體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0032] 1.本發(fā)明所需主要試劑的制備
[0033] (1)探針合成
[0034] 委托商業(yè)探針合成公司合成探針：
[0035]探針：[FITC]-5'-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列SEQIDNO :1)
[0036] FITC:異硫氰酸焚光素（fluoresceinisothiocyanate)，通過一個(gè)氨基連接分子 與探針5'端相連，
[0037] 以無菌蒸餾水溶解，配制成濃度10ng/y1。
[0038] (2)配制雜交緩沖液：
[0039] 雜交緩沖液包含：20mMTris-HCl，20% 甲酰胺，900mMNaCl。
[0040] (3)配制洗脫緩沖液：
[0041] 洗脫緩沖液包含：20mMTris-HCl，0. 01%SDS，225mMNaCl和 5mMEDTA。
[0042] (4)制備陽性試劑盒性、陰性對照品：分別使用長灘軍團(tuán)菌（ATCC33462)和嗜肺軍 團(tuán)菌（ATCC35072)標(biāo)準(zhǔn)菌株，然后稀釋至0. 5麥?zhǔn)蠞岫?，?. 5mL分裝。
[0043] 將上述制備好的探針、雜交緩沖液、洗脫緩沖液、陰性對照、陽性對照置于同一包 裝盒中，組成試劑盒，封裝。
[0044] 2.試劑盒的應(yīng)用（以環(huán)境水樣本檢測為例）
[0045] (1)樣品處理
[0046] 將200mL水樣注入濾器，開啟真空泵，水樣通過負(fù)壓抽濾至干，直接刮取濾膜上沉 淀于5mL無菌蒸餾水中，取lmL轉(zhuǎn)移至1. 5mlEP管內(nèi)，12000rpm離心1分鐘，棄上清，向沉 淀中加入lmL4%多聚甲醛制成菌懸液，置于4°C過夜固定。12000rpm離心3分鐘，棄上清， 以PBS緩沖液（PH= 7. 6)重懸菌液。取20y1菌液均勻涂于載玻片上，室溫風(fēng)干。
[0047] (2)熒光原位雜交
[0048] 將涂有菌液的玻片依次置于50%，80%和96 %的乙醇溶液中脫水3分鐘，自然風(fēng) 干。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5y1探針溶液以及19. 5y1雜交緩沖液共計(jì)20y1 混合，滴加至玻片中央，置于46°C濕盒中雜交2h，之后于46°C預(yù)熱的洗脫緩沖液洗去未雜 交的探針，去離子水沖洗玻片，避光風(fēng)干。
[0049](3)熒光顯微鏡下觀察
[0050] 調(diào)整激發(fā)光波長至490~495nm，在熒光顯微鏡下觀察玻片。（陽性檢測結(jié)果見圖 1，陰性檢測結(jié)果見圖2)
[0051]3.試劑盒的應(yīng)用（以菌株為例）
[0052](1)樣品處理：
[0053] 用接種環(huán)挑取待檢菌落于1. 5mlEP管內(nèi)制成4%多聚甲醛菌懸液，置于4°C過夜 固定。12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩沖液（PH= 7. 6)重懸菌液。取20y1菌液 均勻涂于載玻片上，室溫風(fēng)干。
[0054] (2)熒光原位雜交：
[0055] 將涂有菌液的玻片依次置于50%，80%和96 %的乙醇溶液中脫水3分鐘，自然風(fēng) 干。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5y1探針溶液以及19. 5y1雜交緩沖液共計(jì)20y1 混合，滴加至玻片中央，置于46°C濕盒中雜交2h，之后于46°C預(yù)熱的洗脫緩沖液洗去未雜 交的探針，去離子水沖洗玻片，避光風(fēng)干。
[0056] (3)焚光顯微鏡下觀察：
[0057] 調(diào)整激發(fā)光波長至490~495nm，在焚光顯微鏡下觀察玻片。
[0058] 4試劑盒特異性和靈敏度試驗(yàn)
[0059] 特異性
[0060] 按照3.試劑盒的應(yīng)用（以菌株為例）中的方法，使用本發(fā)明的方法檢測了 19株 長灘軍團(tuán)菌、4株非軍團(tuán)菌屬菌株以及與探針匹配程度較高的21株非長灘軍團(tuán)菌（包括10 株嗜肺軍團(tuán)菌，1株圣克魯伊軍團(tuán)菌，1株圣海倫軍團(tuán)菌，1株辛辛那提軍團(tuán)菌，4株博茲曼軍 團(tuán)菌，2株麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌，2株杜氏軍團(tuán)菌），進(jìn)行探針的特異性檢測試驗(yàn)。結(jié)果顯示，本發(fā)明的 試劑盒能在多種類似菌中特異性的檢測出長灘軍團(tuán)菌（附圖1和2分別顯示了本發(fā)明的試 劑盒檢測一株長灘軍團(tuán)菌和一株嗜肺軍團(tuán)菌時(shí)的顯微鏡圖像，其他陽性/陰性菌株的檢測 結(jié)果類似）。
[0061] 靈敏度
[0062] 將長灘軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC33462)配制0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海?0倍體積 作梯度稀釋至1〇_7倍，制成人工模擬水樣。使用本發(fā)明的試劑盒檢測，取最低檢測濃度菌 懸液20yl涂布至BCYEa平板，36°C，5%C02，培養(yǎng)72h后計(jì)數(shù)平板上菌落。結(jié)果顯示在 1.49X103cfU/ml的軍團(tuán)菌濃度下，本發(fā)明的試劑盒仍然能檢測出樣本中的長灘軍團(tuán)菌。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交試劑盒，其包括根據(jù)長灘軍團(tuán)菌特異性序列區(qū) 域的熒光標(biāo)記探針。
2.權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述熒光標(biāo)記探針是根據(jù)長灘軍團(tuán)菌16S rRNA中的特異 性區(qū)域設(shè)計(jì)，為[FITC]-5' -CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列為SEQ ID NO :1)。
3. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，還包括熒光原位雜交緩沖液、熒光原位雜交洗脫液、 陽性對照和陰性對照。
4. 權(quán)利要求3所述的試劑盒，其成分為： (1) 探針：[FITC]-5,-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列為SEQIDNO:1)的探針，以無 菌蒸餾水溶解，配制成濃度l〇ng/y1 ; (2) 熒光原位雜交緩沖液：20mMTris-HCl，20%甲酰胺，900mMNaCl; (3) 熒光原位雜交洗脫液：20mM Tris-HCl，0. 01% SDS，225mM NaCl和5mM EDTA ; (4) 陽性對照：長灘軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC33462)，0. 5mllX104個(gè)菌/ml培養(yǎng)物； (5) 陰性對照：嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC35072)，0. 5mllX104個(gè)菌/ml的嗜肺軍團(tuán)菌 培養(yǎng)物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交試劑盒，其包括探針[FITC]-5’-CGTCCTCAGACATCATCC(SEQ ID NO：1)。
【IPC分類】C12Q1-04, C12R1-01, C12Q1-68
【公開號】CN104711342
【申請?zhí)枴緾N201410202061
【發(fā)明人】朱慶義, 顧全, 胡朝暉, 嚴(yán)慧
【申請人】廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2014年5月13日