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癌癥病理演變前期Gankyrin基因mRNA水平的原位雜交檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用

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癌癥病理演變前期Gankyrin基因mRNA水平的原位雜交檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域,更具體地說(shuō),是涉及與癌癥病理演變前期mRNA表達(dá)改 變(病理演變過(guò)程中)的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料,我國(guó)每年癌癥的新增人數(shù)已達(dá)到312萬(wàn),死亡 人數(shù)近260萬(wàn),患者超過(guò)700多萬(wàn),全球每年新增癌癥患者800萬(wàn),死亡人數(shù)接近800多萬(wàn), 患者約有8400多萬(wàn)人,到2020年以上人數(shù)將翻一番,這是一組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本 越來(lái)越高,按癌癥患者的年治療費(fèi)用20萬(wàn)(貧窮地區(qū)可能偏高,發(fā)達(dá)地區(qū)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出20 萬(wàn)),700多萬(wàn)患者,每年的花費(fèi)是1. 4萬(wàn)億人民幣,扣除成本35%約4千億,每年約有1萬(wàn) 億人民幣白白消耗了。而且,癌癥患者大部分會(huì)在治療后不久死亡。因此,現(xiàn)有的臨床癌癥 診治模式一定要改變,本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是提前做到預(yù)防性篩查,在瘤塊沒(méi)有出現(xiàn)之前篩查 Gankyrin基因的mRNA表達(dá)量,對(duì)表達(dá)量降低者,及時(shí)介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療,做到 基因水平癌癥的治未病。
[0003] 2005年美國(guó)衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了抗癌大戰(zhàn)中是失 敗,結(jié)論是癌癥死亡率沒(méi)有降低,其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個(gè)因素是:1.腫瘤細(xì)胞 異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細(xì)胞耐藥性;3.抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善(動(dòng)物模型設(shè)計(jì)不科學(xué)) 等。同時(shí),該報(bào)告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。
[0004] 本發(fā)明人在長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的 早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細(xì)胞膜因子、細(xì)胞核因子、細(xì)胞流式技術(shù))指標(biāo)來(lái)診斷癌癥,都是腫瘤 形成后診斷,前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變,后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋 放、或腫瘤的標(biāo)記物。傳統(tǒng)臨床觀念認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷,這 一概念值得認(rèn)真討論,2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募?xì)胞學(xué)角度 來(lái)分析,1公分的腫塊約有一億個(gè)腫瘤細(xì)胞,2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止 2億個(gè)腫瘤細(xì)胞,從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊,其病理演變過(guò)程相 當(dāng)長(zhǎng),可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外),很難證實(shí)的是在這個(gè)病理演變 過(guò)程中,腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨(dú)的病灶,可能癌細(xì)胞早已遷移到其它組織或器官 生長(zhǎng)。臨床研究早已證實(shí),一旦形成腫塊的同時(shí),其它癌細(xì)胞通過(guò)不同途徑遷移到其它部位 克隆生長(zhǎng),一旦切除原發(fā)灶后,其它器官?gòu)?fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此,在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來(lái)界定早期與否,不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例,在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時(shí),同時(shí)發(fā) 現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶,不在我們表述的內(nèi)容中),其實(shí)這時(shí)已經(jīng)是晚期診斷和晚期治療,這是導(dǎo)致癌 癥死亡率不降的真正原因。
[0005] 隨著分子生物技術(shù)日益完善,功能基因組學(xué),癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開(kāi),為 了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥,已取得長(zhǎng)足進(jìn)步。至今,我們已有可能 在基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平或microRNA)上做更精確的早期篩查和診斷,在癌 變前期或癌細(xì)胞形成(單克?。┣?,就可以做到早期預(yù)測(cè)和篩查。
[0006] 大量的研究證實(shí)Gankyrin基因在癌變前期表達(dá)上調(diào)(肝癌、乳腺癌肺癌、結(jié)腸癌、 胃癌、胰腺癌、前列腺癌、骨髓癌、甲狀腺癌),Gankyrin基因是原癌基因,它的表達(dá)增高導(dǎo)致 細(xì)胞癌變。實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),抑制Gankyrin的表達(dá)則可使藥物誘發(fā)的小鼠癌癥發(fā)生率 明顯降低。而且,Gankyrin基因mRNA在各種人種(白人、黑人、黃種人)癌癥患者外周血白 細(xì)胞中表達(dá)都都高表達(dá)。
[0007] 本發(fā)明選擇多組臨床標(biāo)本(癌癥病人、高危人群、正常對(duì)照)采用核酸原位雜交技 術(shù)和免疫組化方法對(duì)Gankyrin基因mRNA癌癥的早期預(yù)警進(jìn)行檢測(cè)分析。本發(fā)明人在研究 中發(fā)現(xiàn)Gankyrin基因mRNA在癌患者、癌癥高危人群、正常對(duì)照人有明顯的表達(dá)量變化,將 Gankyrin基因mRNA作為癌變病理變化前期篩查指標(biāo),有非常重要的臨床診斷意義。作于癌 變前期癌變前期篩查、及癌癥治療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)警也有非常重要的臨床意義。
[0008] 發(fā)明人在長(zhǎng)期的研究中,得出了一種新理念,癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床 診治模式一定要改變,不能只停留現(xiàn)有治已病(發(fā)病后診治),要做到預(yù)防性診治,做到治未 病,只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率,降低社會(huì)成本和醫(yī)療成本。因此,發(fā)明 人在開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的RNA水平篩查試劑盒及治療藥物中,在理論和技術(shù)上都做了創(chuàng) 新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者),突破了正常組織與腫瘤組 織比較的一貫性研發(fā)思路,來(lái)尋找和開(kāi)發(fā)癌前變的RNA水平,與癌癥早期基因病理生理學(xué) 演變密切相關(guān),而且臨床意義非常重要靶標(biāo)(疾病基因),將臨床上腫瘤形成后診治模式提 高到腫瘤的預(yù)防性診治,爭(zhēng)取了腫瘤診治的時(shí)間和空間,達(dá)到預(yù)防癌癥。
[0009] 目前,Gankyrin基因表達(dá)譜檢測(cè)方法用Northern雜交、基因芯片、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和Solexa測(cè)序等分析技術(shù),而這些方法多用于科研方面,不適應(yīng)臨床應(yīng)用,而檢測(cè)mRNA 比DNA分析更科學(xué)(DNA分析大部分在易感性的表象上,mRNA是DNA功能的體現(xiàn)),比蛋白分 析更可靠(發(fā)明人在采用雙標(biāo)記技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)mRNA與蛋白轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時(shí)空上,有時(shí)候不 同步)。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料采用原位雜交技術(shù)和組化免疫方法檢測(cè)Gankyrin基因mRNA 水平表達(dá)量的檢測(cè)技術(shù)及試劑盒未見(jiàn)報(bào)道。
[0010] 本發(fā)明人在針對(duì)創(chuàng)新性發(fā)明的要求,設(shè)計(jì)了(癌癥患者、高危人群、正常對(duì)照)不同 數(shù)據(jù)例組,用原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明以上癌癥病人Gankyrin基因mRNA都高表 達(dá),高危人群有不同程度表達(dá)10-25%,正常對(duì)照都是零表達(dá)。表明Gankyrin基因mRNA是 癌變前期癌變前期篩查的重要標(biāo)志物。
[0011] 原位雜交技術(shù)(insituhybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來(lái),以標(biāo)記的核酸分子為探針,在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈(即探針),在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交,再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè),從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
[0012] 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確 該分子全部序列,但已知其針對(duì)何靶分子),探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤,探針必須用一定的手段加以標(biāo) 記,以利于以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的 同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn),但 是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害,近來(lái)有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素 標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其 靈敏的。
[0013]根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交,都必須經(jīng)過(guò)五大過(guò)程,即組織細(xì)胞的固定,預(yù)雜交、雜交、沖洗和 顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式,合成的探針(RNA)和檢測(cè)的靶RNA是采用堿基互 補(bǔ)(雜交互補(bǔ))的原理,同時(shí)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間研究和觀察,啟動(dòng)和中止處得殘基對(duì)檢測(cè)的結(jié)果沒(méi) 有影響。
[0014] 鑒于目前臨床上癌變前期的診斷(影像醫(yī)學(xué)和生化指標(biāo)物都是腫瘤形成后的診 斷)是晚期診斷,治療也是晚期治療,也是導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想 完善目前臨床上重大疾病的診治模式,從治已病變成預(yù)防性治未病,達(dá)到預(yù)防性診治,將目 前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無(wú)法檢測(cè)到癌前變mRNA水平量化改變技術(shù),做了創(chuàng)新 性的技術(shù)突破,提供癌前變mRNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項(xiàng)新的癌前變mRNA水平 真正早期篩查的技術(shù),為臨床癌癥的診治爭(zhēng)取時(shí)間和空間。
[0015] 綜上所述,本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒,其包含原位雜交 檢測(cè)探針和標(biāo)記物。其次,本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于癌癥病理演變前期篩查及治療 后轉(zhuǎn)移早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下: 本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒,其包括雜交探針和標(biāo)記物,其中,所述 的雜交探針?lè)謩e具有序列表SEQIDN0:D83197,核苷酸序列長(zhǎng)度是1544bp,⑶S序列是 99. . . 779bp,探針全長(zhǎng)480bp取自⑶S中一段,所述的雜交探針序列如SEQIDNO. 1所示。 [0017]本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是,所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯 色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
[0018]本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。
[0019]本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。
[0020] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。
[0021]本發(fā)明的癌癥病理演變前期Gankyrin基因mRNA篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于,對(duì)癌 癥病理演變前期篩查,及癌變后或治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散發(fā)生預(yù)警,進(jìn)一步配合臨床治療。
[0022] 本發(fā)明還提供一種Gankyrin原位雜交的檢測(cè)方法,包括以下步驟: (1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下,將底物中待測(cè) RNA與雜交探針接觸,形成雜交復(fù)合體;和 (2) 檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
[0023]本發(fā)明所述的檢測(cè)方法,其中優(yōu)選地是,所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為: 核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
[0024]本發(fā)明所述的檢測(cè)方法,其中優(yōu)選地是,所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或 其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是,所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本來(lái)自癌癥 患者、高危人群、健康正常人群。
[0025] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合,以Gankyrin 基因mRNA為檢測(cè)對(duì)象,合成探針是Gankyrin基因雜交互補(bǔ)序列,檢測(cè)的底物是人體血液 標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞的Gankyrin基因mRNA
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