一種與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的snp411871標(biāo)記及引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與馬氏珠 母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記及引物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 馬氏珠母貝是我國及世界上海水珍珠養(yǎng)殖的主要物種。我國自1965年成功地開 展了馬氏珠母貝人工育苗以來，海水珍珠產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為廣東、廣西及海南部分沿海 地區(qū)海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一。近10多年，我國海水珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量明顯下降，國際競爭 力減弱，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益下滑。就其原因，除了養(yǎng)殖環(huán)境惡化、養(yǎng)殖技術(shù)落后外，還有一個(gè)重要 原因是：多年來不注重種貝的選育和保留，缺乏優(yōu)良品種；種苗質(zhì)量參差不齊，育珠母貝性 狀退化，如生長慢、個(gè)體小型、育珠能力減弱等。為了我國海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展， 培育適合我國海區(qū)養(yǎng)殖的馬氏珠母貝優(yōu)良品種已迫在眉睫。
[0003] 育種技術(shù)有雜交、選擇育種，生物技術(shù)育種及分子育種等多種方法。分子育種是 目前國內(nèi)外研宄的熱點(diǎn)，是育種技術(shù)發(fā)展的主要方向，它具有高效、快捷的特點(diǎn)。分子育 種離不開分子標(biāo)記的開發(fā)，用在海洋貝類遺傳育種研宄的分子標(biāo)記主要有限制片段長度 多態(tài)性（RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP)、錨定簡單重復(fù) 序列（ISSR)、簡單重復(fù)序列（SSR)、單核苷酸多態(tài)性（SNP)、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST)、線粒體 DNA(mtDNA)、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)標(biāo)記（ITS)分子標(biāo)記等。Qiu等對合浦珠母貝不 同群體進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記與生長及珍珠層性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明在野生群體中基因 PmartE05、PmartE35與殼高、總重顯著相關(guān)，基因PmartE64與珍珠層厚度顯著相關(guān)，在養(yǎng)殖 群體中發(fā)現(xiàn)基因PmartE05與殼高顯著的相關(guān)。Cong等利用SNP標(biāo)記研宄太平洋牡蠣的胰 島素相關(guān)多肽基因（〇IRP)的多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在〇IRP基因1.5kb處發(fā) 現(xiàn)31個(gè)SNPs，其中6個(gè)與生長性狀顯著相關(guān)，特別是標(biāo)記T1358G和標(biāo)記G1437A與殼高、殼 長、殼寬、總重、軟體部重5個(gè)生長性狀顯著相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的 SNP411871標(biāo)記的檢測引物。
[0005] 本發(fā)明的與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記的檢測引物，其 特征在于，其核苷酸序列如下：
[0006] 411871FI:GGAAACGGAATTCACATTCATTATCTTTA;
[0007] 411871RI:AATGTCAAGCTGGATATAATTTAGCTCTA；
[0008] 411871F0:AAATTATTGAAACTATTTCACCGATTCG；
[0009] 411871R0:TTGTGATTTCATTTTCGTATCAATATTCTT〇
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的 SNP411871標(biāo)記，其特征在于，其特異性檢測引物為：
[0011] 411871FI:GGAAACGGAATTCACATTCATTATCTTTA;
[0012] 411871RI:AATGTCAAGCTGGATATAATTTAGCTCTA；
[0013] 411871FO:AAATTATTGAAACTATTTCACCGATTCG；
[0014] 411871RO:TTGTGATTTCATTTTCGTATCAATATTCTT〇
[0015] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871 標(biāo)記在鑒定馬氏珠母貝殼長、鉸合線長、軟體部重和閉殼肌重大小中的應(yīng)用，其特征在于， 包括以下步驟：
[0016]a、提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA ;
[0017]b、采用上述引物411871FI、411871RI、411871F0、411871R0對馬氏珠母貝樣品基 因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0018] c、根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對馬氏珠母貝樣品進(jìn)行鑒定，當(dāng)出現(xiàn)具有200bp和171bp大 小2條帶的為AT型；當(dāng)只出現(xiàn)200bp大小1條帶的為AA型；當(dāng)只出現(xiàn)171bp大小1條帶 的為TT型。AT型個(gè)體的殼長、絞合線長、軟體部重和肌肉重顯著大于TT型個(gè)體的樣品；AA 型個(gè)體軟體部重顯著大于TT型個(gè)體。
[0019] 優(yōu)選，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為：25yL;PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠 母貝樣品基因組DNA50ng，2XPCRMixture12.5yL，檢測引物 411871FI2yL、411871RI 2yL、411871F0 0.5yL、411871R0 0.5yL(各引物濃度均為 10pmol/yL)，0.0625UTaq DNA酶，余量為水；反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C40s，56°C40s;72°C40s，35個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 5min。
[0020] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供與馬氏珠母貝殼型和重量大小關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo) 記在馬氏珠母貝分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0021] 利用本發(fā)明的與馬氏珠母貝殼型和重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記的檢測引 物，能夠擴(kuò)增出特定的SNP基因型位點(diǎn)，再根據(jù)PCR擴(kuò)增電泳圖可直觀地比較個(gè)體間殼長、 鉸合線長、軟體部重和閉殼肌重的大小，可直接用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種，如可在生長 早期篩選目標(biāo)性狀，進(jìn)而篩選特定的個(gè)體進(jìn)行品種培育。
【附圖說明】：
[0022] 圖1是與馬氏珠母貝殼型和重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記的擴(kuò)增電泳圖，其 中泳道1-12為馬氏珠母貝樣品，M為marker。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例1:
[0025] 隨機(jī)取來自于同一群體的96個(gè)馬氏珠母貝個(gè)體，清洗干凈后，用電子數(shù)顯卡尺 測量殼型大?。じ?、殼長、殼寬和鉸合線長），用電子天平稱量取其軟體部重、閉殼肌組 織，并一一對應(yīng)記錄，然后分別取一小塊閉殼肌組織置于95%乙醇中，于-20°C保存。使用 HiPureUniversalDNAKit(廣州美基生物公司）對來自96個(gè)馬氏珠母貝個(gè)體的閉殼肌的 基因組DNA進(jìn)行提取，相關(guān)操作參見試劑盒說明書進(jìn)行。DNA提取后，于1.0%的瓊脂糖凝 膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計(jì)測量DNA的濃度和純度，于-20°C保存。
[0026] 與馬氏珠母貝殼型和重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記的檢測引物為：
[0027] 411871FI:GGAAACGGAATTCACATTCATTATCTTTA;
[0028] 411871RI:AATGTCAAGCTGGATATAATTTAGCTCTA；
[0029] 411871FO:AAATTATTGAAACTATTTCACCGATTCG；
[0030] 411871RO:TTGTGATTTCATTTTCGTATCAATATTCTT〇
[0031] 用上述引物411871FI、411871RI、411871F0、411871R0對馬氏珠母貝樣品基因組 DNA在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其PCR反應(yīng)體系為：25yL。PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠 母貝樣品基因組DNA50ng，2XPCRMixture12.5yL，檢測引物 411871FI2yL、411871RI 2yL、411871F0 0.5yL、411871R0 0.5yL(各引物濃度均為 10pmol/yL)，0.0625UTaq DNA酶（廣州東盛生物科技有限公司），余量為水；反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C40s， 56°〇408;72°0 408,35個(gè)循環(huán)；721：延伸51^11。？〇?產(chǎn)物用3%瓊脂糖（廣州康龍科技生物 公司）凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳圖譜。分型電泳圖如圖1所示，出現(xiàn)具有200bp 和171bp大小2條帶的為AT型（泳道2,3,5,7-10);當(dāng)只出現(xiàn)200bp大小1條帶的為AA 型（泳道1，4，11和12);當(dāng)只出現(xiàn)171bp大小1條帶的為TT型（泳道6)。在這96個(gè)個(gè)體 中，AA型個(gè)體29個(gè)，殼長46. 78±6. 48mm，鉸合線長40. 74±4. 34mm，軟體部重5. 44±2. 19， 肌肉重0. 84±0. 43g;AT型個(gè)體有45個(gè)，殼長47. 8±6. 04mm，鉸合線長41. 22±4. 77mm，軟 體部重5. 48±2. 06g，閉殼肌重0. 92±0. 41g，IT型個(gè)體22個(gè)，殼長44. 21±5. 12mm，鉸合線 長 38. 62±3. 76mm，軟體部重 4. 29±1. 59g，閉殼肌重 0. 64±0. 32g。采用SPSS17. 0 軟件中 的LSD進(jìn)行差異比較，AT型個(gè)體的殼長、鉸合線長、軟體部重和閉殼肌重顯著大于TT型個(gè) 體（p〈0. 05)，即認(rèn)為它們之間具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記的檢測引物，其特征在 于，其核苷酸序列如下： 411871FI:GGAAACGGAATTCACATTCATTATCTTTA； 411871RI:AATGTCAAGCTGGATATAATTTAGCTCTA； 411871F0:AAATTATTGAAACTATTTCACCGATTCG； 411871R0:TTGTGATTTCATTTTCGTATCAATATTCTT〇
2. -種與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記，其特征在于，其檢測 引物為： 411871FI:GGAAACGGAATTCACATTCATTATCTTTA； 411871RI:AATGTCAAGCTGGATATAATTTAGCTCTA； 411871F0:AAATTATTGAAACTATTTCACCGATTCG； 4118 71R0:TTGTGATTTCATTTTCGTATCAATATTCTT。
3. 權(quán)利要求2所述的與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記在鑒定 馬氏珠母貝殼長、鉸合線長、軟體部重和閉殼肌重大小中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步 驟： a、 提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA; b、 采用權(quán)利要求1所述的檢測引物41187"1、4118711?1、411871?0、4118711?0對馬氏珠 母貝樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； c、 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對馬氏珠母貝樣品進(jìn)行鑒定，當(dāng)出現(xiàn)具有200bp和171bp大小2條 帶的為AT型；當(dāng)只出現(xiàn)200bp大小1條帶的為AA型；當(dāng)只出現(xiàn)171bp大小1條帶的為TT 型。AT型個(gè)體的殼長、絞合線長、軟體部重和肌肉重顯著大于TT型個(gè)體的樣品；AA型個(gè)體 軟體部重顯著大于TT型個(gè)體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系 為：25yL;PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠母貝樣品基因組DNA50ng，2XPCRMixture 12. 5yL，濃度為10pmol/yL的權(quán)利要求1所述的檢測引物411871FI2yL、411871RI 2yL、411871F00.5yL、411871R0 0.5yL，0.0625UTaqDNA酶，余量為水；反應(yīng)條件為： 94°〇預(yù)變性51^11;941：4〇8,561：4〇8;721：4〇8,35個(gè)循環(huán) ；721：延伸5111111。
5. 權(quán)利要求2所述的與馬氏珠母貝殼型和重量大小關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記在馬氏珠母 貝分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種與馬氏珠母貝殼型與重量大小相關(guān)聯(lián)的SNP411871標(biāo)記及引物和應(yīng)用。引物包括:411871FI:GGAAACGGAATTCACATTCATTATCTTTA；411871RI:AATGTCAAGCTGGATATAATTTAGCTCTA；411871FO:AAATTATTGAAACTATTTCACCGATTCG；411871RO:TTGTGATTTCATTTTCGTATCAATATTCTT。利用本發(fā)明的引物能夠擴(kuò)增出特定的SNP基因型位點(diǎn)，再根據(jù)PCR電泳圖可直觀地比較個(gè)體間殼長、鉸合線長、軟體部重和閉殼肌重的大小，可直接用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104711343
【申請?zhí)枴緾N201410856947
【發(fā)明人】何毛賢, 李耀國
【申請人】中國科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2014年12月31日