長灘軍團菌的熒光原位雜交檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及長灘軍團菌檢測鑒定的技術領域，具體為一種長灘軍團菌的熒光原位 雜交檢測試劑盒。
【背景技術】：
[0002] 軍團菌是一類革蘭氏陰性的兼性胞內寄生菌，廣泛分布于自然環(huán)境與人工水體環(huán) 境中，主要以空氣氣溶膠的形式進入肺泡，并以胞內寄生的方式感染人體細胞，可引起軍團 菌病。目前軍團菌屬共有58個種，20多個種與人類疾病有關，其中嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila)、長灘軍團菌（L.longbeachae)和杜氏軍團菌（L.dumoffii)為主要病原體。 長灘軍團菌于1980年首次分離于美國長灘市的一位軍團菌肺炎患者，并因此得名。同年， William分離得到長灘軍團菌的第二個血清型，此后便不斷有長灘軍團菌的臨床和環(huán)境分 離報道。在澳大利亞，新西蘭等地，長灘軍團菌感染病例數量與嗜肺軍團菌相當，有些地區(qū) 甚至多于嗜肺軍團菌感染病例。有研宄表明，歐洲軍團菌肺炎患者中，大約5%病例源自長 灘軍團菌感染，并在過去的十年間呈顯著增多的趨勢。在亞洲，日本近年來也發(fā)現長灘軍團 菌感染的軍團菌病患者。與嗜肺軍團菌以空調系統(tǒng)產生的氣溶膠為主要傳播途徑不同，長 灘軍團菌主要存在于堆肥處理的土壤以及附近水體中。流行病學調查表明，長灘軍團菌病 例大多在患病前接觸了含有長灘軍團菌的土壤或附近水體。我國軍團菌的研宄多集中在城 市空調系統(tǒng)或環(huán)境水系中嗜肺軍團菌的分離與培養(yǎng)，而長灘軍團菌的相關研宄基本處于空 白，更無土壤中長灘軍團菌的分離研宄報道，長灘軍團菌對我國人群的危害尚不清楚。
[0003] 目前長灘軍團菌的檢測鑒定主要采用分離培養(yǎng)，血清凝集實驗，生化反應，16S rRNA基因和mip基因測序鑒定等方法。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法耗時長，分離難度大。血清凝集 容易出現交叉凝集反應，生化反應鑒定重復性差，基因測序耗費大。因此需要一種簡單的長 灘軍團菌特異性檢測方法。焚光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，FISH) 是一種特異性的微生物圖像檢測方法。熒光標記的核酸探針與微生物胞內高度相似的核酸 位點雜交，并在激發(fā)光照射下發(fā)射熒光，可用于微生物的檢測和定位。目前已有針對軍團菌 屬和嗜肺軍團菌種的特異性FISH探針，并廣泛運用于環(huán)境、臨床等樣品的檢測。本發(fā)明設 計了一個長灘軍團菌的特異性FISH檢測試劑盒用于長灘軍團菌的檢測。

【發(fā)明內容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種長灘軍團菌的熒光原位雜交檢測試劑盒，本發(fā)明基于我 們在16SrRNA序列中新發(fā)現的一個長灘軍團菌特異的探針結合位點，建立一種更為簡單、 快速、且成本低廉的長灘軍團菌檢測試劑盒。
[0005] 本發(fā)明實現過程如下：
[0006] 1.熒光原位雜交探針設計與合成：
[0007] 通過對長灘軍團菌、非長灘軍團菌與其他非軍團菌的16SrRNA序列比對，發(fā)現長 灘軍團菌在該序列上存在一段特異性區(qū)域"GGATGATGTCTGAGGACG"，其他非長灘軍團菌與非 軍團菌在此區(qū)域至少存在一個堿基差異。據此我們設計一條長灘軍團菌特異探針，通過該 熒光原位雜交探針可鑒別軍團菌與其他細菌。委托商業(yè)探針合成公司合成探針：
[0008]探針：[FITC]-5'-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列為SEQIDNO :1)
[0009] FITC:異硫氰酸焚光素（fluoresceinisothiocyanate)，通過一個氨基連接分子 與探針5'端相連。
[0010] 2.試劑盒的制備
[0011] 含有上述引物的軍團菌檢測試劑盒，其主要成分為：
[0012] (1)探針：上面1.熒光原位雜交探針設計與合成中制備的探針以無菌蒸餾水溶 解，配制成濃度l〇ng/y1。
[0013] (2)熒光原位雜交緩沖液：20mMTris-HCl，20% 甲酰胺，900mMNaCl。
[0014] (3)熒光原位雜交洗脫液：20mMTris-HCl，0. 01%SDS，225mMNaCl和 5mMEDTA。
[0015](4)陽性對照：長灘軍團菌標準菌株（ATCC33462)，0. 5mllX104個菌/ml培養(yǎng)物。
[0016](5)陰性對照：嗜肺軍團菌標準菌株（ATCC35072)，0.5mllX104個菌/ml的嗜肺軍 團菌培養(yǎng)物。
[0017] 以上試劑盒在_20°C保存。
[0018]3.試劑盒使用
[0019] (1)樣品前處理：將待檢測樣品和對照制成4%多聚甲醛菌懸液，置于4°C過夜固 定。12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩沖液（PH= 7. 6)重懸菌液。取20y1菌液均 勻涂于載玻片上，室溫風干。
[0020] (2)探針雜交：將涂有菌液的玻片依次置于50%，80 %和96 %的乙醇溶液中脫水3 分鐘，自然風干。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5y1探針溶液以及19. 5y1雜交緩沖 液共計20y1混合，滴加至玻片中央，置于46°C濕盒中雜交2h，之后于46°C預熱的洗脫緩沖 液洗去未雜交的探針，去離子水沖洗玻片，避光風干。
[0021] (3)焚光顯微鏡觀察
[0022] 調整激發(fā)光波長至490~495nm，在焚光顯微鏡下觀察玻片。
[0023] 本發(fā)明主要特點如下：
[0024] (1)高特異性：通過對19株長灘軍團菌、4株非軍團菌屬菌株以及與探針匹配程度 較高的21株非長灘軍團菌（包括10株嗜肺軍團菌，1株圣克魯伊軍團菌，1株圣海倫軍團 菌，1株辛辛那提軍團菌，4株博茲曼軍團菌，2株麥氏軍團菌，2株杜氏軍團菌），進行探針的 特異性檢測試驗，證明了本發(fā)明試劑盒能準確的鑒定出長灘軍團菌，說明本發(fā)明的試劑盒 特異性很高。
[0025] (2)高靈敏性：本發(fā)明建立的長灘軍團菌的熒光原位雜交試劑盒，靈敏性達 1. 49X103cfu/ml〇
[0026] (3)檢測方法簡便快速，無須先進設備，且結果容易分析。
[0027] (4)檢測范圍廣：本發(fā)明的技術方案設計合理，可以廣泛應用于水樣、生物膜和胞 內寄生的長灘軍團菌快速鑒定，但并不僅限于此。
[0028] 附圖簡述
[0029] 圖1使用本發(fā)明試劑盒檢測時，長灘軍團菌在顯微鏡下的形態(tài)。
[0030] 圖2使用本發(fā)明試劑盒檢測時，嗜肺軍團菌在顯微鏡下的形態(tài)
【具體實施方式】：
[0031] 本發(fā)明的一種檢測長灘軍團菌的熒光原位雜交試劑盒是一個完整的整體。下面結 合具