老年性癡呆病變前期PS-1基因的mRNA水平原位雜交篩查試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與老年性癡呆（AD)病變前期mRNA 表達(dá)改變（病理演變過程）的相關(guān)檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer' s disease-, AD)是最常見的癡呆類型，占所有癡呆 的609T80%，也是致殘率高和負(fù)擔(dān)大的疾病之一。到2006年，人類第一殺手心臟病死亡率 比2000年下降了 11. 5%，第二殺手卒中死亡率下降了 18. 1%，但阿爾茨海默病的死亡率卻上 升了 47. 1%，成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規(guī)模和預(yù)期壽命的增加，阿爾 茨海默病已成為世界衛(wèi)生問題，根據(jù)未來的預(yù)測，癡呆患病率每二十年增加近一倍，至2030 年將達(dá)到6570萬，到2050年將達(dá)到1億1540萬。各國阿爾茨海默病患者數(shù)增加不是均衡 的。發(fā)達(dá)國家的癡呆人數(shù)預(yù)測以100%的比例增長，而中國/印度及其南亞和西太平洋鄰國 等發(fā)展中國家將以超過300%的比例增長，中國的AD人數(shù)則將以336%的比例增長。中國是 世界上人口老化基數(shù)最大國家，截止2008年底，我國60歲以上老年人口已接近1. 69億，占 總?cè)丝诘?2%。根據(jù)2005年北京協(xié)和醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的一項跨省市(北京/上海/成都/西安)流 行病學(xué)調(diào)查結(jié)果估計，65歲以上老年人AD患病率為4.8%，且隨著年齡增長而增加。因此， 中國絕不是一個AD低發(fā)國家，恰恰相反，而是世界上AD人數(shù)最多且增長速度最快的國家。 因此迅猛增加的疾病負(fù)擔(dān)必將對我國的社會經(jīng)濟發(fā)展和家庭生活產(chǎn)生重要影響。
[0003]AD是世界上致殘率高且負(fù)擔(dān)重的疾病。按照2003年度世界衛(wèi)生組織報導(dǎo)的關(guān)于 全球疾病負(fù)擔(dān)的估計，60歲以上老年人中癡呆導(dǎo)致殘疾的占11. 2%，遠(yuǎn)高于卒中（9. 5%)、骨 骼肌障礙（8. 9%)、心血管?。?%)及各種類型的癌癥（2. 4%)。據(jù)美國一個跨學(xué)科專家組的共 識估計，除脊髓損傷和晚期癌癥以外，AD致殘加權(quán)顯著高于任何其他健康狀況。在美國，AD 人口已超過500萬，AD的花費已超過1000億美元，估計到2050年AD患者人數(shù)將以幾何級 數(shù)方式增長到1300萬人，經(jīng)過核算，每年將花費1400億美元。AD已成為重大的公共衛(wèi)生 問題，并確定為未來幾年公共衛(wèi)生問題的研究重點。
[0004] AD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性認(rèn)知功能減退，典型 病理改變?yōu)槔夏臧撸╯en ile plaque, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurona 1 fibrillary tang les, NFT)及神經(jīng)元丟失，另外伴有顆?？张葑冃裕╣ranulov acuolar degeneration,⑶)，平野小體和腦血管的改變。經(jīng)過數(shù)十年有關(guān)AD的病因和發(fā)病機制的 研究后，雖然對AD的病因還有許多不了解，但是對其病理和生理機制有了肯定和全面的認(rèn) 識，并從中發(fā)現(xiàn)了一些重要的疾病標(biāo)志。現(xiàn)代分子遺傳學(xué)在幫助人類認(rèn)識AD的發(fā)病機制方 面意義非凡，發(fā)現(xiàn)常染色體突變能導(dǎo)致A 0 42肽的表達(dá)增多。這些基因包括與早發(fā)型阿爾 茨海默病相關(guān)的21號染色體上的淀粉樣前體蛋白（APP)、14號染色體上的早老素1 (PS1) 和1號染色體上的早老素2(PS2)的突變，疾病標(biāo)志還包括以及晚發(fā)型阿爾茨海默病相關(guān)的 19好染色體上的載脂蛋白E(APOE)和新近發(fā)現(xiàn)的10號染色體突變。通過正電子發(fā)射斷層 成像（PET)顯像的淀粉樣肽(A3 )或腦脊液（CSF)A3水平；通過氟脫氧葡萄糖-PET及 功能磁共振顯示的突出異常；CSF中磷酸化微管相關(guān)蛋白（p-tau)水平及MRI體積所反映的 神經(jīng)元脫失。AD的生物標(biāo)志物能很好地幫助臨床診斷，與病理發(fā)現(xiàn)有良好的一致性。2010 年美國國立老化研究院和阿爾茨海默病聯(lián)合會推薦新的診斷定義與標(biāo)準(zhǔn)，強調(diào)將記憶損害 與生物標(biāo)志物結(jié)合。AD是疾病的整個臨床過程，包括了AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨 床前驅(qū)期則指出現(xiàn)早期病理生理學(xué)改變至出現(xiàn)最早的認(rèn)知癥狀之間漫長的階段。
[0005] 當(dāng)前，臨床使用的AD治療藥物不少，但均缺乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴(yán)重的 認(rèn)知功能損害，呈進展性和不可逆性，要通過藥物干預(yù)實現(xiàn)病情穩(wěn)定或緩解是極其困難的。 因此，對癡呆實施預(yù)防應(yīng)該是一個重要的臨床研究方向。最新AD研究報告表明，作為"嬰 兒"這一代，到2050年在美國將有1千3百50萬人成為AD癡呆患者。如果，假設(shè)有一種干 預(yù)可以是AD癡呆的發(fā)病延遲5-10年或提早5-10預(yù)測和篩查，那么AD癡呆患者人數(shù)將減 少80%，用于AD的預(yù)計醫(yī)療費用將會大大減少。因此，尋找有效AD篩查工具，對臨床前期AD 患者及未發(fā)生AD高危人群的早期篩查，在人群中盡早開展干預(yù)治療，減少AD的最終發(fā)生率 有重要的臨床和時代意義。盡早開發(fā)出應(yīng)用于AD病變前期mRNA水平篩查試劑盒，這將改 變目前臨床上的AD發(fā)生后的診治模式，將AD的診治提高、提前到病變前期，做到預(yù)防性(治 未?。┑脑缙诮槿牒椭委?，并進一步做到mRNA水平的調(diào)控及基因早期治療，將AD消滅在萌 芽狀態(tài)。
[0006] 本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做 到真正的早期診斷。本課題擬采用核酸原位雜交技術(shù)，尋找與AD發(fā)病密切相關(guān)的PS-1基因 一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物-mRNA，觀察其在AD病人、高危人群、正常對照人群表達(dá)變化，統(tǒng)計分析 其臨床應(yīng)用意義和價值，并培養(yǎng)、開發(fā)出可應(yīng)用于臨床的早期篩查試劑盒，用于臨床前期AD 患者及高危人群的早期篩查，做到預(yù)防性診治，盡早開展干預(yù)治療，減少AD的最終發(fā)生率。
[0007] 隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，疾病基因組學(xué)等研究的深入展開，為 了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預(yù)防老年性癡呆，已取得長足進步。至今，我 們已有可能在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物（mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在老年 性癡呆癥的基因生理病理學(xué)演變前期，就可以做到早期預(yù)測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位 雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照)，對PS-1基因與老年 性癡呆癥的早期預(yù)警進行檢測分析。
[0008]PS-1基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意 義。PS-1基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過程中表達(dá)過度。它作于老年性癡呆病 變前期篩查、及老年性癡呆癥早期預(yù)防的檢測指標(biāo)及治療后的復(fù)發(fā)預(yù)警也有非常重要的臨 床意義。
[0009]發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，臨床的重大疾病的臨床診治模式一 定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已?。òl(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病，只有這 樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和 生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了大膽創(chuàng)新。特 別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與疾病組織比較的一 貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)病變期前mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學(xué)演變密切相 關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上疾病形成后診治模式變成疾病的預(yù)防性診治，爭 取了疾病診治的時間和空間，達(dá)到預(yù)防重大疾病。
[0010] 根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料PS-1基因mRNA水平的檢測技術(shù)及試劑盒未見報道。
[0011] 本發(fā)明人在對(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照人）例組，用原位雜交技術(shù) 進行檢測，結(jié)果表明以上老年性癡呆癥PS-1基因都過度表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá) 15-25%，正常人都是零表達(dá)。表明PS-1基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標(biāo)志物。
[0012] 原位雜交技術(shù)（insituhybridiz