老年性癡呆病變前期CYP46基因的mRNA水平原位雜交篩查試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與老年性癡呆（AD)病變前期mRNA 表達改變（病理演變過程）的相關(guān)檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer' s disease-, AD)是最常見的癡呆類型，占所有癡呆 的609T80%，也是致殘率高和負擔大的疾病之一。到2006年，人類第一殺手心臟病死亡率 比2000年下降了 11. 5%，第二殺手卒中死亡率下降了 18. 1%，但阿爾茨海默病的死亡率卻上 升了 47. 1%，成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規(guī)模和預(yù)期壽命的增加，阿爾 茨海默病已成為世界衛(wèi)生問題，根據(jù)未來的預(yù)測，癡呆患病率每二十年增加近一倍，至2030 年將達到6570萬，到2050年將達到1億1540萬。各國阿爾茨海默病患者數(shù)增加不是均衡 的。發(fā)達國家的癡呆人數(shù)預(yù)測以100%的比例增長，而中國/印度及其南亞和西太平洋鄰國 等發(fā)展中國家將以超過300%的比例增長，中國的AD人數(shù)則將以336%的比例增長。中國是 世界上人口老化基數(shù)最大國家，截止2008年底，我國60歲以上老年人口已接近1. 69億，占 總?cè)丝诘?2%。根據(jù)2005年北京協(xié)和醫(yī)院領(lǐng)導的一項跨省市(北京/上海/成都/西安)流 行病學調(diào)查結(jié)果估計，65歲以上老年人AD患病率為4.8%，且隨著年齡增長而增加。因此， 中國絕不是一個AD低發(fā)國家，恰恰相反，而是世界上AD人數(shù)最多且增長速度最快的國家。 因此迅猛增加的疾病負擔必將對我國的社會經(jīng)濟發(fā)展和家庭生活產(chǎn)生重要影響。
[0003]AD是世界上致殘率高且負擔重的疾病。按照2003年度世界衛(wèi)生組織報導的關(guān)于 全球疾病負擔的估計，60歲以上老年人中癡呆導致殘疾的占11. 2%，遠高于卒中（9. 5%)、骨 骼肌障礙（8. 9%)、心血管病（5%)及各種類型的癌癥（2. 4%)。據(jù)美國一個跨學科專家組的共 識估計，除脊髓損傷和晚期癌癥以外，AD致殘加權(quán)顯著高于任何其他健康狀況。在美國，AD 人口已超過500萬，AD的花費已超過1000億美元，估計到2050年AD患者人數(shù)將以幾何級 數(shù)方式增長到1300萬人，經(jīng)過核算，每年將花費1400億美元。AD已成為重大的公共衛(wèi)生 問題，并確定為未來幾年公共衛(wèi)生問題的研究重點。
[0004] AD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性認知功能減退，典型 病理改變?yōu)槔夏臧撸╯en ile plaque, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurona 1 fibrillary tang les, NFT)及神經(jīng)元丟失，另外伴有顆粒空泡變性（granulov acuolar degeneration,⑶)，平野小體和腦血管的改變。經(jīng)過數(shù)十年有關(guān)AD的病因和發(fā)病機制的 研究后，雖然對AD的病因還有許多不了解，但是對其病理和生理機制有了肯定和全面的認 識，并從中發(fā)現(xiàn)了一些重要的疾病標志?，F(xiàn)代分子遺傳學在幫助人類認識AD的發(fā)病機制方 面意義非凡，發(fā)現(xiàn)常染色體突變能導致A 0 42肽的表達增多。這些基因包括與早發(fā)型阿爾 茨海默病相關(guān)的21號染色體上的淀粉樣前體蛋白（APP)、14號染色體上的早老素1 (PS1) 和1號染色體上的早老素2 (PS2)的突變，疾病標志還包括以及晚發(fā)型阿爾茨海默病相關(guān) 的19好染色體上的載脂蛋白E (AP0E)和新近發(fā)現(xiàn)的10號染色體突變，及近來發(fā)現(xiàn)的一 些新基因，如CYP46基因，科學家在對6 0 0多名北美人進行調(diào)查后，發(fā)現(xiàn)了CYP4 6基 因突變與AD的發(fā)病關(guān)系，該基因控制產(chǎn)生的一種酶，能幫助大腦分解多余的膽固醇，在他 們的研究中，那些體內(nèi)CYP4 6基因產(chǎn)生變異的人，不僅患老年性癡呆癥的風險增加，大 腦中的膽固醇也會增多。此前，其他科學家們曾發(fā)現(xiàn)，另一個叫做AP0E- 4的基因產(chǎn)生 變異，也會增加人患老年性癡呆癥的風險。這個基因在人體膽固醇的運輸過程中起到作用。 瑞士科學家的新研究則顯示，CYP4 6和APOE- 4基因都產(chǎn)生變異的患者，患老年 性癡呆癥的風險比正常人高將近1 0倍，而且這類患者大腦中貝塔一淀粉狀蛋白質(zhì)的含量 也最商。
[0005] 老年性癡呆癥是阿爾茨海默氏癥（即早老性癡呆癥）的一種，一般在6 5歲以后發(fā) 病，病情會緩慢加重，主要癥狀是記憶受損。老年性癡呆癥的確切病因目前尚不清楚，但解 剖研究發(fā)現(xiàn)，患者大腦中貝塔一淀粉蛋白含量會異常增多。一些科學家據(jù)此推測，貝塔一淀 粉蛋白可能會干擾腦細胞間的電信號傳輸，最終引發(fā)細胞大量死亡。新發(fā)現(xiàn)的CYP4 6 基因進一步表明，膽固醇和貝塔一淀粉蛋白的積聚之間也許存在某種關(guān)聯(lián)，人體膽固醇新 陳代謝的不足，有可能是導致老年性癡呆癥的"罪魁禍首"。
[0006]AD的生物標志物能很好地幫助臨床診斷，與病理發(fā)現(xiàn)有良好的一致性。2010年美 國國立老化研究院和阿爾茨海默病聯(lián)合會推薦新的診斷定義與標準，強調(diào)將記憶損害與生 物標志物結(jié)合。AD是疾病的整個臨床過程，包括了AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨床前 驅(qū)期則指出現(xiàn)早期病理生理學改變至出現(xiàn)最早的認知癥狀之間漫長的階段。
[0007] 當前，臨床使用的AD治療藥物不少，但均缺乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴重的 認知功能損害，呈進展性和不可逆性，要通過藥物干預(yù)實現(xiàn)病情穩(wěn)定或緩解是極其困難的。 因此，對癡呆實施預(yù)防應(yīng)該是一個重要的臨床研究方向。最新AD研究報告表明，作為"嬰 兒"這一代，到2050年在美國將有1千3百50萬人成為AD癡呆患者。如果，假設(shè)有一種干 預(yù)可以是AD癡呆的發(fā)病延遲5-10年或提早5-10預(yù)測和篩查，那么AD癡呆患者人數(shù)將減 少80%，用于AD的預(yù)計醫(yī)療費用將會大大減少。因此，尋找有效AD篩查工具，對臨床前期AD 患者及未發(fā)生AD高危人群的早期篩查，在人群中盡早開展干預(yù)治療，減少AD的最終發(fā)生率 有重要的臨床和時代意義。盡早開發(fā)出應(yīng)用于AD病變前期mRNA水平篩查試劑盒，這將改 變目前臨床上的AD發(fā)生后的診治模式，將AD的診治提高、提前到病變前期，做到預(yù)防性(治 未?。┑脑缙诮槿牒椭委?，并進一步做到mRNA水平的調(diào)控及基因早期治療，將AD消滅在萌 芽狀態(tài)。
[0008] 本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做 到真正的早期診斷。本課題擬采用核酸原位雜交技術(shù)，尋找與AD發(fā)病密切相關(guān)的CYP46基 因一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物-mRNA，觀察其在AD病人、高危人群、正常對照人群表達變化，統(tǒng)計分 析其臨床應(yīng)用意義和價值，并培養(yǎng)、開發(fā)出可應(yīng)用于臨床的早期篩查試劑盒，用于臨床前期 AD患者及高危人群的早期篩查，做到預(yù)防性診治，盡早開展干預(yù)治療，減少AD的最終發(fā)生 率。
[0009] 隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學，疾病基因組學等研究的深入展開，為 了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預(yù)防老年性癡呆，已取得長足進步。至今，我 們已有可能在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物（mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在老年 性癡呆癥的基因生理病理學演變前期，就可以做到早期預(yù)測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位 雜交技術(shù)，選擇多組臨床標本(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照)，對CYP46基因與老年 性癡呆癥的早期預(yù)警進行檢測分析。
[0010]CYP46基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意 義。CYP46基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過程中表達過度。它作于老年性癡呆病 變前期篩查、及老年性癡呆癥早期預(yù)防的檢測指標及治療后的復(fù)發(fā)預(yù)警也有非常重要的臨 床意義。
[0011] 發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，臨床的重大疾病的臨床診治模式一 定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已?。òl(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病，只有這 樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和 生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了大膽創(chuàng)新。特 別是篩選臨床標本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與疾病組織比較的一 貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)病變期前m