為DNA-脂質(zhì)體混合物的卵磷脂脂質(zhì)體或其它本領(lǐng)域已知的脂質(zhì)體(參見例如W09324640)、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒或其它已知的轉(zhuǎn)染促進劑。優(yōu)選，轉(zhuǎn)染促進劑為聚陰離子、聚陽離子，包括聚L谷氨酸鹽(LGS)或脂質(zhì)。疫苗中轉(zhuǎn)染劑的濃度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。

藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是佐劑。佐劑可以是在替代質(zhì)粒中表達的其它基因，或作為蛋白質(zhì)與疫苗中的上述質(zhì)粒一起遞送。佐劑可選自：α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)，γ-干擾素、血小板源性生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達趨化因子(TECK)、粘膜相關(guān)上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15，MHC、CD80、CD86(包括具有缺失的信號序列以及任選地包括來自IgE的信號肽的IL-15)。佐劑可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其組合。

可以是有用的佐劑的其它基因包括編碼如下物質(zhì)的基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素應(yīng)答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配體、Ox40、Ox40配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能性片段。

疫苗還可包含1994年4月1日提交的美國序列No.021,579(將其通過引用整體并入本文)中描述的基因疫苗促進劑。

5.遞送方法

本文中提供了用于遞送藥物制劑，優(yōu)選疫苗，以提供包含表位的共有抗原的基因構(gòu)建體和共有前列腺抗原的方法，所述表位使得所述共有前列腺抗原成為可對其誘導(dǎo)針對前列腺癌細胞的免疫反應(yīng)的特別有效的免疫原?？商峁┻f送疫苗或接種的方法以誘導(dǎo)治療性和/或預(yù)防性免疫反應(yīng)。疫苗可被遞送至個體以調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫系統(tǒng)的活性和增強免疫反應(yīng)。

在將疫苗遞送入哺乳動物后，從而將載體遞送至所述哺乳動物的細胞，轉(zhuǎn)染的細胞將表達和分泌相應(yīng)的前列腺共有蛋白質(zhì)。此類分泌的蛋白質(zhì)或合成抗原將被免疫系統(tǒng)識別，這將引起免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)可包括：針對抗原產(chǎn)生的抗體和特異性針對抗原的T細胞免疫 反應(yīng)。在一些實例中，利用本文中論述的疫苗接種的哺乳動物將具有已接觸抗原的免疫系統(tǒng)?？蓪⒁呙邕f送至個體以調(diào)節(jié)個體的免疫系統(tǒng)的活性，從而增強免疫反應(yīng)。

可以以DNA疫苗的形式遞送疫苗，遞送DNA疫苗的方法描述于美國專利No.4,945,050和5,036,006(將所述兩個專利通過引用并入本文)中。

可給哺乳動物施用疫苗以引發(fā)哺乳動物的免疫反應(yīng)。哺乳動物可以為人、非人靈長類動物、母牛、豬、綿羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、?？苿游?、鹿、刺猬、象、美洲駝、羊駝、小鼠、大鼠或雞，優(yōu)選為人、母牛、豬或雞。

a.聯(lián)合治療

可將藥物組合物，優(yōu)選疫苗與一種或多種其它前列腺蛋白質(zhì)或基因組合施用?？蓪⒁呙缗c蛋白質(zhì)或編碼佐劑的基因組合施用，所述佐劑包括：α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)，γ-干擾素、IL-12、IL-15，IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素應(yīng)答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配體、Ox40、Ox40配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1或TAP2或其功能性片段。

b.施用途徑

可通過不同途徑包括口服、胃腸外、舌下、經(jīng)皮膚、經(jīng)直腸、經(jīng)粘膜、局部、通過吸入、通過頰部施用、胸膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜內(nèi)以及關(guān)節(jié)內(nèi)或其組合施用疫苗。對于獸醫(yī)學(xué)使用，可按照正常的獸醫(yī)學(xué)操作將組合物作為適當(dāng)?shù)乜山邮艿闹苿┦┯?。獸醫(yī)可容易地確定最適合于特定動物的給藥方案和施用途徑?？衫贸Ｒ?guī)注射器、無針注射設(shè)備、“微粒轟擊基因槍(microprojectile bombardment gone gun)”或其它物理方法例如電穿孔(“EP”)、“水動力學(xué)法”或超聲施用疫苗。

可利用幾種公知的技術(shù)將疫苗的載體遞送至哺乳動物，所述技術(shù)包括利用和不利用體內(nèi)電穿孔的DNA注射(也稱為DNA接種)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的、納米顆粒促進的重組載體例如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組疫苗。前列原抗原可通過DNA注射結(jié)合體內(nèi)電穿孔來遞送。

c.電穿孔

可使用電穿孔設(shè)備來實現(xiàn)通過疫苗的質(zhì)粒的電穿孔施用疫苗，所述電穿孔設(shè)備可被有構(gòu)造成將有效地引起可逆的孔在細胞膜上形成的能量脈沖遞送至哺乳動物的期望的組織，并且在一些實施方案中能量脈沖是與由用戶預(yù)設(shè)的電流輸入相似的恒定電流。

在其中使用電穿孔的一些實施方案中，電穿孔設(shè)備可包括電穿孔組件和電極部件或操作部件(handle assembly)。電穿孔組件可包括和整合電穿孔設(shè)備的各種元件中的一個或多個元件，包括：控制器、電流波形發(fā)生器、阻抗檢測器、波形記錄器、輸入元件、狀態(tài)報告元件、通信端口、存儲器組件(memory component)、電源和電源開關(guān)。電穿 孔可使用體內(nèi)電穿孔設(shè)備例如EP系統(tǒng)(因諾維制藥公司，布魯貝爾，賓夕法尼亞州)或Elgen電穿孔儀(因諾維制藥公司，布魯貝爾，賓夕法尼亞州)來實現(xiàn)以有利于質(zhì)粒對細胞的轉(zhuǎn)染。

電穿孔組件可用作電穿孔設(shè)備的一個元件，并且其它元件是與電穿孔組件連通的獨立元件(或組件)。電穿孔組件可用作電穿孔設(shè)備的超過一個的元件，其可與電穿孔設(shè)備的與電穿孔組件分開的其它元件連通。作為一個電機或機器設(shè)備的部件存在的電穿孔設(shè)備的元件可以不受限制，因為所述元件可用作一個設(shè)備或用作彼此連通的獨立元件。電穿孔組件可以能夠遞送在期望的組織中產(chǎn)生恒定電流并且包括反饋機制的能量脈沖。電極部件可包括在空間排列中具有多個電極的電極陣列，其中電極部件接收來自電穿孔組件的能量脈沖并且將所述能量脈沖通過電極遞送至期望的組織。多個電極的至少一個在能量脈沖的遞送過程中是中性的并且測量期望組織的阻抗，將阻抗通信至電穿孔組件。反饋機制可接收測量的阻抗并且可調(diào)整通過電穿孔組件遞送的能量脈沖以維持恒定電流。

多個電極可以以分散模式遞送能量脈沖。多個電極可通過在編程序列下控制電極來以分散模式遞送能量脈沖，并且所述編程序列由用戶輸入至電穿孔組件。編程序列可包括多個按順序遞送的脈沖，其中利用至少兩個有源電極(一個中性電極測量阻抗)遞送多個脈沖的每一個脈沖，并且其中利用至少兩個有源電極(一個中性電極測量阻抗)中的不同電極遞送多個脈沖的后續(xù)脈沖。

反饋機制可利用硬件或軟件來進行。反饋機制可通過模擬閉環(huán)電路來進行。反饋每50μs、20μs、10μs或1μs發(fā)生一次，但優(yōu)選是實時反饋或瞬時反饋(即，大體上同時，如通過用于測定反應(yīng)時間的可獲得的技術(shù)測定的)。中性電極可測量期望的組織中的阻抗和將阻抗通信至反饋機制，并且反饋機制對阻抗作出反應(yīng)并且調(diào)整能量脈沖以將恒定電流維持在與預(yù)設(shè)電流相似的值上。反饋機制可在能量脈沖的遞送過程中連續(xù)和即時地維持恒定電流。

可促進本發(fā)明的DNA疫苗遞送的電穿孔設(shè)備和電穿孔方法的實例包括在Draghia-Akli等人的美國專利No.7,245,963、Smith等人提交的美國專利公布2005/0052630(將所述專利和專利公布的內(nèi)容通過引用整體并入本文)中所述的那些設(shè)備和方法。可用于促進DNA疫苗遞送的其它電穿孔設(shè)備和電穿孔方法包括提供于2007年10月17日提交的共同未決和共同擁有的美國專利申請序列No.11/874072中的那些設(shè)備和方法，所述美國專利申請系列根據(jù)35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美國臨時申請序列No.60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982的權(quán)益，將全部所述美國臨時申請序列通過引用整體并入本文。

Draghia-Akli等人的美國專利No.7,245,963描述了標(biāo)準(zhǔn)電極系統(tǒng)及其在用于促進生物分子導(dǎo)入體內(nèi)或植物的選定組織的細胞中的用途。標(biāo)準(zhǔn)電極系統(tǒng)可包含多個針電極；皮下針；提供從可編程恒定電流脈沖控制器向多個針電極的導(dǎo)電性連接的電插頭；和電源。操作員可握住固定在承載結(jié)構(gòu)上的多個針電極并牢固地將其插入至體內(nèi)或植物的選定組織。然后生物分子經(jīng)由皮下針遞送至選定的組織。激活可編程恒定電流脈沖控制器并將恒定電流電脈沖施加至多個針電極。施加的恒定電流電脈沖促進生物分子導(dǎo)入至多個電極之間的細胞。將美國專利No.7,245,963的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

由Smith等人提交的美國專利公布2005/0052630描述了可用于有效地促進生物分子導(dǎo)入體內(nèi)或植物的選定組織的細胞的電穿孔設(shè)備。所述電穿孔設(shè)備包含由軟件或固件規(guī)定其操作的電動設(shè)備(“EKD設(shè)備”)。EKD設(shè)備基于使用者控制和脈沖參數(shù)的輸入在陣列的電極之間產(chǎn)生一系列可編碼恒定電流脈沖模式，并允許存儲和獲得電流波形數(shù)據(jù)。電穿孔設(shè)備還包括具有針電極陣列的可更換的電極盤、注射針用中心注射通道和可移動導(dǎo)向盤。將美國專利公布2005/0052630的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

美國專利No.7,245,963和美國專利公布2005/0052630中所述的 電極陣列和方法不僅可適用于深穿透至組織例如肌肉，而且可適用于深穿透至其它組織或器官。由于電極陣列的構(gòu)造，注射針(用于遞送所選生物分子)也可被完全插入靶標(biāo)器官，并在由電極所預(yù)描繪的區(qū)域，垂直于所述靶組織進行注射。美國專利No.7,245,963和美國專利公布2005/005263中所述的電極優(yōu)選為20mm長和21規(guī)(gauge)。

此外，在一些實施方案中包括了并入的電穿孔設(shè)備以及其用途，電穿孔設(shè)備有下述專利中所述的那些設(shè)備：1993年12月28日公布的美國專利5,273,525、2000年8月29日公布的美國專利6,110,161、2001年7月17日公布的6,261,281和2005年10月25日公布的6,958，060以及2005年9月6日公布的美國專利6,939,862。此外，涵蓋主題的專利提供于2004年2月24日公布的美國專利6,697,669，其涉及使用多種設(shè)備的任一種遞送DNA，和2008年2月5日公布的美國專利7,328,064，其描繪了本文包括的注射DNA的方法。將上述專利通過引用整體并入本文。與本文中描述的癌癥抗原一起使用的電穿孔裝置的另一個實施方案是Elgen EP設(shè)備(因諾維制藥公司，布魯貝爾，賓夕法尼亞州)。

d.制備疫苗的方法

本文中提供了用于制備包含本文中論述的DNA疫苗的DNA質(zhì)粒的方法。在最終亞克隆入哺乳動物表達質(zhì)粒的步驟后，可使用本領(lǐng)域已知的方法將DNA質(zhì)粒用于在大規(guī)模發(fā)酵罐中接種細胞培養(yǎng)物。

可使用已知設(shè)備和技術(shù)的組合配制或制備與本發(fā)明的EP設(shè)備一起使用的DNA質(zhì)粒，但優(yōu)選使用在2007年5月23日提交的批準(zhǔn)的共同未決的美國臨時申請美國序列No.60/939,792中描述的最優(yōu)化質(zhì)粒制備技術(shù)制備它們。在一些實施例中，可以以大于或等于10mg/mL的濃度配制這些研究中使用的DNA質(zhì)粒。除了美國序列No.60/939，792中描述的設(shè)備和方案(包括2007年7月3日發(fā)布的批準(zhǔn)的專利美國專利No.7,238,522中描述的設(shè)備和方案)外，制備技術(shù)還包括或整 合對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說通常是已知的各種設(shè)備和方案。通過將上述申請和專利(分別地美國序列No.60/939,792和美國專利No.7,238,522)通過引用整體并入本文。

實施例

在下列實施例中進一步對本發(fā)明進行了舉例說明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例雖然表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅以舉例說明的方式給出。根據(jù)上文中的論述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的基本特征，并且在不背離其精神和范圍下，可對本發(fā)明進行各種改變和變動以使之適合于各種用法和條件。因此，根據(jù)上述說明，除了本文中顯示和描述的變動外的本發(fā)明的各種變動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很顯然的。此類變動也意欲落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。.

實施例1

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的可獲得的全長人和獼猴序列設(shè)計PSA和PSMA的共有免疫原，所述數(shù)據(jù)庫先前描述于Laddy,D.J.,Yan,J.,Corbitt,N.,Kobasa,D.,Kobinger,G.P.,Weiner,D.B.(2007).針對禽流感的基于共有序列的新型DNA疫苗的免疫原性.25,2984-2989，和Laddy,D.J.,Yan,J.,Kutzler,M.,Kobasa,D.,Kobinger,G.P.,Khan,A.S.,Greenhouse,J.,Sardesai,N.Y.,Draghia-Akli,R.,Weiner,D.B.(2008).通過合成的共有DNA抗原的體內(nèi)電穿孔進行的針對病原性人和禽流感病毒的異亞型保護作用.PLoS ONE.3,e2517.中。

通過GeneScript(皮斯卡塔韋，新澤西州)合成共有抗原序列。將HA標(biāo)記包括在抗原序列的C末端。最優(yōu)化抗原序列在人中的mRNA穩(wěn)定性和密碼子選擇。將最終的序列克隆入pVAX1載體(茵維特羅根，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)的BamHI與XhoI位點之間。

產(chǎn)生共有PSA抗原1(SEQ ID NO:2)。將包含261個氨基酸的該序列與表1中所示的每一個PSA序列相比較。使用的PSA序列包括 兩個人序列、來自食蟹猴的序列和來自獼猴的序列。表1包括用于與共有PSA抗原1(SEQ ID NO:2)比較的每一個序列的SEQ ID NO:和登錄號。

表1

產(chǎn)生智人(SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)、獼猴(SEQ ID NO:20)和食蟹猴(SEQ ID NO:19)PSA序列與共有PSA抗原1(SEQ ID NO:2)的多重序列比對。KLK3(激肽釋放酶3)是編碼PSA的基因并且以PSA為假名。PSA抗原1與智人全長PSA蛋白質(zhì)序列具有91％的同源性，與獼猴全長PSA蛋白質(zhì)序列具有96％的同源性，以及與食蟹猴全長PSA蛋白質(zhì)序列具有95％的同源性。

實施例2

產(chǎn)生共有PSA抗原2(SEQ ID NO:4)。將包含包括IgE前導(dǎo)序列的279個氨基酸的該序列與表2中所示的每一個PSA序列相比較。使用的PSA序列包括兩個人序列、來自食蟹猴的序列和來自獼猴的序列。表2包括用于與共有PSA抗原2(SEQ ID NO:4)比較的每一個序列的SEQ ID NO:和登錄號。

表2

產(chǎn)生智人(SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)、獼猴(SEQ ID NO:21)和食蟹猴(SEQ ID NO:19)PSA序列與共有PSA抗原1(SEQ ID NO:4)的多重序列比對。KLK3(激肽釋放酶3)是編碼PSA的基因并且以PSA為假名。PSA抗原1與智人全長PSA蛋白序列具有90-91％的同源性，與食蟹猴全長PSA蛋白序列具有95％的同源性，以及與獼猴部分PSA蛋白序列具有95％的同源性。

實施例3

產(chǎn)生共有PSMA抗原1(SEQ ID NO:6)。將包含750個氨基酸的該序列與表3中所示的每一個PSMA序列相比較。使用的PSMA序列包括兩個人序列和來自獼猴的序列。表3包括用于與共有PSMA抗原1(SEQ ID NO:6)比較的每一個序列的SEQ ID NO:和登錄號。

表3

產(chǎn)生智人和獼猴PSMA序列與PSMA抗原1的多重序列比對。PSMA抗原1共有序列(SEQ ID NO:6)與智人PSMA蛋白序列(SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23)具有96％的同源性，以及與獼猴全長PSMA蛋白序列(SEQ ID NO:24)具有94％的同源性。

實施例4

產(chǎn)生共有PSMA抗原2(SEQ ID NO:8)。將包含包括IgE前導(dǎo)序列的767個氨基酸的該序列與表4中所示的每一個PSMA序列相比較。使用的PSMA序列包括兩個人序列和來自獼猴的序列。表4包括用于與共有PSMA抗原2(SEQ ID NO:8)比較的每一個序列的SEQ ID NO:和登錄號。

表4

產(chǎn)生智人(SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23)和獼猴PSMA序列(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25)與PSMA抗原2的多重序列比對。PSMA抗原2共有序列(SEQ ID NO:8)與智人PSMA蛋白序列具有96％的同源性以及與獼猴PSMA蛋白序列具有94％的同源性。

實施例5

產(chǎn)生共有STEAP抗原1(SEQ ID NO:10)。將包含339個氨基酸的 該序列與表5中所示的每一個STEAP序列相比較。使用的STEAP序列包括兩個全長人序列、來自獼猴的全長序列和兩個更短的人序列。表5包括用于與共有STEAP抗原1(SEQ ID NO:10)比較的每一個序列的SEQ ID NO:和登錄號。

表5

產(chǎn)生智人和獼猴STEAP序列與共有STEAP抗原1的多重序列比對。STEAP抗原1共有序列(SEQ ID NO:10)與人全長同種型STEAP1蛋白序列(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)具有99％的同源性，與更短的智人同種型STEAP1蛋白序列(SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30)具有94％的同源性，以及與獼猴全長STEAP1蛋白序列(SEQ ID NO:28)具有94％的同源性。

實施例6

產(chǎn)生共有STEAP抗原2(SEQ ID NO:12)。將包含356個氨基酸的該序列與表6中所示的每一個STEAP序列相比較。使用的STEAP序列包括兩個全長人序列、來自獼猴的全長序列和兩個更短的人序列。表6包括用于與共有STEAP抗原2(SEQ ID NO:12)比較的每一個 序列的SEQ ID NO:和登錄號。

表6

產(chǎn)生智人和獼猴STEAP1序列與共有STEAP1抗原2的多重序列比對。STEAP1抗原2共有序列(SEQ ID NO:12)與全長人同種型STEAP1蛋白序列(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)具有94％的同源性，與更短的智人同種型STEAP1蛋白序列(SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30)具有88％的同源性，以及與獼猴全長STEAP1蛋白序列(SEQ ID NO:28)具有94％的同源性。

實施例7

產(chǎn)生共有PSCA抗原(SEQ ID NO:14)。將包含包括IgE前導(dǎo)序列的131個氨基酸的該序列與表7中所示的每一個PSCA序列相比較。使用的PSCA序列是全長人序列。表7包括用于與共有PSCA抗原(SEQ ID NO:14)比較的序列的SEQ ID NO:和登錄號。

表7

產(chǎn)生智人PSCA序列(SEQ ID NO:31)與共有PSCA抗原(SEQ ID NO:14)的多重序列比對。PSCA抗原共有序列與全長智人PSCA具有87％的同源性。

實施例8

進行體外翻譯以確認(rèn)PSA和PSMA抗原的表達。使用快速偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)和35S-甲硫氨酸(普洛麥格)。按照制造商的說明書，將單獨的pVAX載體(陰性對照)或與PSA或PSMA抗原插入物和35S-甲硫氨酸一起的pVAX主鏈添加至反應(yīng)混合物中。在30℃下進行反應(yīng)2小時。通過在4℃下，在放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液中旋轉(zhuǎn)過夜，利用抗-HA親和凝膠(西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)免疫沉淀標(biāo)記的蛋白質(zhì)。將免疫沉淀的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上進行電泳，隨后固定和干燥所述凝膠。通過放射自顯影術(shù)檢測35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果示于圖1中。

實施例9

通過干擾素γELISpot測定PSA和PSMA抗原的細胞免疫原性。

雌性4至6周齡BALB/c小鼠購自杰克遜實驗室(巴港，緬因州)。將所有動物關(guān)養(yǎng)在賓夕法尼亞大學(xué)的溫度受控制、周期性光照的設(shè)施中。按照美國國立衛(wèi)生研究院和賓夕法尼亞大學(xué)的協(xié)會動物護養(yǎng)和用途委員會(Institutional Care and Use Committee)的指導(dǎo)方針進行動物護養(yǎng)。

為了進行細胞免疫原性研究，通過肌內(nèi)注射，隨后使用 適應(yīng)性恒定電流電穿孔設(shè)備(adaptive constant current electroporation device)(因諾維制藥公司，布魯貝爾，賓夕法尼亞州)通過電穿孔將10或20μg的每一種抗原遞送至Balb/c小鼠的脛前肌。 小鼠(n＝5/組)在第0和2周接受2次免疫。通過由26-規(guī)固體不銹鋼電極組成的三角形3-電極陣列遞送兩個0.1安培恒定電流方波脈沖。每一個脈沖在長度上為52毫秒，脈沖之間延遲1秒。小鼠接受總共2次免疫(間隔2周施用所述免疫)。在第二次免疫后1周人道地處死小鼠以進行細胞和體液免疫反應(yīng)的分析。

在最后一次免疫后1周(第5周)評估細胞和反應(yīng)。使用ELISpot分析測定IFNγ的抗原特異性分泌。將小鼠IFNγ捕獲抗體(R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)用于涂覆平底Immobilon-P板(密理博，比爾里卡，馬薩諸塞州)，在4℃下過夜。無菌分離脾細胞，將其重懸浮于R10培養(yǎng)基(補充有10％胎牛血清、1％抗生素-抗霉菌素和0.1％2-巰基乙醇的皇家公園紀(jì)念研究所培養(yǎng)基1640(Rosewell Park Memorial Institute medium 1640))。將來自免疫的小鼠的2x10⁵個脾細胞添加至96孔板的每一個孔，在R10(陰性對照)、伴刀豆球蛋白A(陽性對照)(西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)或抗原特異性肽混合物存在的情況下在37℃、5％CO2中刺激所述細胞，進行過夜。第二天，將小鼠IFNγ檢測抗體(R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)添加至板中，隨后將板在4℃下孵育過夜。第二天，將鏈酶親和素-ALP(單克隆抗體技術(shù)公司(MabTech)，瑞典)添加至板中進行2小時，利用BCIP/NPT底物(單克隆抗體技術(shù)公司，瑞典)顯現(xiàn)抗原特異性點。PSA和PSMA肽為覆蓋共有免疫原的全長的15聚體肽，其不包括HA標(biāo)記或前導(dǎo)序列，重疊11個氨基酸，并且GenScript(皮斯卡塔韋，新澤西州)合成。對于每一種肽，以1.0μg/mL的終濃度使用PSA和PSMA肽。在最后1次免疫后1周，將IFNγELISpot用于評估抗原特異性細胞反應(yīng)。對于PSA，IFNγ反應(yīng)對于10μg(772.2+/-138.2SFU)和20μg(771.1+/-155.2SFU)疫苗劑量是相似的(圖2A)。相反地，對于20微克的疫苗(1585.0+/-194.0SFU)，與10μg的疫苗(1047.2+/-160.7SFU)相比較在PSMA特異性FNγ反應(yīng)上存在劑量依賴性增加(圖2B)。在初次接受試驗的小鼠中對于PSA或PSMA反應(yīng)觀察到最小的本底。

實施例10

IFNγ、IL-2和TNFα的疫苗誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生

利用流式細胞術(shù)來進一步表征PSA和PSMA疫苗的共遞送的細胞免疫原性。測定總的疫苗特異性反應(yīng)和總的疫苗特異性反應(yīng)的PSA和PSMA組分的IFNγ、IL-2和TNFα的抗原特異性CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生(n＝5)。

按照制造商的說明書(BD生物科學(xué)，圣地亞哥，加利福尼亞州)使用CytoFix/CytoPerm試劑盒，通過細胞內(nèi)細胞因子染色和流式細胞術(shù)測定細胞免疫反應(yīng)。利用PBS洗滌從免疫的小鼠收獲的脾細胞，隨后將其重懸浮于R10培養(yǎng)基中至107個細胞/ml的終濃度。將細胞于100μl的體積中接種在96孔圓底平板中，添加額外的100μl的R10培養(yǎng)基(陰性對照)、含有抗原特異性肽混合物的培養(yǎng)基或含有豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA,10ng/ml)和離子霉素(250ng/ml；陽性對照)(西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)的培養(yǎng)基，將板在37℃、5％CO2下孵育6小時。所有刺激培養(yǎng)基包含1μg/μL的每一種GolgiPlug和GolgiStop(BD生物科學(xué)，圣地亞哥，加利福尼亞州)。在孵育期結(jié)束時，將板離心沉淀，利用PBS洗滌2次。隨后用活力的紫色染料(LIVE/DEAD紫色活力染料，茵維特羅根，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)在4℃下對細胞染色30分鐘。在如上用PBS洗滌后，用抗-CD4PerCPCy5.5和抗-CD8APC在4℃下對細胞進行外部染色，進行30分鐘，隨后固定和透化細胞。添加抗-CD3PE-Cy5、抗-IL-2PE、抗-IFNγAlexaFluor-700和抗-TNFαFITC(BD生物科學(xué)，圣地亞哥，加利福利亞州)，將其在4℃下再孵育30分鐘。利用PBS對細胞進行最后一次洗滌，在1％PFA中固定細胞。

PSA和PSMA疫苗的共遞送誘導(dǎo)強勁的IFNγ、IL-2和TNFα的CD4+分泌。產(chǎn)生PSA特異性(0.21％)和PSMA特異性(0.24％)IFNγ的CD4+T細胞的百分比對總的疫苗特異性CD4+T細胞IFNγ反應(yīng)(0.44％)作出等同的貢獻(圖3A)。產(chǎn)生IL-2(1.08％)的PSMA特異性CD4+T細胞構(gòu)成大部分的總百分比的產(chǎn)生疫苗特異性IL-2(1.40％)的CD4+T細胞(圖3B)。TNFα的PSA(0.31％)和PSMA(0.29％)誘導(dǎo)的CD4+T細胞產(chǎn)生的百分比對總的疫苗特異性反應(yīng)(0.60％)作出等同貢獻(圖3C)?？傮w上，除PSMA誘導(dǎo)大部分疫苗特異性CD4+T細胞IL-2產(chǎn)生外，CD4+T細胞反應(yīng)在PSA與PSMA之間取得良好平衡。

疫苗誘導(dǎo)IFNγ和IL-2的強抗原特異性CD8+T細胞產(chǎn)生和在更低的程度上TNFα的產(chǎn)生。PSA(0.70％)和PSMA(0.67％)誘導(dǎo)強勁的CD8+T細胞IFNγ產(chǎn)生。事實上，IFNγ的疫苗特異性CD8+T細胞分泌構(gòu)成1.37％的總CD8+T細胞群體(圖4A)。疫苗還誘導(dǎo)強CD8+T細胞IL-2反應(yīng)(1.54％)。與CD4+T細胞IL-2反應(yīng)類似，分泌IL-2的PSMA特異性(1.06％)CD8+T細胞的百分比大致為PSA特異性(0.47％)的2倍(圖4B)。TNFα的疫苗特異性CD8+T細胞產(chǎn)生的總百分比(0.11％)響應(yīng)于疫苗的PSA組分(圖4C)。總之，存在高百分比的IFNγ和IL-2的疫苗特異性CD8+T細胞產(chǎn)生。與CD4+T細胞反應(yīng)類似，IFNγ的產(chǎn)生在PSA與PSMA之間等同地取得平衡，并且IL-2PSMA特異性反應(yīng)的量級大于PSA特異性反應(yīng)的量級。

實施例11

PSA特異性IgG血清轉(zhuǎn)化

抗體反應(yīng)可在腫瘤免疫療法中起著重要作用。因此，我們隨后基于蛋白質(zhì)靶的可用度檢查針對PSA抗原的免疫反應(yīng)的該參數(shù)。

為了測定PSA特異性血清抗體滴度，用1μg/孔的于PBS中稀釋的重組PSA蛋白(菲茨杰拉德工業(yè)，阿克頓，馬薩諸塞州)在4℃涂覆96孔Nunc-Immuno MaxiSorp板(Nunc，羅切斯特，紐約州)。用PBS、0.05％Tween 20(PBST)洗滌板，在室溫下用10％BSA/PBST封閉板，進行1小時，在室溫下用來自免疫的或初次接受試驗的動物的血清的系列稀釋物孵育1小時。隨后用PBST洗滌板3次，以1:5,000的PBST中的稀釋度添加山羊抗-小鼠IgG(圣克魯茲，圣克魯茲，加利福利亞州)。通過SigmaFAST鄰-苯二胺二鹽酸鹽(OPD；西格瑪-奧德里奇， 圣路易斯，密蘇里州)檢測結(jié)合的酶，在圖5B中顯示的Biotek(威努斯基，佛蒙特州)反讀數(shù)器上于450nm測定光密度。如先前所述(Frey,A.等人1998)，測定終點滴度。簡而言之，使用學(xué)生t分布計算預(yù)測上限。確定預(yù)測上限(upper prediction limit)的數(shù)學(xué)公式表示為標(biāo)準(zhǔn)差乘以基于陰性對照的數(shù)目(n＝5)和置信水平(95％)的因數(shù)。終點滴度報告為高于預(yù)測上限的最終稀釋度的倒數(shù)。

除了賦予強勁的細胞介導(dǎo)的免疫外，PSA疫苗還誘導(dǎo)強抗原特異性體液反應(yīng)。在最后一次免疫后1周，利用ELISA測定從小鼠分離的血清的抗體滴度(n＝5)。疫苗誘導(dǎo)為4,427(范圍1581-15,811)的平均PSA特異性抗體終點滴度(圖5A)。此類反應(yīng)的壽命同樣可以是非常重要的。

實施例12

可在GenBank上獲得的前列腺特異性抗原氨基酸序列包括下列序列：gb_EAW71923.1_智人_klk3_CRAb；_001639.1_智人_PSA_同種型1_前蛋白原；gb_AAA59995.1_智人_PSA_前體；gb_AAA60193.1_智人_PSA；gb_EAW71933.1_智人_klk3_CRA_l；NP_001025218.1_智人_PSA_同種型3_前蛋白原；gb_CAD54617.1_智人_PSA；gb_CAD30844.1_智人_PSA；gb_AAA59996.1_智人_PSA_前體；gb_AAD14185.1_智人_PSA；Q6DT45.1_食蟹猴_KLK3；NP_001036241.1_獼猴_PSA_前體；AAZ82258.1_獼猴_PSA；AAZ82255.1_西部大猩猩(G.gorilla)_PSA；gi|163838666|ref|NP_001106216.1|血漿激肽釋放酶[獵神狒狒(Papio anubis)]；gi|73746696|gb|AAZ82261.1|前列腺特異性抗原[獵神狒狒]；i|73746692|gb|AAZ82259.1|前列腺特異性抗原[赤猴]；gi|73746694|gb|AAZ82260.1|前列腺特異性抗原[髭長尾猴(Cercopithecus cephus)]；gi|73746682|gb|AAZ82254.1|前列腺特異性抗原[倭黑猩猩(Pan paniscus)]；gi|73746680|gb|AAZ82253.1|前列腺特異性抗原[黑猩猩(Pan troglodytes)]；gi|73746686|gb|AAZ82256.1|前列腺 特異性抗原[紅毛猩猩(Pongo pygmaeus)]和3746688|gb|AAZ82257.1|前列腺特異性抗原[紅頰長臂猿(Nomascus gabriellae)]。

可在GenBank上獲得的PSMA氨基酸序列包括下列序列：NP_004467.1_人_GCPII_同種型1；人_PSMA_AAC83972.1；獼猴_GCPII_同種型1XP_001096141.2和獼猴_GCPII_同種型2_XP_002799784.1。

可在GenBank上獲得的STEAP氨基酸序列包括下列序列：NP036581.1_人_STEAP1；EAL24167.1_人_STEAP1；XP001103605.1_獼猴_STEAP1_同種型3；EAW93751.1_人_STEAP1_CRAb；EAW93749.1_人_STEAP1_CRAa；XP001164838.1_黑猩猩_STEAP同種型2；XP002818311.1_蘇門達臘猩猩(P.abelii)_STEAP1；NP001162459.1_東非狒狒(P.anubis)_STEAP1；NP_999470.1_野豬(S.scrofa)_STEAP1和NP_081675.2_小家鼠(M.musculus)_STEAP1。

NP_005663.2_人_PSCA是可在GenBank上獲得的PSCA氨基酸序列的登錄號。