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老年性癡呆病變前期APOE-4基因mRNA水平原位雜交篩查試劑盒及篩查方法和應用的制作方法

文檔序號:415601閱讀:292來源:國知局
專利名稱:老年性癡呆病變前期APOE-4基因mRNA水平原位雜交篩查試劑盒及篩查方法和應用的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及生物檢測領域,更具體地說,是涉及與老年性癡呆(AD)病變前期mRNA表達改變(病理演變過程)的相關檢測技術。
背景技術
阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease-, AD)是最常見的癡呆類型,占所有癡呆的60°/Γ80%,也是致殘率高和負擔大的疾病之一。到2006年,人類第一殺手心臟病死亡率比2000年下降了 11. 5%,第二殺手卒中死亡率下降了 18. 1%,但阿爾茨海默病的死亡率卻上升了 47. 1%,成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規(guī)模和預期壽命的增加,阿爾茨海默病已成為世界衛(wèi)生問題,根據(jù)未來的預測,癡呆患病率每二十年增加近一倍,至2030年將達到6570萬,到2050年將達到I億1540萬。各國阿爾茨海默病患者數(shù)增加不是均衡的。發(fā)達國家的癡呆人數(shù)預測以100%的比例增長,而中國/印度及其南亞和西太平洋鄰國等發(fā)展中國家將以超過300%的比例增長,中國的AD人數(shù)則將以336%的比例增長。中國是世界上人口老化基數(shù)最大國家,截止2008年底,我國60歲以上老年人口已接近I. 69億,占總人口的12%。根據(jù)2005年北京協(xié)和醫(yī)院領導的一項跨省市(北京/上海/成都/西安)流行病學調查結果估計,65歲以上老年人AD患病率為4. 8%,且隨著年齡增長而增加。因此,中國絕不是一個AD低發(fā)國家,恰恰相反,而是世界上AD人數(shù)最多且增長速度最快的國家。因此迅猛增加的疾病負擔必將對我國的社會經(jīng)濟發(fā)展和家庭生活產生重要影響。AD是世界上致殘率高且負擔重的疾病。按照2003年度世界衛(wèi)生組織報導的關于全球疾病負擔的估計,60歲以上老年人中癡呆導致殘疾的占11. 2%,遠高于卒中(9. 5%)、骨骼肌障礙(8. 9%)、心血管病(5%)及各種類型的癌癥(2. 4%)。據(jù)美國一個跨學科專家組的共識估計,除脊髓損傷和晚期癌癥以外,AD致殘加權顯著高于任何其他健康狀況。在美國,AD人口已超過500萬,AD的花費已超過1000億美元,估計到2050年AD患者人數(shù)將以幾何級數(shù)方式增長到1300萬人,經(jīng)過核算,每年將花費1400億美元。AD已成為重大的公共衛(wèi)生問題,并確定為未來幾年公共衛(wèi)生問題的研究重點。AD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為進行性認知功能減退,典型病理改變?yōu)槔夏臧?sen ile plaque, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(neurona I fibrillarytang les, NFT)及神經(jīng)元丟失,另外伴有顆粒空泡變性(granulov acuolardegeneration,⑶),平野小體和腦血管的改變。經(jīng)過數(shù)十年有關AD的病因和發(fā)病機制的研究后,雖然對AD的病因還有許多不了解,但是對其病理和生理機制有了肯定和全面的認識,并從中發(fā)現(xiàn)了一些重要的疾病標志?,F(xiàn)代分子遺傳學在幫助人類認識AD的發(fā)病機制方面意義非凡,發(fā)現(xiàn)常染色體突變能導致A β 42肽的表達增多。這些基因包括與早發(fā)型阿爾茨海默病相關的21號染色體上的淀粉樣前體蛋白(APP)、14號染色體上的早老素I (PSl)和I號染色體上的早老素2 (PS2)的突變,疾病標志還包括以及晚發(fā)型阿爾茨海默病相關的19好染色體上的載脂蛋白E (APOE)基因,科學家在對6 O O多名北美人進行調查后,發(fā)現(xiàn)了 AP0E-4基因突變與AD的發(fā)病關系,該基因控制產生的一種酶,能幫助大腦分解多余的膽固醇,在他們的研究中,那些體內AP0E-4基因產生變異的人,不僅患老年性癡呆癥的風險增加,大腦中的膽固醇也會增多。此前,其他科學家們曾發(fā)現(xiàn),A P O E — 4的基因產生變異,也會增加人患老年性癡呆癥的風險。這個基因在人體膽固醇的運輸過程中起到作用。瑞士科學家的新研究則顯示,C Y P 4 6和APOE — 4基因都產生變異的患者,患老年性癡呆癥的風險比正常人高將近I O倍,而且這類患者大腦中貝塔一淀粉狀蛋白質的含量也最聞。老年性癡呆癥是阿爾茨海默氏癥(即早老性癡呆癥)的一種,一般在6 5歲以后發(fā)病,病情會緩慢加重,主要癥狀是記憶受損。老年性癡呆癥的確切病因目前尚不清楚,但解剖研究發(fā)現(xiàn),患者大腦中貝塔一淀粉蛋白含量會異常增多。一些科學家據(jù)此推測,貝塔一淀粉蛋白可能會干擾腦細胞間的電信號傳輸,最終引發(fā)細胞大量死亡。發(fā)現(xiàn)的AP0E-4基因進 一步表明,膽固醇和貝塔一淀粉蛋白的積聚之間也許存在某種關聯(lián),人體膽固醇新陳代謝的不足,有可能是導致老年性癡呆癥的“罪魁禍首”。AD的生物標志物能很好地幫助臨床診斷,與病理發(fā)現(xiàn)有良好的一致性。2010年美國國立老化研究院和阿爾茨海默病聯(lián)合會推薦新的診斷定義與標準,強調將記憶損害與生物標志物結合。AD是疾病的整個臨床過程,包括了 AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨床前驅期則指出現(xiàn)早期病理生理學改變至出現(xiàn)最早的認知癥狀之間漫長的階段。當前,臨床使用的AD治療藥物不少,但均缺乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴重的認知功能損害,呈進展性和不可逆性,要通過藥物干預實現(xiàn)病情穩(wěn)定或緩解是極其困難的。因此,對癡呆實施預防應該是一個重要的臨床研究方向。最新AD研究報告表明,作為“嬰兒”這一代,到2050年在美國將有I千3百50萬人成為AD癡呆患者。如果,假設有一種干預可以是AD癡呆的發(fā)病延遲5-10年或提早5-10預測和篩查,那么AD癡呆患者人數(shù)將減少80%,用于AD的預計醫(yī)療費用將會大大減少。因此,尋找有效AD篩查工具,對臨床前期AD患者及未發(fā)生AD高危人群的早期篩查,在人群中盡早開展干預治療,減少AD的最終發(fā)生率有重要的臨床和時代意義。盡早開發(fā)出應用于AD病變前期mRNA水平篩查試劑盒,這將改變目前臨床上的AD發(fā)生后的診治模式,將AD的診治提高、提前到病變前期,做到預防性(治未病)的早期介入和治療,并進一步做到mRNA水平的調控及基因早期治療,將AD消滅在萌芽狀態(tài)。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn),導致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做到真正的早期診斷。本課題擬采用核酸原位雜交技術,尋找與AD發(fā)病密切相關的CYP46基因一級轉錄功能產物-mRNA,觀察其在AD病人、高危人群、正常對照人群表達變化,統(tǒng)計分析其臨床應用意義和價值,并培養(yǎng)、開發(fā)出可應用于臨床的早期篩查試劑盒,用于臨床前期AD患者及高危人群的早期篩查,做到預防性診治,盡早開展干預治療,減少AD的最終發(fā)生率。隨著分子生物技術日益完善,功能基因組學,疾病基因組學等研究的深入展開,為了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預防老年性癡呆,已取得長足進步。至今,我們已有可能在基因的一級轉錄功能產物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷,在老年性癡呆癥的基因生理病理學演變前期,就可以做到早期預測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術,選擇多組臨床標本(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照),對AP0E-4基因與老年性癡呆癥的早期預警進行檢測分析。AP0E-4基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意義。AP0E-4基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過程中表達過度。它作于老年性癡呆病變前期篩查、及老年性癡呆癥早期預防的檢測指標及治療后的復發(fā)預警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長期的研究中,得出了一種新理念,臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變,不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治),要做到預防性診治,做到治已病,只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率,降低社會成本和醫(yī)療成本。因此,發(fā)明人在開發(fā)和生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中,在理論和技術上都做了大膽創(chuàng)新。特別是篩選臨床標本(正常人群、高危人群、疾病患者),突破了正常組織與疾病組織比較的一貫性研發(fā)思路,來尋找和開發(fā)病變期前mRNA水平,與疾病早期基因病理 生理學演變密切相關,而且臨床意義非常重要靶標,將臨床上疾病形成后診治模式變成疾病的預防性診治,爭取了疾病診治的時間和空間,達到預防重大疾病。根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料AP0E-4基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在對(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照人)例組,用原位雜交技術進行檢測,結果表明以上老年性癡呆癥AP0E-4基因都過度表達,高危人群有不同程度表達15-25%,正常人都是零表達。表明AP0E-4基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來,以標記的核酸分子為探針,在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針),在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交,再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測,從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列,但已知其針對何靶分子),探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤,探針必須用一定的手段加以標記,以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點,但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害,近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交,都必須經(jīng)過五大過程,即組織細胞的固定,預雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式,合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理,同時經(jīng)過長時間研究和觀察,啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響(因為,發(fā)明人采用的mRNA序列都超過600bp以上,而對于較長的堿基序列,超過IOOObp以上,我們會選擇該基因的⑶S來做探針,如果⑶S的堿基序列長度也超過IOOObp以上,我們會選擇其中一段堿基序列來合成探針,但要經(jīng)過Blast分析機體中是否有相同堿基序列片段存在)。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式,從治已病變成預防性治未病,達到預防性診治,將目前影像醫(yī)學手段和眾多生化標記物無法檢測到老年性癡呆病理演變前期mRNA水平量化改變技術,做了創(chuàng)新性的技術突破,提供老年性癡呆前變mRNA水平篩查技術。使臨床上有了一項新的老年性癡呆病理演變前期mRNA水平真正早期篩查的技術,為臨床老年性癡呆癥的早期預防和治療爭取時間和空間。綜上所述,本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒,其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次,本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與老年性癡呆病理演變前期的AP0E-4基因的原位雜交檢測方法
發(fā)明內容

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的,本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒,其包括雜交探針和標記物,其中,所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所示序列的互補序列,AP0E-4基因19bp長度,600bp,與體內的靶片段進行反向互補雜交。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是,所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的老年性癡呆病理演變前期基因篩查試劑盒應用價值在于,能在mRNA水平,及早對老年性癡呆病理演變前期的篩查及老年性癡呆癥經(jīng)治療后療效的評判。AP0E-4基因是一種老年性早衰基因,它的表達變化表明老年性癡呆癥前期病理演變的可能,提示臨床醫(yī)生及早介入預防和治療。本發(fā)明還提供一種AP0E-4基因原位雜交的檢測方法,包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下,將底物中待測RNA與雜交探針接觸,形成雜交復合體;和
(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明所述的檢測方法,其中優(yōu)選地是,所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發(fā)明所述的檢測方法,其中優(yōu)選地是,所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞、或腦脊液標本。更優(yōu)選地是,所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自老年性癡呆患者、高危人群,正常人群。本發(fā)明所述的檢測方法,其中優(yōu)選地是,所述的高危人群、老年性癡呆癥好發(fā)家族、經(jīng)治療后老年性癡呆癥病人。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合,以AP0E-4基因為檢測對象,合成探針是AP0E-4基因的RNA序列,檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞及腦脊液的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供AP0E-4基因的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達量,正常人AP0E-4基因表達低或不表達,即不顯色,AP0E-4基因在老年性癡呆病人和正常人有顯著差異,該基因的表達量比正常人表達量都高,高度顯色。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針,雜交液,顯色劑,增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內人士均熟知,具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告,其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中;
2).儀器自動棄去液體,自動加消化液;
3).儀器自動棄去液體,自動后固定;
4).儀器自動棄去液體,自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體,自動清洗;
6).儀器自動棄去液體,自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體,自動清洗;
8).儀器自動棄去液體,自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫);
9).儀器自動棄去液體,自動清洗,顯色;
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以AP0E-4基因為目的基因合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針,不但探針的具有生物素標記優(yōu)點,還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點),將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交,再用免疫組化的方法顯色,在光鏡下觀察mRNA的存在和定位,根據(jù)染色的細胞數(shù),判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術,該方法通過檢測底物細胞中的AP0E-4基因表達量,用來確定老年性癡呆病理演變是否已發(fā)生,因為AP0E-4基因在正常人中低表達或不表達,如果AP0E-4基因表達高度,說明老年性癡呆發(fā)生風險非常高,以及治療后病人治療效果評判,從而獲得老年性癡呆前期的篩查和診斷信息,幫助臨床醫(yī)生及早介入。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述,當檢測到AP0E-4基因的表達高于正常對照時,則可預測受試者老年性癡呆病理演變已發(fā)生。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測老年性癡呆病變發(fā)生和病理演變過程中老年性癡呆癥的發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明可以在基因水平上檢測AP0E-4基因異常表達,亦未形成老年性癡呆之前,能及早做到以上基因表達異常的信息采集,給臨床老年性癡呆病理演變前期高風險人群,一個真正的早期篩查以及治療后療效判定。這樣才有可能實施老年性癡呆的早期篩查、早期預防、早期治療,有可能從源頭上徹底根治老年性癡呆這一惡疾。此外,本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點,同時,本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單,能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖I是本發(fā)明AP0E-4基因原位雜交實施流程圖。圖2是本發(fā)明實施例老年性癡呆病人AP0E-4過量表達圖片。圖3是本發(fā)明實施例中正常人AP0E-4表達圖片。
圖4是本發(fā)明實施例中高危人群AP0E-4表達圖片。
具體實施例方式下面結合實施例,更具體地說明本發(fā)明的內容。應該理解,下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內容,任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。實施例I
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒,該試劑盒包括以AP0E-4基因為檢測目的基因設計的雜交探針、標記物、說明書, 其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成___
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒,包括雜交探針和標記物,其特征在于,所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所不序列的互補序列。
2.如權利要求I所述的試劑盒,其特征在于,所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求I所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求I所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求I所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種AP0E-4基因原位雜交檢測方法,其特征在于,該方法包括以下步驟 (1)在權利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下,將底物中待測RNA與雜交探針接觸,形成雜交復合體;和 (2)檢測所述雜交復合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法,其特征在于,所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法,其特征在于,所述的底物選用人的血液白細胞和腦脊液細胞標本。
9.如權利要求6所述的檢測方法,其特征在于,所述的標本是老年性癡呆患者、55歲以上高危人群、正常對照人群,包括臨床上的高危人群病變前期病理演變,以及老年性癡呆患者治療后的復發(fā)病理演變過程中AP0E-4基因mRNA表達變化。
10.AP0E-4基因在制備檢測老年性癡呆原位雜交試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒,包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與老年性癡呆(Alzheimer’sDisease-AD)前期病理演變有密切相關的APOE-4基因的mRNA方法,包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下,將底物中待測RNA與雜交探針接觸,形成雜交復合體;和(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可以在,mRNA水平上檢測APOE-4基因的表達功能,比現(xiàn)有的臨床生化檢測指標和影像醫(yī)學檢查更早期,能實現(xiàn)真正的老年性癡呆(AD)病變前期mRNA水平的篩查,做到預防性診治的目的。同時,本發(fā)明的檢測方法簡單方便,成本低,便于醫(yī)院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102965447SQ20121053357
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權日2012年12月12日
發(fā)明者張玉麗, 裘建英, 張云福, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司
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