一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的snp標(biāo)記的檢測(cè)引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物及其應(yīng)用。檢測(cè)引物包括：ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；AS?SN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。利用本發(fā)明的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物，能夠擴(kuò)增出肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)顯著與肌肉重量相關(guān)聯(lián)，再根據(jù)PCR擴(kuò)增電泳圖可直觀地比較個(gè)體間閉殼肌重的大小，可直接用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種，如可在生長(zhǎng)早期篩選目標(biāo)性狀，進(jìn)而篩選特定的個(gè)體進(jìn)行品種培育。
【專利說(shuō)明】-種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物 及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳及分子標(biāo)記輔助育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與馬氏珠 母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 馬氏珠母貝是我國(guó)及世界上海水珍珠養(yǎng)殖的主要物種。我國(guó)自1965年成功地開(kāi) 展了馬氏珠母貝人工育苗以來(lái)，海水珍珠產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為廣東、廣西及海南部分沿海 地區(qū)海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一。近10多年，我國(guó)海水珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量明顯下降，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng) 力減弱，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益下滑。就其原因，除了養(yǎng)殖環(huán)境惡化、養(yǎng)殖技術(shù)落后外，還有一個(gè)重要 原因是：多年來(lái)不注重種貝的選育和保留，缺乏優(yōu)良品種；種苗質(zhì)量參差不齊，育珠母貝性 狀退化，如生長(zhǎng)慢、個(gè)體小型、育珠能力減弱等。為了我國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展， 培育適合我國(guó)海區(qū)養(yǎng)殖的馬氏珠母貝優(yōu)良品種已迫在眉睫。
[0003] 育種技術(shù)有雜交、選擇育種，生物技術(shù)育種及分子育種等多種方法。分子育種是 目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，是育種技術(shù)發(fā)展的主要方向，它具有高效、快捷的特點(diǎn)。分子育 種離不開(kāi)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，用在海洋貝類遺傳育種研究的分子標(biāo)記主要有限制片段長(zhǎng)度 多態(tài)性（RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP)、錨定簡(jiǎn)單重復(fù) 序列（ISSR)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR)、單核苷酸多態(tài)性（SNP)、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST)、線粒體 DNA(mtDNA)、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)標(biāo)記（ITS)分子標(biāo)記等。Qiu等對(duì)合浦珠母貝不 同群體進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記與生長(zhǎng)及珍珠層性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明在野生群體中基因 PmartE05、PmartE35與殼高、總重顯著相關(guān)，基因 PmartE64與珍珠層厚度顯著相關(guān)，在養(yǎng)殖 群體中發(fā)現(xiàn)基因 PmartE05與殼高顯著的相關(guān)。Cong等利用SNP標(biāo)記研究太平洋牡蠣的胰 島素相關(guān)多肽基因（〇IRP)的多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在〇IRP基因1.5kb處發(fā) 現(xiàn)31個(gè)SNPs，其中6個(gè)與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)，特別是標(biāo)記T1358G和標(biāo)記G1437A與殼高、殼 長(zhǎng)、殼寬、總重、軟體部重5個(gè)生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢 測(cè)引物。
[0005] 本發(fā)明的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物，其特征在于，包 括：
[0006] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0007] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0008] ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0009] ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，其特 征在于，其特異性檢測(cè)引物為：
[0011] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0012] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0013] ASSN815F0 ： TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0014] ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
[0015] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記在鑒定馬 氏珠母貝閉殼肌重大小中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：
[0016] a、提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA ;
[0017] b、采用上述引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0 對(duì)馬氏珠母貝樣 品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0018] c、根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)馬氏珠母貝樣品進(jìn)行鑒定，當(dāng)出現(xiàn)具有207bp和180bp大 小2條帶的為AG型，個(gè)體為閉殼肌重小的樣品；當(dāng)只出現(xiàn)180bp大小1條帶的為GG型，個(gè) 體為閉殼肌重大的個(gè)體。
[0019] 優(yōu)選，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為：12. 5yL PCR反應(yīng)體系如下：包含馬 氏珠母貝樣品基因組 DNA40ng，lXPCR Mixture，引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、 ASSN815R0 各 0·5μΜ，0·125υ Taq DNA 酶，余量為水；反應(yīng)條件為：94°C，5min;94°C35s， 62°C 40s ;72°C 40s，5 個(gè)循環(huán)；94°C 35s，6(TC 40s，72°C 40s，15 個(gè)循環(huán)；94°C 35s，58°C 40s， 72°C 40s，15 個(gè)循環(huán)：72°C延伸 lOmin。
[0020] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記在馬氏珠 母貝分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0021] 利用本發(fā)明的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物，能夠擴(kuò)增出 肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)顯著與肌肉重量相關(guān)聯(lián)，再根據(jù)PCR擴(kuò)增電泳圖可 直觀地比較個(gè)體間閉殼肌重的大小，可直接用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種，如可在生長(zhǎng)早 期篩選目標(biāo)性狀，進(jìn)而篩選特定的個(gè)體進(jìn)行品種培育。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0022] 圖1是與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的擴(kuò)增電泳圖，其中泳道1-12為 馬氏珠母貝樣品，Μ為marker。

【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 隨機(jī)取來(lái)至于同一群體的50個(gè)馬氏珠母貝個(gè)體，清洗干凈后，取其閉殼肌組織用 電子天平稱重并一一對(duì)應(yīng)記錄，然后取一小塊閉殼肌組織置于95%乙醇中，于_20°C保存。 使用HiPure Universal DNA Kit (廣州美基生物公司）對(duì)閉殼肌的基因組DNA進(jìn)行提取， 相關(guān)操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA提取后，于1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性， 紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度和純度，于-20°C保存。
[0026] 與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物為：
[0027] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0028] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0029] ASSN815F0 ： TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0030] ASSN815R0 ：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC
[0031] 用上述引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0 對(duì)馬氏珠母貝樣品基 因組DNA在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：擴(kuò)增體系12. 5ul，包含馬氏珠母 貝樣品基因組 DNA0. 4μ L，6. 25μ L2XPCR Mixture, ΙΟμΜ 引物（ASSN815FI、ASSN815RI、 ASSN815F0、ASSN815R0)各0· 5 μ L, 0· 125U Taq DNA酶（廣州東盛生物科技有限公司），雙 蒸水補(bǔ)足至 12. 5μ L。反應(yīng)條件為：94°C，5min ;94°C 35s，62°C 40s ;72°C 40s，5 個(gè)循環(huán)； 94°C 35s，60°C 40s，72°C 40s，15 個(gè)循環(huán)；94°C 35s，58°C 40s，72°C 40s，15 個(gè)循環(huán)：72°C延伸 lOmin。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖（廣州康龍科技生物公司）凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察 電泳圖譜。分型電泳圖如圖1所示，出現(xiàn)具有207和180bp大小2條帶的AG型（泳道6和 8)，只出現(xiàn)180bp大小1條帶的為GG型（泳道2-4、7、9-12)。在這50個(gè)個(gè)體中，AG型個(gè)體 29個(gè)，肌肉重0. 68±0. 34g，GG型個(gè)體有21個(gè)，閉殼肌重1.07±0. 37g。采用SPSS17. 0軟 件中的單因素方差分析（One-way AN0VA)對(duì)SNP位點(diǎn)與肌肉重進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，GG型個(gè)體的 閉殼肌重顯著大于AG型個(gè)體（p〈0. 01)，即認(rèn)為它們之間具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0001] 說(shuō)明書(shū) 序列犮 <110>中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所 <12?>-種與馬氏珠母K閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物及其應(yīng)用 <160 >4 -210-1 <211 >22 <212>DNA <213>人工序列 <400〉1 TCCATCGTGG ACAAACGTGT AA 22 <2102 <211>27 <212>DNA <213>人1:序列 CjTCjTC \A/\GT AAACTGTATC TCGTGCC 27 <210>3 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 [0002] <4003 TAGAATTGGC AAAGGAACAA GCAT 24 <210>4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400>4 AATAATTCCT AACAGGTGCC CGTC 24
【權(quán)利要求】
1. 一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)引物，其特征在于，包括： ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ； ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ； ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ； ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
2. -種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其特異性檢測(cè)引物為： ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ； ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ； ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ； ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
3. 與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記在鑒定馬氏珠母貝閉殼肌重大小中的應(yīng) 用，其特征在于，包括以下步驟： a、 提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA; b、 采用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0對(duì) 馬氏珠母貝樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； c、 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)馬氏珠母貝樣品進(jìn)行鑒定，當(dāng)出現(xiàn)具有207bp和180bp大小2 條帶的為AG型，個(gè)體為閉殼肌重小的樣品；當(dāng)只出現(xiàn)180bp大小1條帶的為GG型，個(gè)體為 閉殼肌重大的個(gè)體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為： 12.5yL PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠母貝樣品基因組DNA40ng，lXPCR Mixture，檢測(cè) 引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0各0·5μM，0·125UTaqDNA酶，余量 為水；反應(yīng)條件為：941：，51^11 ;941：358,621：4〇8;721：4〇8,5個(gè)循環(huán)；941：358,6〇1：4〇8， 72°C 40s，15 個(gè)循環(huán)；94°C 35s，58°C 40s，72°C 40s，15 個(gè)循環(huán)：72°C延伸 lOmin。
5. 權(quán)利要求2所述的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記在馬氏珠母貝分子標(biāo)記 輔助育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104099415SQ201410289345
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】何毛賢, 李琴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所