專利名稱：：一種人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于遺傳工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及一種人重組角蛋白19的抗原活性片段表達(dá)載體，以及利用該重組載體進(jìn)行抗原表達(dá)的方法。二
背景技術(shù)：
：角蛋白是細(xì)胞體的中間絲，具有中心性高度保守的a-螺旋桿狀區(qū)域以及高度變異的氨基和羧基末端區(qū)域分布在周圍。角蛋白的DNA序列研究表明，角蛋白多肽是基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，而不是蛋白水解片段。根據(jù)角蛋白相對(duì)分子質(zhì)量及等電位點(diǎn)，用二維電泳可將人類上皮細(xì)胞角蛋白分離出20個(gè)條帶，分別命名為CKl-20,其pl值為5.27.8,分子質(zhì)量為4000060OOO,這些角蛋白分兩型I型具有酸性等電點(diǎn)，分子質(zhì)量從4000056500不等;II型具有中性或堿性等電點(diǎn)，分子質(zhì)量從5200067000不等。細(xì)胞角蛋白是由I型和II型角蛋白組成的異聚合體。所有的細(xì)胞角蛋白都有一個(gè)共同的分子結(jié)構(gòu)，它是組成不同類型復(fù)合物和細(xì)絲的基本單位。這些角蛋白遍及人類上皮細(xì)胞，正常人上皮組織主要表達(dá)CK5，6，8，14,15。角蛋白19(CK19)的相對(duì)分子質(zhì)量為40000，是一種酸性多肽，是最早在鱗癌細(xì)胞中檢測(cè)出來的分子量最小的角蛋白，CK19的cDNA序列由1349bp組成，包括一個(gè)1200bp的開放閱讀框，起始于33位核苷酸，起始密碼子為ATG，終止于1233位核苷酸。CK19的免疫組化研究表明，覆蓋正常支氣管樹的單層上皮、肺泡表面及呼吸道上皮來源的腫瘤均有CK19表達(dá)，但不同組織學(xué)類型的癌細(xì)胞其CK19的表達(dá)強(qiáng)度不同，小細(xì)胞肺癌最弱、鱗癌最強(qiáng)、腺癌次之。CYFRA21-1是角蛋白19的可溶性片段，由于可用兩種單克隆抗體KS19-1和BM19-21檢測(cè)到，因而命名為CYFRA21-1。正常時(shí)CYFRA21-1以寡聚物形式存在，含量極低。當(dāng)分布有CK19的細(xì)胞惡變時(shí)，可釋放CYFRA21-1進(jìn)入血液循環(huán)。過去10年中，大量的臨床研究資料己充分證實(shí)，由KS19-1和BM19-21兩株抗體針對(duì)定量檢測(cè)血清中CYFRA21-1而配對(duì)組成測(cè)定方法，使得CYFRA21-1成為非小細(xì)胞肺癌患者最有價(jià)值的血清腫瘤標(biāo)記物，對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷、病情監(jiān)視和療效判斷有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。在體外獲得CK19抗原可以用作生產(chǎn)相應(yīng)CK19抗體的免疫原或是體外診斷試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品。目前市面上出售的CK19抗原多為進(jìn)口，因采用天然提取的方法獲得(如Fitzgerald公司生產(chǎn)的來源于人源細(xì)胞株的CYFRA21-1)，故生產(chǎn)成本高，得率少，價(jià)格昂貴。平均每mg價(jià)格約為3000-5000元。而少數(shù)一些公司也有利用基因重組的方式在體外表達(dá)CK19抗原(如中資漢脈公司生產(chǎn)的編碼CK191-401aa全長(zhǎng)基因的CK19重組蛋白)，但是因錯(cuò)配率高通過普通PCR的方法得到編碼CK19的全長(zhǎng)基因比較困難；而且根據(jù)這段全長(zhǎng)基因構(gòu)建表達(dá)載體表達(dá)的重組蛋白抗原活性不高，達(dá)不到天然提取物的水平，并且穩(wěn)定性差。因此有必要提供一種生產(chǎn)成本低、抗原活性高、穩(wěn)定性又好的基因重組蛋白。
發(fā)明內(nèi)容為了克服以上角蛋白19抗原產(chǎn)品的不足，本發(fā)明提供一種人重組角蛋白19抗原的活性片段表達(dá)載體及其制備方法，以及利用該表達(dá)載體制備該活性片段的方法。本發(fā)明的目的是這么實(shí)現(xiàn)的構(gòu)建一種人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體，是克隆有序列表中核苷酸序列3的大腸桿菌表達(dá)載體，所述序列表中核苷酸序列3包含在編碼角蛋白19的cDNA全長(zhǎng)序列中，并且含有兩個(gè)單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合表位的編碼序列；所述的大腸桿菌表達(dá)載體為pTrc-CKS。天然CK19的cDNA序列由1349bp組成，包括一個(gè)1200bp的開放閱讀框。而Cyfm21-1為角蛋白19(CK19)的可溶性片段，其序列包含在CK19cDNA全序列中。Cyfm21-1結(jié)構(gòu)含有親水性的棒狀體部和疏水性的頭尾，抗體表位為氨基酸鏈Q(jìng)LADVRADSERQNQ及KAALEDTLAETEARFKS，兩個(gè)抗體表位分別對(duì)應(yīng)單抗BM19-21與單抗KS19-1。本發(fā)明從CK19cDNA全序列中選取所述的包含編碼與兩個(gè)單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合的表位序列，是從編碼角蛋白19cDM全序列開放閱讀框起始密碼子算起第251位氨基酸終止于第390位氨基酸，其氨基酸序列(序列表中序列4)和cDNA序列如下所述的表達(dá)載體為圖1構(gòu)建圖中所示的pTrc-CKS-C《79-/。本發(fā)明還提供將所述的人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株得到的重組菌株。所述大腸桿菌菌株為大腸桿菌TOP10菌株。本發(fā)明還提供一種表達(dá)重組角蛋白19抗原活性片段的方法，包括上述的重組大腸桿菌菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)角蛋白19抗原活性片段的步驟。所述的方法中還包括利用金屬親和柱層析分離純化重組角蛋白19抗原活性片段的步驟。所述金屬親和柱層析為鎳離子親和柱層析。所述的重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體的構(gòu)建過程優(yōu)選例如下1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以cDNA文庫(kù)為模板(購(gòu)自MegaMan公司)，PCR擴(kuò)增得到目的基因片段(^:/9-/;2)擴(kuò)增得到的目的基因片段0^9-7的5'端帶有S,HI酶切位點(diǎn)、3'端帶有&oRI酶切位點(diǎn)，全長(zhǎng)420bp，將其克隆入pMD18-T載體(購(gòu)自TaKaRa公司)中；3)測(cè)序證明得到的基因序列與設(shè)計(jì)完全一致后，將重組質(zhì)粒載體用ft/mHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化，與同樣用限制性內(nèi)切酶消化的pTrc-CKS載體(購(gòu)自Invitrogen公司)連接；4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，用酶切的方法鑒定陽(yáng)性克隆。其中TOP10菌株購(gòu)自Invitrogen公司。本發(fā)明還提供所述的重組角蛋白19抗原活性片段的制備方法和鑒定方法，步驟如下1)將鑒定正確的陽(yáng)性克隆在大腸桿菌TOP10菌株中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，28'C低溫誘導(dǎo)，目的蛋白大部分以可溶性的形式分泌，經(jīng)超聲破碎后上清用鎳離子親和層析柱(購(gòu)自金思特公司的Ni-NTA)純化，得到所需要的目的蛋白；2)得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，呈分子量約51KD的一條帶，純度大于90%。用ELISA的方法對(duì)其活性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，活性在加樣量稀釋到15ng的情況下，OD值仍能大于l.O，而且在37'C下放置5-7天OD值改變不大，可見穩(wěn)定性較好。本發(fā)明構(gòu)建的重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體所克隆的基因序列是一段從CK19cDNA全長(zhǎng)序列中截取的核苷酸序列，這段核苷酸序列包含編碼單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合表位的序列。將其克隆至pTrc-CKS表達(dá)載體中，實(shí)現(xiàn)其高效可溶性表達(dá)，5產(chǎn)量可以達(dá)到15mg/L;對(duì)其活性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)達(dá)到了可應(yīng)用的水平。CK19在體外的高效表達(dá)，既改善了CK19的得率低、生產(chǎn)成本高以及穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，又使得到的蛋白抗原特異性大幅度提高。四附圖1重組CK19抗原基因C《79-7構(gòu)建流程圖；附圖2(^^9-/基因的測(cè)序結(jié)果；附圖3SDS-PAGE電泳圖譜左圖為誘導(dǎo)前后蛋白樣品，右圖為純化后蛋白樣品；附圖4A、B、C三種抗原的活性比較圖A為本發(fā)明得到的CK19-l抗原，B為購(gòu)買的KRT19(中資漢脈公司，來源于CK19l-401aa全長(zhǎng)重組蛋白)，C為購(gòu)買的CYFRA21-1(Fitzgerald公司，來源于人源細(xì)胞株提取蛋白)。圖中橫坐標(biāo)代表抗原加入量，單位(ng);縱坐標(biāo)代表活性檢測(cè)OD值，OD值越高，活性越強(qiáng)。五具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用的酶如無特雖說明均來自TaKaRa公司。實(shí)施例1、人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體pTrc-CKS-C^/9J的構(gòu)建如圖]所示，載體pTrc-CKS-C《7W的構(gòu)建過程包括以下步驟一、CK19抗原活性片段編碼基因CKW-7的克隆1.以從MegaMan公司購(gòu)買的人源cDNA文庫(kù)為模板，根據(jù)所要截取的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，這對(duì)引物序列如下弓1物1:5，ggatccgacatgcgaagccaatatg3'弓i物2:5，gaattcgtgatcttcctgtccctcg3'引物l序列在截取的CK19基因片段Oa^的5'端加上S函HI酶切位點(diǎn)，引物2序列在截取的CK19基因片段CiQ9-73'端加上￡coRI酶切位點(diǎn)。PCR操作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，在5(^1的PCR體系中使用1^1的cDNA，以及1.25U的Taq聚合酶，1.25mMMgCl2，0.2mM的dNTP和各lOOpmol的引物1和2，剩余體積用無菌水補(bǔ)平。PCR反應(yīng)的參數(shù)為94°C5分鐘，循環(huán)過程的參數(shù)為94。C30秒，55°C45秒，72°C1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸溫度為72'CIO分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到約420bp左右的條帶。2.PCR產(chǎn)物用天根公司的凝膠回收試劑盒割膠回收，然后與pMD18-simple-Tvector(購(gòu)自TaKaRa公司)連接，連接反應(yīng)體系為10pl，其中SolutionI溶液5pl，Tvector0.5^1，6PCR產(chǎn)物4.5pl，4t:連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化操作按照分子克隆的相關(guān)操作進(jìn)行，具體操作如下所述(1)感受態(tài)細(xì)胞的制備a.挑取大腸桿菌DH5a單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)過夜。b.將過夜培養(yǎng)的菌液以l:100比例接入100mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C',250rpm培養(yǎng)2-3hr，OD600達(dá)到0.4-0.6左右。c.培養(yǎng)液分裝入預(yù)冷的50ml無菌的離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至O'C。d.4°C，5000rpm離心5min，到處培養(yǎng)液。e.沉淀用20ml冷卻的CaCl2溶液重懸，冰上放置10min。f.4°C,5000rpm離心5min，倒出培養(yǎng)液。g.沉淀用2ml預(yù)冷的CaCl2溶液重懸，加等體積50%甘油混勻。h.分裝后凍存于-8(TC冰箱中。(2)轉(zhuǎn)化a.將100ijJDH5a感受態(tài)細(xì)胞加入連接體系中，混勻，冰上放置30min。b.放入42'C水浴中熱擊90s，立即取出放于冰上2min。c.加入200^1LB液體培養(yǎng)基，37°C，250rpm培養(yǎng)30-45min。d.取15(^1涂布LB固體培養(yǎng)及平板(含50昭/mi氨芐)，37。C倒置培養(yǎng)過夜。從平板上挑選多個(gè)陽(yáng)性克隆用PCR鑒定，PCR結(jié)果顯示帶有目的基因片段的陽(yáng)性克隆菌株送去測(cè)序(Iiwitrogen公司)。領(lǐng)"'序結(jié)果如附圖2所示。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增得到的基因序列與設(shè)計(jì)截取的DNA序列完全一致二、人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體pTrc-CKS-C/a仏/的構(gòu)建將重組載體pMD18-T-CD9-/用BamHI和五coRI限制性內(nèi)切酶消化，并將其克隆入同樣用這兩種限制性內(nèi)切酶消化的表達(dá)載體pTrc-CKS(購(gòu)自Iiwitrogen公司)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOPIO(購(gòu)自Iiwitrogen公司)感受態(tài)細(xì)胞中，其中感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化方法與DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法相似。挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶6awHI和￡CORI做酶切鑒定。鑒定結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒即所要構(gòu)建的人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體pTrc-CKS-CK/9-7。而將含有重組表達(dá)載體的重組菌株命名為pTrc-CKS-CK/9-//TOP10。實(shí)施例2、人重組角蛋白19抗原活性片段的誘導(dǎo)表達(dá)一、人重組角蛋白19抗原活性片段的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定培養(yǎng)基2XYT培養(yǎng)基(g/L):酵母浸出物10g，蛋白胨16g，NaC15g，含50嗎/mlAmp。誘導(dǎo)劑lmMIPTG(異丙基-卩-D-硫代半乳糖苷)將重組菌株卩丁1"0(:^:8-^^"-//1010以1:100接種于5ml2XYT培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)3.5hr，取lml菌液用作空白樣品，剩余菌液加入終濃度為lmMIPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28°C，250rpm培養(yǎng)4hr。取誘導(dǎo)前后樣品，7000rpm離心6min收集菌體。用1/10菌液體積的裂解緩沖液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，pH8.0)重懸菌體，重懸的菌液樣品用SDS-PAGE檢測(cè)，如附圖3左圖所示。二、人重組角蛋白19抗原活性片段的誘導(dǎo)表達(dá)將重組菌株pTrc-CKS-CX79-7/TOP10以1:100接種于5ml2XYT培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接入1000ml三角瓶中的200ml2XYT液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。37°C，250rpm培養(yǎng)3hr，OD6oo達(dá)到0.6左右時(shí)加入終濃度為lmMIPTG(異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28°C，250rpm培養(yǎng)4hr后7000rpm離心6min收集菌體。實(shí)施例3、人重組角蛋白19抗原活性片段的純化一、表達(dá)產(chǎn)物的預(yù)處理菌體中加入裂解緩沖液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，pH8.0)超聲破碎，破碎后溶液變澄清，14000rpm離心15min，取上清。二、表達(dá)產(chǎn)物的純化上清過High-A伍nityNi-NTA(鎳離子親和柱，購(gòu)自金思特科技有限公司)，上樣后加入IO個(gè)柱體積的WashBuffer(50mMNaH2P04，300mMNaCl，10mMimidazole,pH8.0)洗雜蛋白，然后用ElutionBuffer(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mMimidazole,pH8.0)洗脫目的蛋白。實(shí)施例4、人重組角蛋白19抗原活性片段的鑒定一、濃度及純度鑒定得到的蛋白樣品取2嗎經(jīng)12%SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，在51KD處有一條目的條帶，用凝膠成像系統(tǒng)分析純度大于90%。電泳圖見附圖3右圖。用Bradford方法檢測(cè)目的蛋白的濃度，濃度約為1.5mg/ml。8二、抗原性鑒定用ELISA檢測(cè)目的蛋白的活性,采用雙抗體夾心的方法，得到的結(jié)果如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>A為本發(fā)明得到的CK19抗原活性片段CK19-1，B為購(gòu)買的KRT19(中資漢脈公司，來源于CK19l-401aa全長(zhǎng)重組蛋白)，C為購(gòu)買的CYFRA21-1(Fitzgerald公司，來源于人源細(xì)胞株提取蛋白)。柱狀圖比較見附圖4。從ELISA的結(jié)果可以看出，本發(fā)明得到的CK19抗原活性片段CK19-1在大于15ng時(shí)，0D值就可以大于1，而且線性符合率也較好，所以其活性和靈敏度都要比天然提取的CK19抗原以及全長(zhǎng)基因編碼的CK19重組抗原好纟多。三、穩(wěn)定性鑒定用ELISA雙抗體夾心的方法檢測(cè)抗原的穩(wěn)定性。進(jìn)行加速試驗(yàn)證明，37'C放置5-7天，抗原均能保持基本不變的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明構(gòu)建的重組pTrc-CKS-a79-7/T0P10表達(dá)工程菌可以高效表達(dá)含有與單抗BM19-21、KS19-1表位相匹配的CK19抗原，且得率較高并且純度和活性都較進(jìn)口天然提取的CK19抗原和CK19全長(zhǎng)基因編碼的重組抗原好，所以有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。序列表〈110〉上海裕隆生物科技有限公司〈120〉一種人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體及其應(yīng)用〈160〉4<210>1<211>25<212〉DM〈213〉人工序列〈220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作編碼含有單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合表位的序列的DNA引物，命名為上游引物1。<400〉1ggatccgacatgcgaagccaatatg25<210>2〈211〉25<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作編碼含有單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合表位的序列的DNA引物，命名為下游引物2。<400>2gaattcgtgatcttcctgtccctcg25〈210>3〈211〉420<212>DNA<213>人屬(Homo)<400>3gacatgcgaagccaatatgaggtcatggccgagcagaaccggaaggatgctgaagcctgg60ttcaccagccggactgaagaattgaaccgggaggtcgctggccacacggagcagctccag120atgagcaggtccgaggttactgacctgcggcgcacccttcagggtcttgagattgagctgicagtcacagctgagcatgaaagctgccttggaagacacactggcagaaacggaggcgcgc240tttggagcccagctggcgcatatccaggcgctgatcagcggtattgaagcccagctgggc300gatgtgcgagctgatagtgagcggcagaatc鄉(xiāng)agtaccagcggctcatggacatcaag360tcgcggctggagcaggagattgccacctaccgcagcctgctcgagggacaggaagatcac420<210〉4〈211〉140〈212〉PRT<213>人屬(Homo)<400〉4AspMetArgSerGinTryGluValMetAlaGluGinAsnArgLys151015AspAlaGluAlaTrpPheThrSerArgThrGluGluLeuAsnArg202530GluValAlaGlyHisThrGluGinLeuGinMetSerArgSerGlu354045ValThrAspLeuArgArgThrLeuGinGlyLeuGlulieGluLeu505560GinSerGinLeuSerMetLysAlaAlaLeuGluAspThrLeuAla657075GluThrGluAlaArgPheGlyAlaGinLeuAlaHislieGinAla808590LeuHeSerGlyHeGluAlaGinLeuGlyAspValArgAlaAsp95100105SerGluArgGinAsnGinGluTyrGinArgLeuMetAsplieLys110115120SerArgLeuGluGinGlulieAlaThrTyrArgSerLeuLeuGlu125130135GlyGinGluAspHis1401權(quán)利要求1.一種人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體，是克隆有序列表中核苷酸序列3的大腸桿菌表達(dá)載體，所述序列表中核苷酸序列3包含在編碼角蛋白19的cDNA全長(zhǎng)序列中，并且含有兩個(gè)單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合表位的編碼序列；所述的大腸桿菌表達(dá)載體為pTrc-CKS。2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的包含編碼與兩個(gè)單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合的表位序列，是從編碼角蛋白19cDNA全序列開放閱讀框起始密碼子算起第251位氨基酸終止于第390位氨基酸，其氨基酸序列和cDNA序列如下DMRSQYEVMAEQNRKDAEAWFTSRTEELNREVAGHTEQIiQMSRSEVTDLRRTLQGLEIELQSQLSMKAAIiEDTLAETEARFGAQIiAHIQALISGIEAQLGDVRADSERQIIQEYQRLMDIKSRLEQEIATYRSIjIjEGOEDH3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為圖1構(gòu)建圖中所示的pTrc-CKS-C尺/9匿7。4.將權(quán)利要求1-3中所述的人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株得到的重組菌株。5.如權(quán)利要求4中所述的重組菌株，其特征在于所述大腸桿菌菌株為大腸桿菌TOP10菌株。6.—種表達(dá)重組角蛋白19抗原活性片段的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求4或5所述的重組大腸桿菌菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)角蛋白19抗原活性片段的步驟。7.如權(quán)利要求6中所述的表達(dá)重組角蛋白19抗原活性片段的方法，其特征在于所述的方法中還包括利用金屬親和柱層析分離純化重組角蛋白19抗原活性片段的步驟。8.如權(quán)利要求7中所述的表達(dá)重組角蛋白19抗原活性片段的方法，其特征在于所述金屬親和柱層析為鎳離子親和柱層析。全文摘要本發(fā)明公開了一種人重組角蛋白19抗原活性片段表達(dá)載體及其應(yīng)用，目的是提供一種克隆有重組角蛋白19高抗原活性基因片段的重組表達(dá)載體的構(gòu)建，以及利用其生產(chǎn)制備重組角蛋白19抗原活性片段的方法。該表達(dá)載體編碼角蛋白19抗原cDNA全長(zhǎng)序列中的一段核苷酸序列，并且該序列包含編碼兩個(gè)單抗BM19-21、KS19-1結(jié)合表位的基因。將其克隆至大腸桿菌pTrc-CKS表達(dá)載體中，可實(shí)現(xiàn)高效可溶性表達(dá)，產(chǎn)量可以達(dá)到15mg/L；對(duì)其活性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到了可應(yīng)用的水平。CK19在體外的高效表達(dá)，既改善了CK19的得率低、生產(chǎn)成本高以及穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，又使得到的蛋白抗原特異性大幅度提高。文檔編號(hào)C12N15/70GK101659959SQ20081004230公開日2010年3月3日申請(qǐng)日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者韌任,綱劉,汪寧梅,穆海東申請(qǐng)人:上海裕隆生物科技有限公司被以下專利引用(1),