一種基于量子點(diǎn)的前列腺特異抗原免疫層析試紙條的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥診斷技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是涉及一種新型基于量子點(diǎn)的檢測(cè)前列 腺特異抗原免疫層析試紙條的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌（prostate cancer, PCa)是一種老年男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫 瘤。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，前列腺癌居男性惡性腫瘤的第二位，病死率僅次于肺癌。近年來(lái)，我國(guó) 前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已高居泌尿系腫瘤的第三位，并且發(fā)病年齡也日趨年輕化， 臨床上已經(jīng)將其作為老年男性常見惡性腫瘤之一。但患者如能在發(fā)病早期發(fā)現(xiàn)，治愈率可 以達(dá)到80%以上，因此，前列腺癌的早期診斷已經(jīng)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。
[0003] 前列腺特異性抗原（prostate specific antigen PSA)是由前列腺上皮細(xì)胞分泌 產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，是一種糖蛋白，直接分泌到前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)。其濃度超過(guò)正常 值，則患前腺癌的危險(xiǎn)性增加。因此，將前列腺特異性抗原作為腫瘤標(biāo)志物，對(duì)高危人群進(jìn) 行篩查，對(duì)前列腺癌的早期診斷、病情發(fā)展和預(yù)后監(jiān)測(cè)等工作也有所幫助。因此，對(duì)生物體 內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的一項(xiàng)重要課題，發(fā)展一種新的 靈敏度高的檢測(cè)方法也成為研究者們努力的目標(biāo)。
[0004] 免疫層析檢測(cè)試紙條是近年來(lái)興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體 (或抗原）作為捕獲試劑固定于硝酸纖維素膜的特定區(qū)域，加入待測(cè)樣品后，在毛細(xì)作用 力的推動(dòng)下，待測(cè)樣品沿著膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有捕獲試劑的區(qū)域時(shí)，樣品中的抗原 (或抗體）與捕獲試劑發(fā)生特異性結(jié)合，標(biāo)記試劑（如膠體金，酶等）則顯示出一定的顏色 從而實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)的免疫分析方法。現(xiàn)已商品化的免疫層析試紙條多用膠體金作為標(biāo)記 物，雖然檢測(cè)結(jié)果通過(guò)肉眼可見，但無(wú)法完成定量檢測(cè)，而抗原濃度低的樣本檢測(cè)條帶顏色 太淺無(wú)法用肉眼識(shí)別。目前量子點(diǎn)因具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以 及標(biāo)記等方面，而免疫層析試紙條檢測(cè)則因?yàn)樗暮?jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、可以隨時(shí)隨地等 優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)領(lǐng)域處于特殊重要的地位。所以本文擬研制前列腺特異性抗原量子點(diǎn)免疫熒光 試紙條，對(duì)前列腺腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，建立前列腺腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 免疫層析技術(shù)在腫瘤檢測(cè)中的重要地位、量子點(diǎn)這種納米粒子獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以 及層析技術(shù)簡(jiǎn)便和價(jià)格方面的優(yōu)勢(shì)。我們將結(jié)合量子點(diǎn)和免疫層析試紙條兩種技術(shù)，利用 量子點(diǎn)羧基和腫瘤標(biāo)志物相應(yīng)抗體的氨基反應(yīng)，制得量子點(diǎn)熒光探針。探針、腫瘤標(biāo)志物和 包埋在試紙條的另一種腫瘤標(biāo)志物抗體通過(guò)抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結(jié) 構(gòu)。對(duì)前列腺特異性抗原（prostate specific antigen PSA)--前列腺癌腫瘤標(biāo)志物進(jìn) 行定性定量的檢測(cè)，建立腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的新方法，致力于簡(jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、定性定量、 操作簡(jiǎn)便的消化系統(tǒng)腫瘤早期診斷方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種基于量子點(diǎn)的前列腺特異性抗原免疫層析試紙條的制備方法，樣品墊經(jīng)預(yù) 處理后滴加待測(cè)的前列腺特異性抗原，結(jié)合物釋放墊經(jīng)預(yù)處理后，表面涂有量子點(diǎn)標(biāo)記的 α -前列腺癌抗原特異性單克隆抗體，層析膜包被有β -前列腺癌抗原特異性單克隆抗體 及羊抗鼠二抗，分別形成T線即檢測(cè)線和C線即質(zhì)控線。
[0008] 本發(fā)明的量子點(diǎn)標(biāo)記的α -前列腺癌抗原特異性單克隆抗體的操作步驟如下：
[0009] (1)將水溶性量子點(diǎn)、1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液按照 原料質(zhì)量比為1:4000~10000比例混合于磷酸緩沖液中，渦旋儀上低速旋轉(zhuǎn)使其混勻，然 后將上述混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)30分鐘；
[0010] (2)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液至少清洗三次以除去未反 應(yīng)的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，得到活化的水溶性量子點(diǎn)；
[0011] (3)將活化的水溶性量子點(diǎn)與α -前列腺癌抗原特異性單克隆抗體按照摩爾比為 1:20~40比例混合于磷酸緩沖液中，渦旋儀上旋轉(zhuǎn)使其混勻，將上述混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混 合架上，室溫下反應(yīng)2-4小時(shí)；
[0012] (4)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液至少清洗三次以除去未反 應(yīng)的抗體，最后將產(chǎn)物分散在含有〇. 5~5 %牛血清白蛋白的PBS緩沖液中，4°C靜置過(guò)夜或 恒溫培養(yǎng)37度1小時(shí)后，獲得封閉后的水溶性量子點(diǎn)-α -前列腺癌抗原特異性單克隆抗 體混合液。
[0013] 所述的前列腺特異性抗體為鼠源單克隆特異性抗體是abl40337、ab403、ab63590、 ab0187 或 abl30880 的一種。
[0014] 具體說(shuō)明如下：
[0015] -種基于量子點(diǎn)的前列腺特異性抗原免疫層析試紙條的制備方法，試紙條由經(jīng)預(yù) 處理的聚酯纖維作為樣品墊及結(jié)合物釋放墊，由經(jīng)預(yù)處理的硝酸纖維素膜作為層析膜和吸 水墊組裝而成，樣品墊用于滴加樣品，結(jié)合墊表面涂有量子點(diǎn)標(biāo)記的α -前列腺癌抗原特 異性單克隆抗體，層析膜包被有前列腺癌抗原特異性單克隆抗體（此處所指的前 列腺癌抗原特異性單克隆抗體與本文提到的α-前列腺癌抗原特異性單克隆抗體，為針對(duì) 前列腺癌抗原上不同結(jié)合位點(diǎn)的兩種不同的特異性單克隆抗體）及羊抗鼠二抗（與α -前 列腺癌抗原特異性單克隆抗體特異性結(jié)合的抗體），分別形成T線即檢測(cè)線和C線即質(zhì)控 線，吸水墊提供待測(cè)液流動(dòng)的動(dòng)力。
[0016] 層析膜預(yù)處理方法如下：
[0017] 將β -前列腺癌抗原特異性單克隆抗體（此處所指的β -前列腺癌抗原特異性單 克隆抗體與本文提到的α -前列腺癌抗原特異性單克隆抗體，為針對(duì)前列腺癌抗原上不同 結(jié)合位點(diǎn)的兩種不同的特異性單克隆抗體）以及羊抗鼠二抗（與α-前列腺癌抗原特異性 單克隆抗體特異性結(jié)合的抗體）用PBS緩沖液稀釋到0. 5~2mg/mL，用點(diǎn)樣儀噴于硝酸纖 維素膜上以形成T線和C線，然后置于37°C恒溫干燥箱中至完全干燥，獲得預(yù)處理后的層析 膜。
[0018] 樣品墊預(yù)處理方法如下：
[0019] 將聚酯纖維浸入含0. 1 %~2%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)的Tris-HCl緩沖液中靜 置5~10分鐘，然后放入37°C恒溫干燥箱中至完全干燥，獲得預(yù)處理的樣品墊，封袋置于 4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0020] 結(jié)合物釋放墊預(yù)處理方法如下：
[0021] 將聚酯纖維浸入含1 %~5%的牛血清白蛋白（BSA)U%~5%的聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、1 %~5 %的蔗糖的PBS緩沖液中，靜置至聚酯纖維充分吸收含1 %~5 %的牛血清白 蛋白（BSA)、1%~5%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、1%~5%的蔗糖的PBS緩沖液，然后置于 37°C恒溫干燥箱中至完全干燥，獲得預(yù)處理的結(jié)合物釋放墊，封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 結(jié)合物釋放墊終處理方法如下：
[0023] 用含 1%~5%的 BSA、1%~5%的 PEG-4000、0. 1%~2%的 Tween-20、1%~5% 的蔗糖的PBS緩沖液作為稀釋液，對(duì)封閉后的水溶性量子點(diǎn)-α -前列腺癌抗原特異性單克 隆抗體混合液進(jìn)行稀釋，并將稀釋后的溶液均勻滴加在預(yù)處理后的結(jié)合物釋放墊上，靜置 至預(yù)處理后的結(jié)合物釋放墊充分吸收該溶液，并隨后于37°C恒溫干燥箱中至完全干燥，得 到終處理的結(jié)合墊，封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩Ｋ鱿♂屢号c混合液的體積比為稀釋倍數(shù)為 5 ~10:1〇
[0024] 試紙條的組裝：可以采用通常的處理方法，也可以采用如下方法處理：
[0025] (1)所得預(yù)處理的層析膜固定于單面塑膠板上，所得預(yù)處理的樣品墊及終處理的 結(jié)合物釋放墊按順序貼在層析膜上，最后在層析膜的另一端貼上吸水墊，各個(gè)墊和膜之間 相互之間重疊2mm，試紙條組裝完成。
[0026] (2)用自動(dòng)切膜機(jī)將完成組裝的試紙條進(jìn)行切割，寬度約為4_，并將其裝入塑料 板中，最后將做好的試紙條與干燥劑一起裝入鋁箱袋內(nèi)密封儲(chǔ)存。
[0027] 樣品的測(cè)試和結(jié)果判讀
[0028] (1)定性檢測(cè)：用于激發(fā)量子點(diǎn)的紫外燈波長(zhǎng)范圍為320nm~420nm的普通紫外 燈即可；根據(jù)雙抗夾心的原理，當(dāng)待測(cè)樣本中含有前列腺特異性抗原時(shí)，復(fù)合物將同時(shí)被T 線和C線捕獲，紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)樣本中不含 前列腺特異性抗原時(shí)，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果T線和C線都 不出熒光現(xiàn)條帶則說(shuō)明檢測(cè)無(wú)效。
[0029] (2)定量檢測(cè)：通過(guò)一系列濃度梯度的前列腺特異性抗原標(biāo)準(zhǔn)液滴加到免疫層析 試紙條上，20分鐘后用檢測(cè)儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度數(shù)值，并建立Log (T/C)與前列腺 特意性抗原濃度的相對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)公式，將待測(cè)樣本檢測(cè)獲得的T線與C線數(shù)值通過(guò)公式，計(jì)算 出其前列腺特異性抗原的濃度。（如圖2、圖4所示）
[0030] 所述的制備方法，其特征在于所述量子點(diǎn)是聚（叔丁基丙烯酸脂-乙基丙烯酸 脂-甲基丙烯酸）三嵌段共聚物改性CdZnSe量子點(diǎn)得到的水溶性量子點(diǎn)。（如圖1所示）
[0031] 本發(fā)明制備的新型基于量子點(diǎn)的前列腺特異性抗原免疫層析試紙條優(yōu)勢(shì)在于：
[0032] 1.采用量子點(diǎn)這種具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記 等方面的納米材料作為探針熒光來(lái)源，將納米技術(shù)應(yīng)用到腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域。
[0033] 2