專利名稱：一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用的制作方法
一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑 盒及檢測方法和應(yīng)用。背景技術(shù)：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)160萬，死亡 人數(shù)近160萬，患者600萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800 萬，患者約有8400萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。 子宮癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率穩(wěn)定上升且趨年輕 化。子宮腫瘤是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性腫瘤中居第二位，據(jù) 世界范圍統(tǒng)計，每年估計46. 6萬的子宮頸腫瘤發(fā)病例。其中80%的病例發(fā)生在 發(fā)展中國家。我國每年新發(fā)現(xiàn)子宮癌病13. 5萬，約占全球發(fā)病數(shù)的1/3，是我 國婦科惡性腫瘤的第一位。世界婦科學新研究顯示子宮癌發(fā)病均源于人乳頭 瘤病毒感染(HPV)。子宮癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫 瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。我國自50年代末期就積極開展了子宮癌的防 治工作，如上海紡織系統(tǒng)、江西靖安縣及其他一些堅持開展篩査的地區(qū)均取得 了顯著的成效。全國子宮頸癌的死亡率(中國人口年齡調(diào)整率)由70年代的 10.28/10萬下降到90年代的3.25/IO萬，下降了 69%。與世界其他國家比 較，也由70年代的高水平下降到中等水平。但由于我國地域廣闊、人口眾多， 每年仍有新發(fā)病例約10萬，約占世界子宮癌新發(fā)病例總數(shù)的五分之一。近幾 年來，據(jù)一些國家和地區(qū)報道，子宮癌的發(fā)病和死亡率大致穩(wěn)定，但局部有增長的趨勢，特別是子宮頸癌的年輕病例有所增加。近年，我國部分地區(qū)也有子 宮癌病人年輕化趨勢的報道。盡管在過去的20年間，我國子宮癌的死亡率大 幅度下降，但在我國中西部的部分地區(qū)，子宮癌的發(fā)病與死亡率幾十年來卻始
終居高不下。如甘肅武都、山西陽城等縣，子宮頸癌死亡率高達36. 00 / 10萬， 超過全國子宮癌死亡率的10倍，遠高于世界平均水平。子宮癌從癌前變到形 成癌癥，需求八至十年時間，如何做到早期檢測和診斷是降低發(fā)病率和死亡率 的關(guān)鍵。常規(guī)的涂片檢查只能診斷是否是癌細胞，也就是說找到癌細胞已是晚 期，往往病人的生存期不長。如何在更早期發(fā)現(xiàn)(癌變前期)它有非常重要的 臨床意義。美國所有的主要健康組織都認為對癌癥的早期檢測是挽救生命，降 低晚期治療費用的關(guān)鍵。
隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入 展開，至今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或 癌細胞形成(單克隆時)就能做到早期預(yù)測診斷。
美國研究人員Gorodeski博士在實驗中發(fā)現(xiàn)，P2RX7基因能夠區(qū)分癌、癌 癥前期和正常組織，P2RX7基因成為首個能夠檢測細胞癌變潛力的生物標記。 他們最初在實驗室的細胞培養(yǎng)中就已觀察到，子宮癌細胞、子宮上皮細胞增生 細胞和正常子宮上皮細胞，P2RX7基因和P2RX7蛋白表達都不同，子宮癌癥表 達最低，子宮上皮細胞增生細胞表達中等度，正常子宮上皮細胞表達90-100%。 用同樣方法他們分析了臨床病例和正常人，結(jié)果相同。P2RX7基因廣泛存在于 機體上皮組織和上皮細胞中，它是現(xiàn)今唯一能夠在腫瘤發(fā)生之前區(qū)分癌變前組 織的標記物。將P2RX7基因的檢測技術(shù)(組合的基因診斷試劑盒)用來篩選臨 床婦科子宮癌的資料未見報道。
原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術(shù)結(jié)合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的 技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條 件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫
細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分 子。
中國專利文獻CN1556221公開了"IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物診斷和治療結(jié)腸 癌的用途及一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒"。中國專利文獻CN1769485公開了 "櫛 孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及其試劑盒"。中國專利文 獻CN1556410公開了 "一種魚類病毒的檢測試劑盒及其檢測方法"。中國專利 文獻CN1680597公開了"一種用于定量檢測丙型肝炎病毒(HCV)的熒光定量PCR 試劑盒"。中國專利文獻CN2918435，公開了 "一種檢測肥胖相關(guān)基因SNP的寡 核苷酸芯片及試劑盒"。但是，關(guān)于P2RX7基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢 測技術(shù)未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒 及檢測方法和應(yīng)用。及早發(fā)現(xiàn)子宮癌，降低子宮癌的發(fā)病率和死亡率。
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒在 制備檢測子宮癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物， 其中所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.l所示。P2RX7基因序列見SEQ ID NO.l， P2RX7基因的核苷酸序列長度是3155bp， CDS是97.. 1884，位于染色 體12q24"位點上。
作為可選的技術(shù)方案，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.l所示的RNA序列。
作為可選的技術(shù)方案，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
作為可選的技術(shù)方案，所述的放射性核素選自&、 35S、 1251或"P中的一種。
作為可選的技術(shù)方案，所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性 磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
作為可選的技術(shù)方案，所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。 作為可選的技術(shù)方案，還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。 本發(fā)明還提供了一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、
標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選 自放射性核素或非放射性標記物
本發(fā)明還提供了一種P2RX7基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下 步驟
a、 將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；
b、 檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。
作為可選的技術(shù)方案，所述a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交 的溫度為42。C;核酸雜交的時間為16—24小時，所述的底物選用血液細胞標 本或組織細胞標本。
本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以 P2RX7基因為檢測對象，合成探針是P2RX7基因的DNA或RNA序列，檢測的底 物是人體血液標本白細胞或子宮組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術(shù)的顯 示方法能提供P2RX7基因的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化 顯色判定以上基因的表達量，正常子宮組織P2RX7基因不表達，即不顯色，子宮組織細胞增生不表達，不顯色，P2RX7基因在子宮癌癥病人表達，即顯色，該 基因的唯一在子宮頸癌時表達，非常特異，臨床意義非常重大。
本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組 成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是 標本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其
中雜交的具體步驟包括 儀器操作
1) .將待測標本放入反應(yīng)槽中；
2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3) .儀器自動棄去液體
4) .儀器自動棄去液體
5) .儀器自動棄去液體
6) .儀器自動棄去液體
7) .儀器自動棄去液體
8) .儀器自動棄去液體
自動后固定； 自動預(yù)雜交(42°C); 自動清洗； 自動雜交(42。C); 自動清洗；
自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫);
9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10) .取出封片鏡檢。
本發(fā)明優(yōu)點在于
1、 本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。
2、 本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推
3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測子宮頸癌發(fā)生動態(tài)過程，以及用 于子宮頸癌預(yù)防醫(yī)學的檢測和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及影像醫(yī)學檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上
(子宮頸癌變前期或癌細胞增殖)檢測P2RX7基因異常表達，在影像醫(yī)學檢
査及子宮檢査未發(fā)現(xiàn)占位性子宮頸癌病灶之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之 前，亦未形成腫塊之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床肺 子宮頸癌病患一個真正的早期診斷。這樣才有可能實施子宮頸癌的早期診斷、 早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根子宮頸癌惡疾。

圖1是本發(fā)明實施例中子宮癌癥病人P2RX7基因表達圖片。 圖2是本發(fā)明實施例中正常組織P2RX7基因表達圖片。 圖3是子宮組織細胞增生P2RX7基因表達圖片。
具體實施方式
下面結(jié)合圖對本發(fā)明提供的一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒及檢測 方法和應(yīng)用的具體實施方式
做詳細說明。 實施例1
一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效 劑，其中，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示。雜交探針用地 高辛標記。試劑盒中的其它液體和標本組成如下
消化液lOOii 1/管l管/盒無色透明液體
保護液100u 1/管l管/盒無色透明液體
預(yù)雜交液1300 u 1/管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10ul/管l管/盒無色透明液體
反義雜交液10u 1/管l管/盒無色透明液體封閉液1000 y 1/管l管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體l"l/管l管/盒無色透明液體
顯色劑A175ti 1/管l管/盒黃色液體
顯色劑B320u 1/管l管/盒無色透明液體
緩沖液I 10x90ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液n iox80ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液III 10x20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV 10x90ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/瓶l瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1、 消化液20mg/ml蛋白酶K， 100mg蛋白酶K，加DEPC- H20 5ml;
2、 保護液0.2g的glycine加入lml的1X緩沖液I;
3、 預(yù)雜交液IX緩沖液II 7.5ml 50 XD 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0. 04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、 封閉液0.03g的bloking (購買自羅氏公司)加入lmllX緩沖液 III; ,
5、 10x緩沖液I: (ra7. 1-7.4) NaCl 80gNa2,4. 12H20 360g KC1 2g ,04 2g
加三蒸水至11，并高壓滅菌；
6、 lOx緩沖液II: (PH7.0) NaCl 175.3g
擰檬酸鈉88.2g HCl 幾滴
加三蒸水至ll，并高壓滅菌；
7、 緩沖液III: (PH7.9) Tris 121. lg
NaCl 87.66g HCl60ml左右 加三蒸水至ll，并高壓滅菌；
8、 緩沖液IV:
1M Tris-HC1(PH9. 5): Tirs 121. lg加HCl 3ml左右，加水900ml，調(diào)PH 至9.5，加水至ll，并高壓滅菌；
1M NaCl: NaCl 58. 44加水至11，并高壓滅菌；
0. 5M MgCl2: 101. 65g MgCl2. 6H20加水至11，并高壓滅菌；
9、 固定液多聚甲醛40g加1X緩沖液I至ll，稍加熱(約50-60度)攪 拌至溶解；
10、 顯色劑A: NBT lg加70。/。DMFl 1.44ml;
11、 顯色劑B: BCIP lg加100%DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。 實施例2
一種P2RX7基因的原位雜交檢測方法及試劑盒應(yīng)用 一、標本處理
1、用10ml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3 ml抗凝血緩慢 加入含有淋巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1:1.5)的離心管 中，2000r/min離心10 min;
2、 吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的1X緩沖液 I，混勻，1500g/min離心10 min;
3、 棄上清.沉淀加入約兩倍的1X緩沖液I，混勻，1500g/min離心10 min;
4、 棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴 在玻片上推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3 ml血，可以 做4張片子；
5、 用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用lX緩沖液I洗5min。 每缸可以放16片；
6、 標本可保存在-2(TC，或繼續(xù)做實驗。
二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度
1、 將10X緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成1X緩沖液I ;
2、 將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2X緩沖液II;
按1:100稀釋成0.2X緩沖液n ;按1:200稀釋成0. 1 X緩沖液II;
3、 將10 X緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成1 X緩沖液III;
4、 IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取1#， 2tt， 3#各 10ml，加水至100ml既可)。三、實驗步驟
1、 取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復(fù)査用)及陽性對照標本兩張 (每次實驗做一對陽性對照)；
2、 在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加lX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20 ml。 37'C水浴預(yù)熱10分鐘。放進16張玻片，37。C處理12 min，再用1 X緩沖液I洗5min;
3、 用0. 2。/。的保護液(保護液lml加lX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗10min， 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；
4、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片,蓋緊保濕盒，放 在42。C恒溫水浴箱中3h以上；
5、 取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%， 90%， 95%的乙醇各洗 2min ，自然干燥；
6、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標本兩張， 一張加正義雜交液20ul/片， 另一張加反義雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42。C恒溫水浴 箱中16-24h;
7、 取出玻片，棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內(nèi)
在42。C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min 在42°0恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min 在42"C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min;
8、 用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0. 5%1封閉液(lml封閉液加5mllX緩沖液III) 100ul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min;
10、 取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8mllX緩沖液 ni)100ul/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min;
12、 取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;
13、 1 X緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加 到30mllX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；
14、 用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的1X緩沖液I混勻)封片 鏡檢。
四、結(jié)果判斷
在光鏡下計數(shù)100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。 陽性對照標本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。 所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應(yīng)無色。
本發(fā)明實施例中子宮癌癥病人P2RX7基因表達圖片見圖1。本發(fā)明實施例中 正常組織P2RX7基因表達圖片見圖2。子宮組織細胞增生P2RX7基因表達圖片 見圖3。
地高辛標記的cDNA、 RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu) 點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等 缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫 組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷 目的基因的表達量。
本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細胞中 的P2RX7基因表達量，用來確定子宮頸癌是否發(fā)生。臨床研究表明，P2RX7基 因是子宮頸癌的特異基因，因為P2RX7基因在正常人和子宮頸增生中不表達， 唯獨在癌表達，說明子宮頸癌已經(jīng)發(fā)生，用來確定子宮癌癥是否發(fā)生，及增生或是正常。從而獲得子宮頸癌的診斷信息。 實施例3
用P2RX7基因試劑盒檢測子宮癌疾病與用HCCR基因試劑盒檢測子宮癌疾 病之間對比實驗。
為了科學評價上述基因各自在子宮癌疾病的特異性、敏感性、準確性。我 們用平行試驗的方法，同時檢測上述基因的mRNA，檢測技術(shù)采用核酸原位雜交 技術(shù)，用同一例子宮癌疾病患者的外周血，同時檢測P2RX7基因和HCCR基因 的mRNA (進行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下記數(shù)、結(jié)果報告等均采用實 施例1和實施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及試劑)。發(fā)現(xiàn)P2RX7基 因在子宮癌疾病病人中表達量比HCCR基因在同一疾病病人的表達量要高。結(jié) 果表明，P2RX7基因?qū)ψ訉m癌疾病診斷的特異性、敏感性、準確性比HCCR基因 更好，原位雜交基因表達圖顯示，P2RX7基因的表達量是70。/。， HCCR基因的表 達量是50%。本發(fā)明的試劑盒作于子宮癌疾病診斷的指標有非常重要的臨床意 義。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些 改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCE LISTING 〈110〉芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司
<120〉 一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用 <130〉 / 〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3.1 〈210〉 1 〈211〉 3155 〈212〉 DNA
〈213〉 智人(Homo sapiens) 〈400〉 1
gtttcatttt gc恥ttactg ggagggggct tgctgtggcc ctgtcaggaa gagtagagct 60 ctggtccagc tccgcgcagg gagggaggct gtcaccatgc cggcctgctg cagctgcagt 120 gatgttttcc agtatgagac gaacaaagtc actcggatcc agagcatgaa ttatggcacc 180 attaagtggt tcttccacgt gatcatcttt tcctacgttt gctttgctct ggtgagtgac 240 aagctgtacc agcggsaaga gcctgtcatc agttctgtgc acax:caaggt ga^ggggala 300 gc兆aggtga犯g3gg3gat cgtggag33t gg3gtg犯ga 3gttggtgc3 c兆tgtcttt 360 gacaccgcag actacacctt ccctttgcag gggaactctt tcttcgtgat gacaaacttt 420 ctcaaaacag犯ggccaag3 gcagcggttg tgtcccgagt atcccacccg caggacgctc 480 tgttcctctg accgaggttg t肌a犯ggga tggatggacc cgcagagcas agg^ttcag 540 accggaaggt gtgtagtgta tg肌gggaac cagaagacct gtgaagtctc tgcctggtgc 600 cccELtcgagg cagtggaaga ggccccccgg cctgctctct tgaacagtgc cgaaaacttc 660 actgtgctca tcaagaacaa tatcgwttc cccggccaca actacaccac gaga^acatc 720 ctgccaggtt taaacatcac ttgtaccttc cacaagactc agaatccaca gtgtcccatt 780 ttccgactag gagaca^tctt ccgag肌ax:3 ggcgataatt tttcagatgt ggcaattcag 840 ggcggaataa tgggcattga gatctactgg gactgc肌cc tagaccgttg gttccatcac 900 tgccgtccca aatacagttt ccgtcgcctt gacgacaaga ccaccaacgt gtccttgtac 960 cctggctaca acttcagsta cgcc犯gtac t3caagga肌acaatgttgs g朋ax:ggact 1020ctgataaaag tcttcgggat ccgttttgac atcctggttt ttggcaccgg aggaaaattt 1080
gacattatcc agctggttgt gtacatcggc tc犯ccctct cctacttcgg tctggccgct 1140
gtgttcatcg acttcctcat cgacacttac tccagtaact gctgtcgctc ccatatttat 1200
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gagtccattg tggagccaaa gccgacatta aagtatgtgt cctttgtgga tgaatcccac 1320
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gtcccaagac ctgcgatgga cttcacagat ttgtccaggc tgcccctggc cctccatgac 1440
acacccccga ttcctggaca accagaggag atacagctgc ttagaaagga ggcgactcct 1500
agatccaggg atagccccgt ctggtgccag tgtggaagct gcctcccatc tcaactccct 1560
gagagccaca ggtgcctgga ggagctgtgc tgccggaaaa sgccgggggc ctgcatcacc 1620
acctcagagc tgttcaggaa gctggtcctg tccagacacg tcctgcagtt cctcctgctc 1680
tax;caggagc ccttgctggc gctggatgtg gattccacca acagccggct gcggcactgt 1740
gcctacaggt gctacgccac ctggcgcttc ggctcccagg acatggctga ctttgccaac 1800
ctgcccagct gctgccgctg gaggatccgg aaagagtttc cgaagagtgs agggcagtac 1860
agtggcttca agagtcctta ctgaagccag gcaccgtggc tcacgtctgt aatcccagcg 1920
ctttgggagg ccgaggcagg cagatcacct gaggtcggga gttggagacc cgcctggcta 1980
acaaggcga^ 3tcctgtctg tactaaaaa^t ac肌肌3tca gccagacatg gtggcatgca 2040
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權(quán)利要求
1. 一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒在制備檢測子宮癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針 序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序歹!j。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標記 物選自放射性核素或非放射性標記物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核 素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性 標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8. —種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物， 其特征在于，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的標記 物選自放射性核素或非放射性標記物。
9. 一種P2RX7基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、 將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接 觸，形成雜交復(fù)合體；b、 檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形 成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16 — 24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種早期子宮癌原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種P2RX7基因的原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測子宮癌疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101469352SQ20081004226
公開日2009年7月1日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司