本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥嚴(yán)重威脅人類健康。近年來癌癥的發(fā)病率持續(xù)上升，成為僅次于心腦血管疾病的第二大致死性疾病。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，臨床上涌現(xiàn)出大量抗腫瘤藥物。但是化療藥物的毒副作用使其臨床應(yīng)用受到了極大限制，發(fā)掘毒副作用小、價(jià)格低廉的化療藥物已成為醫(yī)藥工作者亟待解決的一大課題。

腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。我國的腫瘤病例數(shù)相當(dāng)龐大，有資料顯示占全世界病例數(shù)的55％。

沙旋覆花(Inulasalsoloides(Turcz.)Ostenf.)為菊科旋覆花屬，多年生草本植物。主要分布在我國新疆、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古、河北、青海北部和東部、山西北部和遼寧西部等地區(qū)。又名絞蛆爬(《內(nèi)蒙古中草藥》)，禿女子草、黃喇嘛、黃花蒿、蓼子樸(《中國沙漠地區(qū)藥用植物》)，小葉旋復(fù)花、額勒森-阿拉坦-都蘇拉(蒙名)、沙地旋覆花、黃蓬花、小旋覆花、山貓眼。

天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有新穎和多樣性的特點(diǎn)。結(jié)構(gòu)新穎的活性天然產(chǎn)物是先導(dǎo)化合物的重要來源之一，其發(fā)現(xiàn)不僅會(huì)推動(dòng)化學(xué)與藥學(xué)研究的進(jìn)展，還可能導(dǎo)致藥物新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。當(dāng)前使用的抗腫瘤藥物中，超過60％是直接或間接來自天然產(chǎn)物，如抗腫瘤藥物紫杉醇和長春花生物堿等。從傳統(tǒng)中藥和藥用植物中尋找具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，研究其作用機(jī)制，從而研制抗腫瘤治療藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

沙旋覆花主要化學(xué)成分較為豐富，倍半萜類為其特征性化學(xué)成分。此外，該植物還含有少量的三萜類成分。倍半萜類是沙旋覆花的主要活性成分，根據(jù)其碳骨架類型旋覆花屬植物中報(bào)道的倍半萜類化合物主要分為無環(huán)倍半萜；裂環(huán)桉型；欖烷型；吉馬烷型和愈創(chuàng)木烷型。此外，旋覆花屬植物還含有少量二萜類化合物；黃酮類化合物及甾體類化合物。我們對(duì)采自新疆和田地區(qū)的沙旋覆花進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究并做了體外抗腫瘤活性檢測，以期從中分離得到具有抗腫瘤活性的化合物。

澤蘭內(nèi)酯是沙旋覆花的提取物，屬于天然產(chǎn)物，為吉馬烷型倍半萜。澤蘭內(nèi)酯對(duì)人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB及小鼠淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞P-388有顯著的抑止作用，于文獻(xiàn)(Bing-Nan ZHOU，Nai-Sheng BAI，Long-Ze LIN.Sesquiterpenes lactones from InulaSalsoloides.Pergamon 1994，36(3):721-724.)中報(bào)道。另外澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞也有明顯的細(xì)胞毒性，于文獻(xiàn)(李勇,叢斌,趙陸.土木香根中3種倍半萜內(nèi)酯化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性及其構(gòu)效關(guān)系的研究.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2010,31(6):621-624.)(Jongkyu Lee，CheolHwangbo,Jung-JoonLee.The sesquiterpene lactone eupatolide sensitizesbreast cancer cells toTRAIL through down-regulation of c-FLIP expression.Oncology reports,2010,23:229-237.)(曾增超.澤蘭內(nèi)酯對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制探討.河北醫(yī)科大學(xué)，2010年.)報(bào)道。但至今未有報(bào)道有關(guān)澤蘭內(nèi)酯對(duì)肝、腸癌細(xì)胞的抑止作用。隨著人們對(duì)其化學(xué)和生物學(xué)研究的深入，其分子作用機(jī)制將逐步明確，這將進(jìn)一步推動(dòng)此類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系研究，并有助于提高沙旋覆花的藥用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決至今未有報(bào)道有關(guān)澤蘭內(nèi)酯對(duì)肝、腸癌細(xì)胞的抑止作用的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：一種澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。

下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)：

上述澤蘭內(nèi)酯為從沙旋覆花或者其他旋覆花屬植物中提取，經(jīng)純化分離得到；或，澤蘭內(nèi)酯為化學(xué)合成方法得到。

上述澤蘭內(nèi)酯的劑型為片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、注射液、粉針劑中的一種。

上述澤蘭內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明首次提出了澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長均有不同程度的抑制作用；且澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用明顯優(yōu)于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?；說明澤蘭內(nèi)酯對(duì)體外腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用，具有較好的藥用前景。

附圖說明

附圖1為化合物澤蘭內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式。

附圖2為化合物澤蘭內(nèi)酯¹H-NMR。

附圖3為化合物澤蘭內(nèi)酯¹³C-NMR。

附圖4為化合物澤蘭內(nèi)酯高分辨質(zhì)譜。

附圖5為澤蘭內(nèi)酯的關(guān)鍵COSY(粗線)和HMBC(箭頭)信號(hào)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。

實(shí)施例1，該澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。

實(shí)施例2，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，澤蘭內(nèi)酯為從沙旋覆花或者其他旋覆花屬植物中提取，經(jīng)純化分離得到；或，澤蘭內(nèi)酯為化學(xué)合成方法得到。

實(shí)施例3，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，澤蘭內(nèi)酯的劑型為片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、注射液、粉針劑中的一種。

實(shí)施例4，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，澤蘭內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

上述澤蘭內(nèi)酯在制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用如下：

一、澤蘭內(nèi)酯的制備

澤蘭內(nèi)酯可為化學(xué)合成方法得到；或，澤蘭內(nèi)酯也可按現(xiàn)有方法從沙旋覆花或者其他旋覆花屬植物中提取，經(jīng)純化分離得到，從沙旋覆花中提取澤蘭內(nèi)酯的步驟如下：a)將沙旋覆花(采自新疆和田地區(qū)，植物樣本由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所民族藥物研究室研究員楊偉俊鑒定，并留樣于新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所食品研究檢測室，標(biāo)號(hào)為S.X.F.0001)全草80kg，用體積分?jǐn)?shù)為50％至95％乙醇浸泡提取，每次浸泡使用的乙醇體積為待提取的沙旋覆花藥材質(zhì)量的5倍，共浸泡提取3次，每次24小時(shí)；合并乙醇浸泡提取液，減壓濃縮至無乙醇味；采用乙酸乙酯萃取濃縮液3次，每次24h，減壓濃縮乙酸乙酯萃取液得浸膏；

b)以石油醚與乙酸乙酯按1:0～0:1的體積比形成的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)一步優(yōu)化于石油醚與乙酸乙酯的體積比為7:3的洗脫液，通過薄層層析檢測，收集石油醚和乙酸乙酯展開體系下，Rf值約0.6，硫酸—乙醇顯紫色的組分，于低于60℃條件下減壓濃縮后析出大量結(jié)晶，結(jié)晶再經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶一次即得到澤蘭內(nèi)酯。

澤蘭內(nèi)酯為白色無定型粉末，ESI/MS給出準(zhǔn)分子峰m/z271.1291[M+Na]⁺，287.1031[M+K]⁺結(jié)合碳譜、氫譜確定分子式為C₁₅H₂₀O₃。該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Bing-Nan ZHOU，Nai-Sheng BAI，Long-Ze LIN.Sesquiterpenes lactones from InulaSalsoloides.Pergamon1994，36(3):721-724.)報(bào)道基本一致，故確定其為eupatolide，命名為澤蘭內(nèi)酯。

澤蘭內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下:

HRESI-MS:271.1291[M+Na]⁺,287.1031[M+K]⁺；

[α]²⁰_D(c＝0.09,MeOH):+37.8^°

UV(MeOH):λmax(logε):206(4.2)nm

IRn_max:3430,1724,1715cm^-1；

¹H-NMR(400MHz in CDCl₃)、¹³C-NMR(100MHz in CDCl₃)波譜數(shù)據(jù)見表1所示。

澤蘭內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)鑒定過程

澤蘭內(nèi)酯為無色結(jié)晶，易溶于氯仿。HR-ESI-MS給出其準(zhǔn)分子離子峰271.1291[M+Na]⁺,287.1031[M+K]⁺，(圖4)推出其分子式為C₁₅H₂₀O₃，計(jì)算出其不飽和度為6，¹H NMR譜(表1，圖2)顯示有一個(gè)甲基信號(hào)在δ_H 1.73(s，15-CH₃)，4個(gè)烯氫信號(hào)6.39(1H，d，J＝4.0Hz，H-13a)，5.58(1H，d，J＝4.0Hz，H-13b)，4.81(1H，dd，J＝12.0，4.4Hz，H-1)，4.86(1H，t，J＝18.4，9.6Hz，H-5)。碳譜(表1，圖3)給出15個(gè)碳信號(hào)，包括三個(gè)烯鍵碳信號(hào)δ_C 129.5(C-1)，142.7(C-4)，127.7(C-5)，135.9(C-10)，138.6(C-11)，120.5(C-13)；一個(gè)酯基碳信號(hào)δ_C170.2(C-12)，以及兩個(gè)含氧碳信號(hào)δ_C75.0(C-6)，70.2(C-8)。分析該化合物的核磁數(shù)據(jù)可以看出，該化合物母核有15個(gè)碳，扣除三個(gè)雙鍵、一個(gè)羰基的4個(gè)不飽和度，還有2個(gè)不飽和度，表明該化合物是雙環(huán)化合物，結(jié)合其生源，該化合物可能是雙環(huán)倍半萜類化合物。綜合分析二維核磁數(shù)據(jù)可以推出該化合物的平面結(jié)構(gòu)(圖1)。至此發(fā)現(xiàn)該化合物與前期工作得到的卵南美菊素在碳譜中僅缺少了一個(gè)甲基和一個(gè)羧基碳的信號(hào)，并且考慮到著兩個(gè)化合物是同種植物中獲得的衍生物，因此提示該化合物結(jié)構(gòu)可能比卵南美菊素少了一個(gè)乙酰氧基基團(tuán)。此外，NOESY譜中也顯示出了該化合物與卵南美菊素相對(duì)構(gòu)型一致的相關(guān)信號(hào)。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，該化合物與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)相同(Chen J,HuangSG,Li FG,et al.Chemicalconstituents in Inula Salsoloides(Turz.)Ostenf.AtaBotamia Sinia.1992；34(1):62-65)(Zhou BN,Bai NS，Lin LZ,et al.Sesquiterpenes lactones from Inula Salsoloides.Phytochemistry.1994；36(3):721-724.)。該化合物確定為澤蘭內(nèi)酯；圖1為化合物澤蘭內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式，圖2為化合物澤蘭內(nèi)酯¹H-NMR，圖3為化合物澤蘭內(nèi)酯¹³C-NMR，圖4為化合物澤蘭內(nèi)酯高分辨質(zhì)譜，圖5為澤蘭內(nèi)酯的關(guān)鍵COSY(粗線)和HMBC(箭頭)信號(hào)圖。

二、采用MTS比色法驗(yàn)證抗腫瘤活性

細(xì)胞株處理

人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29，在37℃、5％CO₂及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)于含10％胎牛血清McCoy’s5A培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基中，細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增長時(shí)進(jìn)行傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁴個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入190μL，孵育18h至24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

模型制備

將腫瘤細(xì)胞株隨機(jī)分組：①正常對(duì)照組(control)：以含10％胎牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基或1640培養(yǎng)基或DMEM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，終體積補(bǔ)充至200μL(補(bǔ)充液與樣品溶液相同)；②篩選樣品組(sample)：每孔加入檢測樣品10μL，終體積達(dá)200μL，化合物終濃度為5μg/mL，樣品與腫瘤細(xì)胞株共同孵育72h進(jìn)行相關(guān)檢測；③陽性藥組(positive)：使用臨床一線抗腫瘤藥物鹽酸拓?fù)涮婵?TPT，MW：393.91)設(shè)置五個(gè)濃度梯度，每孔加入陽性藥10μL，終體積達(dá)200μL，終濃度依次為5μM、1μM、0.2μM、0.04μM、0.008μM，陽性藥與腫瘤細(xì)胞株共同孵育72h進(jìn)行相關(guān)檢測。

活性檢測

模型制備結(jié)束時(shí)，每孔加入100μL MTS混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4h顯色，于酶標(biāo)儀490nm波長處檢測各孔的光吸收值。

選擇初篩腫瘤生長抑制作用超過50％的樣品進(jìn)行復(fù)篩(活性再評(píng)價(jià))，待篩樣品與細(xì)胞共同孵育的濃度梯度設(shè)定為初篩終濃度的1/10至1/3，設(shè)置3個(gè)至5個(gè)梯度，其他方法同上，測量吸光值后計(jì)算IC₅₀。

計(jì)算方法

每組細(xì)胞均以MTS法檢測吸光值，測量后計(jì)算樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。以樣品不同劑量的對(duì)數(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖，可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出該樣品的半數(shù)抑制劑量IC₅₀。

樣品抑制率(％)＝[(OD_control-OD_blank)-(OD_sample-OD_blank)]/(OD_control-OD_blank)×100％

OD_sample：樣品處理組吸光值；OD_control：正常對(duì)照組吸光值；OD_blank：培養(yǎng)板空白孔(無細(xì)胞)吸光值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)澤蘭內(nèi)酯進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞生長抑制活性評(píng)價(jià)。

1、對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用

5μg/mL澤蘭內(nèi)酯可明顯抑制人肝癌細(xì)胞株BEL-7402生長，抑制率為86.14％。對(duì)上述樣品設(shè)置劑量梯度進(jìn)行再評(píng)價(jià)，澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，IC₅₀為1.57μg/mL。陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?的IC₅₀為30.82μg/mL。澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用均顯著高于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?。

2、對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用

5μg/mL澤蘭內(nèi)酯可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29生長，抑制率為92.72％。對(duì)其設(shè)置劑量梯度進(jìn)行再評(píng)價(jià)，澤蘭內(nèi)酯對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用均呈現(xiàn)劑量依賴性，IC₅₀為2.06μg/mL。陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?的IC₅₀為13.26μg/mL。澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用均顯著高于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?。

活性評(píng)價(jià)結(jié)論：樣品體外抗腫瘤作用評(píng)價(jià)見表2所示，從表2可以看出：

1、澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長均有不同程度的抑制作用。陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29體外生長抑制的IC₅₀是30.82μg/mL、13.26μg/mL。

2、澤蘭內(nèi)酯也呈現(xiàn)良好的體外抗腫瘤作用，其對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長抑制IC₅₀是1.57μg/mL、2.06μg/mL。澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用明顯優(yōu)于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?(IC₅₀為30.82μg/mL和13.26μg/mL)。澤蘭內(nèi)酯對(duì)體外腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用。

3、澤蘭內(nèi)酯均具有明顯的抗腫瘤作用，可見：澤蘭內(nèi)酯對(duì)體外腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性，可望作為活性成分用于制備抗腫瘤藥物制劑，具有藥用前景。

綜上所述，本發(fā)明首次提出了澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長均有不同程度的抑制作用；且澤蘭內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用明顯優(yōu)于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?；說明澤蘭內(nèi)酯對(duì)體外腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用，具有較好的藥用前景。

以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)施效果，可根據(jù)實(shí)際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。表1 澤蘭內(nèi)酯的1H-NMR、13C-NMR波譜數(shù)據(jù)

表2 樣品體外抗腫瘤作用評(píng)價(jià)