專利名稱：：一種人前列腺特異抗原表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，特別涉及用基因重組的方法制備前列腺特異抗原表達(dá)載體，以及利用該表達(dá)載體生產(chǎn)人前列腺特異抗原的方法。二.技術(shù)背景前列腺特異抗原(prostatespecificantigen,PSA)是一種存在于精液中，由前列腺腺管和腺泡上皮細(xì)胞在雄性激素調(diào)控下分泌的一種絲氨酸蛋白酶，屬于激肽釋放酶家族成員，具有類胰凝乳蛋白酶、類胰蛋白酶和類脂酶活性。在血清中，總PSA(t-PSA)包括兩種形式游離PSA(f-PSA)和f-PSA與a1-抗糜蛋白酶或a2-巨球蛋白形成的復(fù)合物(c-PSA)，半衰期很短。PSA的主要功能是水解精漿中來(lái)源于精囊、具有抑制精子活動(dòng)功能的SemenogelinI、II和纖維連接蛋白，使精液發(fā)生液化，精子才能前向運(yùn)動(dòng)。天然人PSA由244個(gè)氨基酸組成，N端的氨基酸是異亮氨酸，C端的氮基酸是脯氨酸。這種含7%碳水化合物的單鏈糖蛋白由于有許多異構(gòu)體，等電點(diǎn)較寬為pH6.87.2。由前列腺分泌的PSA最初呈酶原形式，無(wú)活性，其活化過(guò)程必須由精槳中的蛋白酶進(jìn)一步修飾，切除其氨基端的前7個(gè)氨基酸，才能表現(xiàn)其活性狀態(tài)。PSA有高度臟器特異性，是前列腺癌最主要的腫瘤標(biāo)志物。PSA和前列腺癌的惡性程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)，濃度越高惡性度越高。血清PSA測(cè)定精確度高、穩(wěn)定、重復(fù)性好，而且是無(wú)創(chuàng)的，這對(duì)前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療效果的評(píng)估、預(yù)后均有十分重要的意義。也可用于高危人群(50歲以上男性)前列腺癌的普查。目前，市面上出售的PSA多為進(jìn)口，且多采用提取的方法獲得。在精漿中，只有30%的PSA表現(xiàn)為具有分解蛋白的酶活性，5%與蛋白C抑制劑(PCI)結(jié)合，65M的PSA由于被精漿中其他蛋白酶切割消化而失去活性。用這種方法制備PSA，收率低，且成本非常高。故價(jià)格昂貴，每毫克PSA在4000元以上。而用基因工程的方法構(gòu)建PSA表達(dá)體系，可以直接獲得有活性、高收率的PSA，并大幅度降低制備成本。以往，PSA的體外表達(dá)多是在大腸桿菌中進(jìn)行，但是在大腸桿菌中表達(dá)存在易形成包涵體、不能糖基化等問(wèn)題，而且由于采用質(zhì)粒表達(dá)，發(fā)酵過(guò)程需要添加昂貴的抗生素和IPTG等，大大提高了發(fā)酵成本。PSA是一種分泌性的糖蛋白，其氨基酸序列中有五個(gè)二硫鍵。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足，會(huì)影響翻譯后PSA的正確折疊、糖基化，降低其生物活性。巴斯德畢赤酵母(尸化/w'apastor")是可以以甲醇作為唯一碳源的新型酵母表達(dá)系統(tǒng)(Ogata,K.,Nishikawa，H.andOhsugi，M.Ayeastcapableofutilizingmethanol.Agric.B畢赤巴斯德ol.chera.1969，33，1519-1520)。他帶有編碼醇氧化酶的兩個(gè)基因，分別為A0X1和A0X2。細(xì)胞中AOXl的表達(dá)產(chǎn)物絕大部分具有醇氧化酶活性(Tsch叩p，J.F.，Brust，P.F.,Cregg，J".M.，Stillman，C.A.andGingeras，T.R.ExpressionoftheLacZgenefromtwomethanol—regulatedpromotersin/^'c/w'sjosstorz's.NucleicAxidsRes.1987,15,3859-3876)。典型的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體含有乙醇氧化酶基因5'A0X1啟動(dòng)子、3'A0X1終止子，這兩段序列之間是供外源基因插入的多克隆酶切位點(diǎn)。通常以組氨酸脫氫酶基因(Histidinoldehydrogenase,HIS)基因HIS4作為營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)型篩選標(biāo)志或Zeocin及卡那霉素基因(kanamycin)賦予酵母的遺傳霉素(G418)抗性作為篩選標(biāo)志。作為一個(gè)能在大腸桿菌中繁殖、擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒，它還含有pBR322質(zhì)粒的部分序列和氨芐青霉素(AmpR)抗性基因的篩選標(biāo)志。表達(dá)載體通過(guò)同源重組整合到酵母細(xì)胞的染色體DNA中。巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系具有下述獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)酵母是低等真核生物，細(xì)胞生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)；含特有的目前最強(qiáng)、調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子A0X1啟動(dòng)子，用甲醇可以嚴(yán)格地調(diào)控表達(dá)；表達(dá)質(zhì)粒以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合在酵母基因組中，能夠非常穩(wěn)定地表達(dá)外源蛋白質(zhì)，產(chǎn)量很高；表達(dá)的外源蛋白被正確折疊和加工并分泌到培養(yǎng)基中，而酵母本身只分泌少量蛋白，非常有利于產(chǎn)品的分離；對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行信號(hào)序列的加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成、某些脂質(zhì)的加入、糖基化等翻譯后的修飾，更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞。三.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種人前列腺特異抗原表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的人前列腺特異抗原表達(dá)載體，是含有人前列腺特異抗原基因和His-tag基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體。所述人前列腺特異抗原基因編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。序列表中的序列3由237個(gè)氨基酸殘基組成。所述人前列腺特異抗原基因可具有序列表中序列1的核苷酸序列，或與序列表中序列1的自5'端第114位至第824位堿基限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼序列3的氨基酸殘基序列的核苷酸序列。序列表中的序列2由749個(gè)堿基組成，自5'端第4-10位堿基為EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，第722-739位堿基為His-tag編碼序列，第739-746位堿基為NotI識(shí)別位點(diǎn)。所述His-tag基因編碼6個(gè)組氨酸殘基。所述His-tag基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可為pPIC9K、pPIC3K。所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選為pPIC9K。將所述人前列腺特異抗原基因和His-tag插入到pPIC9K的多克隆位點(diǎn)中的化o7PI和Abtl識(shí)別位點(diǎn)之間，構(gòu)建得到pPIC9K-PSA。將上述人前列腺特異抗原表達(dá)載體導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞得到的重組細(xì)胞也屬于本發(fā)明的范圍。所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞可為巴斯德畢赤酵母GS115，腿71或SMD1168。所述巴斯德畢赤酵母優(yōu)選為GS115?？衫秒娹D(zhuǎn)化法將上述人前列腺特異抗原表達(dá)載體導(dǎo)入所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)人前列腺特異抗原的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)人前列腺特異抗原的方法，包括培養(yǎng)上述重組巴斯德畢赤酵母細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)人前列腺特異抗原的步驟。上述表達(dá)人前列腺特異抗原的方法中，還包括利用金屬親和柱層析分離純化所述人前列腺特異抗原的步驟。所述金屬離子柱層析可為鎳離子親和層析。本發(fā)明的人前列腺特異抗原基因表達(dá)載體構(gòu)建容易，并通過(guò)同源重組把人前列腺特異抗原基因整合入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的基因組中，穩(wěn)定表達(dá)人前列腺特異抗原，避免了在大腸桿菌中表達(dá)該蛋白的折疊不正確、不能糖基化等問(wèn)題，而且在發(fā)酵過(guò)程中無(wú)需使用昂貴的抗生素和IPTG，使生產(chǎn)成本大大降低。此外，巴斯德畢赤酵母的高密度生長(zhǎng)，也有利于人前列腺特異抗原的表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)1.8mg/ml，本發(fā)明具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。四.附圖1前列腺特異抗原畢赤酵母表達(dá)體系的構(gòu)建流程圖；附圖2PSA基因的測(cè)序結(jié)果(5'端測(cè)序結(jié)果)；附圖3PSA基因的測(cè)序結(jié)果(3'端測(cè)序結(jié)果)；附圖4SDS-PAGE電泳圖譜，左邊為純化前表達(dá)上清SDS-PAGE電泳圖譜，右邊為純化后PSA的SDS-PAGE電泳圖譜。五.具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所用的酶如無(wú)特雖說(shuō)明均來(lái)自TaKaRa公司。實(shí)施例1、人前列腺特異抗原巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-PSA的構(gòu)建如附圖1所示，表達(dá)載體pPIC9K-PSA的構(gòu)建步驟一、PSA基因的克隆及pMD18-simple-T-PSA載體的構(gòu)建1、以購(gòu)自Megaraan公司的cDNA文庫(kù)為模板，用引物Pl，P2經(jīng)PCR法合成5'端帶feo《1酶切位點(diǎn)，3'端帶AbfI酶切位點(diǎn)和His-tag編碼序列的基因片段。弓I物P1:5'aa卿attcattgtgggaggctgggagtgcg卿a3，弓I物P2:5'tatgcggccgcatggtgatggtgatgatgggggttggccacgatggtgtcctt3'PCR反應(yīng)體系無(wú)菌水14n110xExT叫Buffer2.5u110xMgCl22.5ul2.5raMdNTP110mMPI-5'引物lu110mMP2-3'引物ly1ExT叫0.125u1模板2y1PCR循環(huán)94°C5分鐘變性；94。C30秒鐘，55°C45秒鐘，72°C1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸IO分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，證明獲得長(zhǎng)度約為700bp的DNA擴(kuò)增片段。2、PCR產(chǎn)物用小量DNA膠回收試劑盒(天根公司)將目的基因回收。將擴(kuò)增的DNA片段用限制性內(nèi)切酶^co7I和vVotl酶切后，與同樣經(jīng)^bo7I和Abtl酶切的pMD18-simple-T載體(購(gòu)自TaKaRa公司)用T4DNA連接酶連接，得到pMD18-simple-T-PSA，具體操作參考TaKaRa公司pMD18-simple-TKit說(shuō)明書(shū)。連接體系如下SolutionI5u1PCR產(chǎn)物4.5ii1pMD18-simple-T0.5y1vector64。C連接過(guò)夜。CaCl2法轉(zhuǎn)化克隆菌株大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，用含有50ug/ml氨芐的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子。陽(yáng)性克隆抽取質(zhì)粒用&o7lAVotl雙酶切鑒定，操作方法參照《分子克隆指南》。二、人前列腺特異抗原巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-PSA的構(gòu)建鑒定正確的克隆，經(jīng)限制性內(nèi)切酶^bo/I/TfetI酶切過(guò)夜，與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶酶切的表達(dá)載體pPIC9K(Invitrogen公司)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。用含50yg/ml氨芐青霉素的抗性LB平板進(jìn)行篩選。陽(yáng)性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基37'C培養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，用fco///Abt/雙酶切鑒定后，送去測(cè)序。經(jīng)測(cè)序證明，結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全一致(測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附圖2，3)。質(zhì)粒小量提取試劑盒(AXYGEN公司)提取質(zhì)粒，得到人前列腺特異抗原巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-PSA。實(shí)施例2、人前列腺特異抗原高拷貝菌株的篩選及誘導(dǎo)表達(dá)一、高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子表達(dá)菌株的篩選1、實(shí)施例1得到的pPIC9K-PSA，用內(nèi)切酶線性化后，乙醇沉淀法得到線性化的質(zhì)粒pPIC9K-PSA。2、線性化的質(zhì)粒pPIC9K-PSA電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母1)將巴斯德畢赤酵母GS115劃線于YPD—平板上，3(TC培養(yǎng)2-3天使其活化。挑取單克隆菌落接種于50mlYPD液體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)至0De。。為1.3-1.5。2)將步驟l)的培養(yǎng)液，4°C3000rpm離心5分鐘收集酵母細(xì)胞，棄上清。3)用等體積的滅菌水懸浮上述酵母細(xì)胞沉淀，4'C3000rpm離心5分鐘收集酵母細(xì)胞，棄上清。4)重復(fù)步驟3)。5)用10ml1M山梨醇懸浮上述酵母細(xì)胞沉淀，4°C3000rpm離心5分鐘收集酵母細(xì)胞。6)用100u11M山梨醇懸浮上述酵母細(xì)胞沉淀，得到100u1的電感受態(tài)酵母細(xì)胞。7)取5y1步驟1得到的線性化的pPIC9K-PSA和80y1的電感受態(tài)酵母細(xì)胞GS115混合后，置于冰上5分鐘。轉(zhuǎn)移到2咖電擊杯中，在電壓1.5KV進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。78)取出電擊杯。立即加入lml1M的山梨醇，轉(zhuǎn)移到滅菌的1.5mlEppendorf管中，3(TC培養(yǎng)30分鐘。9)取步驟8)的100ul菌液涂布于MD培養(yǎng)基，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，30'C培養(yǎng)2-3天，得到單克隆菌落。3、篩選人前列腺特異抗原的高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子表達(dá)菌株1)將MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單克隆菌落用lmlYPD液體培養(yǎng)基懸浮，30。C培養(yǎng)1-2小時(shí)使其活化。2)分別取100u1上述菌液涂布于含終濃度為lmg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/mlG418的YPD平板，3(TC培養(yǎng)2-3天，得到單克隆菌落。根據(jù)培養(yǎng)平板上單克隆菌落的有無(wú)及多少來(lái)篩選高拷貝菌株，高濃度G418的YPD平板上生長(zhǎng)的菌落為高拷貝轉(zhuǎn)化子(見(jiàn)Invitrogen公司的Multi—Copy尸y乙'力iaExpressionKiti兌日月書(shū))。3)選取一個(gè)PCR鑒定正確的高拷貝轉(zhuǎn)化子克隆，300mlBMGY培養(yǎng)液中3(TC培養(yǎng)至0D6。。=2，500y1菌液內(nèi)加入500u120%滅菌的甘油，保存于-80。C。剩余菌液3000rpm離心5分鐘收集酵母細(xì)胞。4)加入BMMY培養(yǎng)液使OD,分別為0.5，1.0，1.5，每個(gè)不同菌體濃度的培養(yǎng)基分成三瓶，分別補(bǔ)充甲醇至終濃度0.5%，1.0%，1.5%。3(TC誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)，每隔24小時(shí)取樣lml，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。在起始0D6。。=0.5，保持培養(yǎng)液pH7.0，甲醇濃度為1.0%的情況下，3CTC誘導(dǎo)72小時(shí)，重組PSA在畢赤酵母GS115中分泌表達(dá)量約為1.8mg/L,活性最高。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>二、人前列腺特異抗原的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基配方如下-BMGY(1L):蛋白胨20g酵母提取物10g1M磷酸鉀緩沖液(Ri值6.0)100mlYNB13.4g500X生物素2ml50%甘油5mlBMMY(1L):蛋白胨20g酵母提取物10g1M磷酸鉀緩沖液100mlYNB13.4g500X生物素2ml甲醇5ml從保存的菌種取50iU接種于BMGY培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)約30小時(shí)，無(wú)菌條件下，離心并更換BMMY，30'C繼續(xù)培養(yǎng)約小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)施例3、人前列腺特異抗原的分離純化1)實(shí)施例2的菌體培養(yǎng)液離心，表達(dá)上清液用PEG20000濃縮至100ml。在BalanceBuffer(成分為137rnMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，2mMKH2P04，pH7.4)中透析。2)透析后的表達(dá)上清液過(guò)High-AffinityNi-NTA柱(購(gòu)自金思特公司)。預(yù)先用5倍柱體積的BalanceBuffer平衡層析柱。3)上樣后，用BalanceBuffer洗至基線，而后用2倍柱體積的ElutionBuffer(成分為137mMNaCl'2.7函KCl，10mMNa2HP04，2mMKH2P04，250mM咪唑，pH7.4)洗脫，收集洗脫峰5ml。4)取2yg純化好的蛋白質(zhì)樣品，變性12%SDS-PAGE電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，PSA呈分子量約為33KD的一條帶，純度大于90%(SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)附圖4)。5)與購(gòu)買的OEM公司的人源提取的PSA(2.76mgAnl)產(chǎn)品進(jìn)行ELISA的活性比較，按本發(fā)明制備的PSA活性較高。加入抗原量02ng4ng8ng16ng32ng自產(chǎn)PSA0.0060.4430.7661.3251.7682.232OEM公司的PSA0.0080.3690.6081.2141.752.162本發(fā)明構(gòu)建的PSA畢赤酵母真核表達(dá)體系可以穩(wěn)定、高效的分泌表達(dá)有活性的重組蛋白。按本發(fā)明所述方法制備的重組PSA，培養(yǎng)上清液中累積的重組蛋白表達(dá)量高，可達(dá)1.8mg/ml。ELISA檢測(cè)的靈敏性和活性明顯好于市面上的同類產(chǎn)品。9序列表<110〉上海裕隆生物科技有限公司〈120〉一種人前列腺特異抗原表達(dá)載體及其應(yīng)用<160〉5〈210〉1<211>1464〈212〉DNA〈213〉人屬(Homo)<400>1agcccc犯gcttaccacctgC3CCCgg3g3gctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtct60tcctcaccctgtccgtgacgtggsttggtgctgcacccctcatcctgtctcggsttgtgg120g郷ctgggagtgcgsg犯gcatt:cccaaccctggcaggtgcttgtggcctctxgtggca180gggc已gtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgca240tcagg犯caa已a(bǔ)gcgtga.tcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcct300gccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacg3ta_tgagcctcctga360agaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgt420cagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccag480cactggggaccacctgctacgcctcaggctggggca,ttgaaccagaggagttcttga540acttcagtgtgtggacctccatgttatttcC肌tg3Cgtgtgtgcgcaag600ttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggca犯a660gcacctgctcgggtgattctgggggccca,cttgtctgtaatggtgtgcttcaaggt3tca720cgtcatggggcagtg犯ccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacacc犯ggtgg780tgcattaccgaaggacaccatcgtggccaacccctg鄧ca840ccccctattggg犯ccttgggccaagactcaagcctcccc900agttctactgacctttgtccttaggtgtgaggt固gggttgctaggaaa960agacacaggtgtagaccag3gtgtttctta犯tggtgtaattttgtcctctctgtgtcct1020ggccatgcctggagac已t3tcactcaatttctctgaggac1080tggggtgtctgtgttatttgtggggtacag3gatg朋6LggLg鵬tgggatccacactgag1140卿gtgg卿gtg3C3tgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggc12003gCMgg3tgtctgtcctgg1260aggcactggg昍gCCt3g3g卿gctgtgagcc鄉(xiāng)g郷g郷gtcttcctttggcatg1320ggatggggatgaagt卿gagagggactggaccccctggaagctgattcactatgggggg1380aggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagt1440gctgttatactgtg1464<210>2〈211〉749<212>DNA〈213〉人屬(Homo)<400>2aaagaattcaUgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgctt60gtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctc120acagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgttt180catcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctac240gatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccaxgacctc300atgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctg360cccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaa420ccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaat480gacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgc540tggacagggggca譜gcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggt600gtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttcc660ctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccc720taccactaccactactacgcggccgcata749<210〉3<211>237〈212〉PRT<213〉人屬(Homo)〈400〉3lieValGly1ValValLysAspLeuAspAlaGluGlyLeuValAlaMsSerThrTyrAspGluProProValGlyAspSerLeuAlaGinlieGinMetSerThrLeuTrp5Ser20Trp35Leu50Val65Se80His95Asp110Gly125GluArgValLeuPheLeuAspAlaThrCysGlyLeuGlyGinLeuLeuValThrGluArgThrArgValLysMetLysCysLysHis10AlaVal25AlaAla40HisSer55SerHis70AsnArg85LeuLeu100ValMet115TyrAla130SerGinCysGlyHisCysLeuPheSerPhePheLeuArgLeuAspLeuSerGlyProTrpGin15GlyValLeu30lieArgAsn45HisProGlu60ProHisPro75ArgProGly90SerGluPro105ProThrGin120TrpGlySer135lieGluProGluGluPheLeuThrProLysLysLeuGinCysVal140145150AspLeuHisVallieSerAsnAspValCysAlaGinValHisPro155160165GinLysValThrLysPheMetLeuCysAlaGlyArgTrpThrGly170175180GlyLysSerThrCysSerGlyAspSerGlyGlyProLeuValCys185190195AsnGlyValLeuGinGlylieThrSerTrpGlySerGluProCys200205210AlaLeuProGluArgProSerLeuTyrThrLysValValHisTyr215220225ArgLysTrplieLysAspThrlieValAlaAsnPro230235237〈210〉4<211>35〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作克隆含有人前列腺特異抗原基因和His-tag基因的DNA引物，命名為上游引物Pl。<400>4aaagaattcattgtgggaggctgggagtgcg卿a35〈210〉5<211〉53〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作克隆含有人前列腺特異抗原基因和His-tag基因的DNA引物，命名為下游引物P2。<■〉5tatgcggccgcatggtgatggtgatgatgggggttggccacgatggtgtcctt5'31權(quán)利要求1.一種人前列腺特異抗原表達(dá)載體，是轉(zhuǎn)化了人前列腺特異抗原基因和His-tag基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體；所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體為pPIC9K、pPIC3K。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人前列腺特異抗原表達(dá)載體，其特征在于所述人前列腺特異抗原基因編碼序列表中序列3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人前列腺特異抗原表達(dá)載體，其特征在于所述人前列腺特異抗原基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?的核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人前列腺特異抗原表達(dá)載體，特征在于所述人前列腺特異抗原表達(dá)載體為圖1所示的pPIC9K-PSA。5.將權(quán)利要求1-4中任一所述的人前列腺特異抗原表達(dá)載體導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞得到的重組細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組細(xì)胞，其特征在于所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母GS115，KM71或SMD1168。7.—種表達(dá)人前列腺特異抗原的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利5或6所述的重組巴斯德畢赤酵母，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)人前列腺特異抗原的步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)人前列腺特異抗原的方法，其特征在于所述方法中還包括利用金屬親和柱層析分離純化人前列腺特異抗原的步驟。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)人前列腺特異抗原的方法，其特征在于所述金屬親和柱層析為鎳離子親和層析。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種人前列腺特異抗原表達(dá)載體及其應(yīng)用，目的是提供一種人前列腺特異抗原表達(dá)載體及導(dǎo)入該載體的重組酵母細(xì)胞，以及利用該重組細(xì)胞生產(chǎn)制備人前列腺特異抗原活性片斷的方法。該表達(dá)載體是含有人前列腺特異抗原基因和His-tag基因的酵母表達(dá)載體。表達(dá)人前列腺特異抗原的方法，包括重組酵母細(xì)胞的構(gòu)建，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)及利用金屬親和層析分離純化人前列腺特異抗原的步驟。本發(fā)明的人前列腺特異抗原表達(dá)載體通過(guò)同源重組使人前列腺特異抗原基因整合入酵母細(xì)胞基因組中，進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，使生產(chǎn)成本大大降低。文檔編號(hào)C12N15/81GK101659963SQ200810042300公開(kāi)日2010年3月3日申請(qǐng)日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者綱劉,汪寧梅,穆海東申請(qǐng)人:上海裕隆生物科技有限公司