一種合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子樣基因Pf-egf1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種合浦珠母貝（Pinctada fucata)表皮生長(zhǎng)因子樣基因Pf-egfl及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF)是一個(gè)大家族，包括表皮生 長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、車?；L(zhǎng)因子- a (transforming growth factor-a，TGF_a)、肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（heparin binding EGF，HB_EGF)、雙調(diào)蛋白 (amphiregulin，AR)、細(xì)胞素（betacellulin，BTC)、神經(jīng)調(diào)節(jié)素（neuregulin，NGR)與表皮 素（印iregulin，EPR)等。它們都包含至少一個(gè)保守的EGF-like結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域由3 對(duì)二硫鍵所維持。EGF 與 EGF 受體（epidermal growth factor receptor，EGFR)結(jié)合，形成 同源或者異源二聚體，引發(fā)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成，從 而誘導(dǎo)細(xì)胞的有絲分裂、迀移和分化等過(guò)程。在目前的報(bào)道中，脊椎動(dòng)物研宄較多，無(wú)脊椎 動(dòng)物較少。Herman等從靜水椎實(shí)螺（Lymnaea stagnalis)中克隆得到EGF同源基因L-egf， 發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)及損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要作用。Eri等人從海鞘中（Herdmania curvata)獲 得了一個(gè)在變態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的Hemps，該基因被證明是EGF家族相關(guān)基因。 Hursh 等人研宄了海膽（Strongylocentrotus purpuratus)中 EGF 家族相關(guān)基因 Sp-egfl 與Sp-egfll，發(fā)現(xiàn)其在海膽的受精以及胚胎發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
[0003] 合浦珠母貝（Pinctada fucata)是我國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖的主要珍珠貝，在我國(guó)主要 分布在南方沿海地區(qū)，特別在廣西合浦至廣東沿海區(qū)域分布的為多，具有很高的價(jià)值。目前 有關(guān)合浦珠母貝功能基因的研宄主要集中在免疫基因和珍珠形成相關(guān)基因上面，如熱休克 蛋白Hsp70基因，組織蛋白酶基因，肌動(dòng)蛋白基因，殼基質(zhì)蛋白相關(guān)基因等，而與生長(zhǎng)、 繁育等具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值性狀相關(guān)的功能基因研宄較少。合浦珠母貝在幼體階段需要經(jīng)歷一系 列變態(tài)發(fā)育過(guò)程，在珍珠養(yǎng)殖過(guò)程中需要進(jìn)行插核手術(shù)，從而導(dǎo)致?lián)p傷。由于EGF具有損傷 修復(fù)的功能，因此對(duì)育珠手術(shù)傷口的恢復(fù)可能會(huì)起作用。但目前還沒(méi)有關(guān)于如何恢復(fù)育珠 手術(shù)損傷和傷口方面的研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子樣基因Pf-egfl和由此推 斷的氨基酸序列。
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因 子樣基因Pf-egfl，該基因Pf-egfl的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 該基因Pf-egf 1的cDNA核苷酸序列的394bp~396bp為起始密碼子ATG， 1093bp~1095bp為終止密碼子TGA，擁有702bp開(kāi)放閱讀框。
[0007] 該合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子樣基因Pf-egf 1，它的氨基酸序列如SEQIDN0. 2所 不〇
[0008] 表皮生長(zhǎng)因子（EGF)家族目前主要在脊椎動(dòng)物中報(bào)道比較多。本發(fā)明利用合 浦珠母貝的轉(zhuǎn)錄組，在貝類首次克隆得到EGF-like基因Pf-egf 1，功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn) Pf-egf 1包含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（l_34aa)和一個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域（170_211aa)，與EGF家族 其他成員及其相關(guān)蛋白相比，Pf-egf 1與他們有著共同的EGF-like結(jié)構(gòu)域（圖1)，包括典 型的6個(gè)半胱氨酸殘基與3個(gè)C末端殘基（圖1)，這與EGF家族及其相關(guān)蛋白是相同的，表 明Pf-egf 1是EGF家族相關(guān)蛋白，表皮生長(zhǎng)因子的6個(gè)半胱氨酸殘基和3個(gè)C末端殘基是 維持其在生物體內(nèi)得活性所必須的。
[0009] EGF家族及其相關(guān)蛋白在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)廣泛的得到，同時(shí)，EGF-like結(jié)構(gòu)域 在單細(xì)胞生物的惡性瘧原蟲(chóng)、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中也都被發(fā)現(xiàn)，表明EGF-like結(jié)構(gòu) 域在物種進(jìn)化過(guò)程中是相對(duì)保守的。目前在貝類報(bào)道的EGF家族及其相關(guān)蛋白基因有4 個(gè)，分別是雜色鮑（Haliotis diversicolor)的HdEGFl基因、光滑雙臍螺（Biomphalaria glabrata)的 EGF 相關(guān)基因、近江牡販（Crassostrea ariakensi)中 Tolliod-like 基因 CaTLL和靜水椎實(shí)螺（Lymnaea stagnalis)中的一個(gè)EGF同源蛋白L_egf。Pf-egf 1與上述 基因的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除了 EGF-like結(jié)構(gòu)域外，其余的氨基酸序列沒(méi)有可信的相似性，進(jìn) 化樹(shù)（圖2)顯示Pf-egfl獨(dú)自聚為一支，表明Pf-egfl是EGF家族及其相關(guān)蛋白的一個(gè)新 成員。
[0010] 上述合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子樣基因Pf-egfl在合浦珠母貝變態(tài)發(fā)育和生長(zhǎng)、創(chuàng) 傷修復(fù)方面的用途。
[0011] EGF家族及其相關(guān)蛋白在高等動(dòng)物中的表達(dá)分布比較廣泛。在人體中，EGF家族 的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuregulin，NRG)在人的乳腺、前列腺、心臟、肝、腎、小腸以及脾中均 有不同程度的表達(dá)。另外，對(duì)小鼠的肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（heparin binding EGF， HB-EGF)研宄發(fā)現(xiàn)HB-EGF在小鼠的肺、骨骼肌、大腦和心臟中的表達(dá)量很高。本發(fā)明利用 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了 Pf-egfl基因在合浦珠母貝不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Pf-egfl在腸中 的表達(dá)量最高，極有可能與腸道容易受到損傷，需要修復(fù)有關(guān)，這與EGF家族成員細(xì)胞素 (betacellulin，BTC)在人中的表達(dá)類似的。
[0012] EGF家族及其相關(guān)蛋白在生物體正常胚胎發(fā)育及其成熟穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮著不同 的作用。表皮素（印iregulin，EPR)在小鼠胚胎發(fā)育的前7天有明顯的表達(dá)，之后就逐漸下 降直至表達(dá)量消失，預(yù)示著表皮素可能參與了小鼠的胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。胚胎發(fā)育中 的小鼠在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuroregulin，NRG)突變后會(huì)出現(xiàn)死亡的情況，表明NRG在小鼠胚 胎發(fā)育的過(guò)程中也起著重要作用。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，Pf-egfl在合浦珠母貝幼蟲(chóng)的擔(dān)輪 期、D型期、殼頂期、眼點(diǎn)期、變態(tài)期呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，并且在變態(tài)期的表達(dá)量最高， 差異顯著（P〈0. 05)，表明合浦珠母貝在變態(tài)期Pf-egfl起著重要作用。張潔等也發(fā)現(xiàn)雜色 鮑的表皮生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白HdEGFl在幼體附著后的表達(dá)量比附著前高出19倍之多，主要 在幼體變態(tài)后的消化道表皮細(xì)胞上集中表達(dá)，說(shuō)明HdEGFl直接參與了消化道的生長(zhǎng)和變 態(tài)后細(xì)胞分化的過(guò)程，與本發(fā)明的結(jié)果類似。
[0013] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0014] (1)本發(fā)明對(duì)合浦珠母貝EGF進(jìn)行了克隆與表達(dá)分析，結(jié)果獲得合浦珠母貝表皮 生長(zhǎng)因子樣基因Pf-egf 1的cDNA全長(zhǎng)序列4107,命名為Pf-egf 1，開(kāi)放閱讀框（0RF) 702bp， 編碼234個(gè)氨基酸，包含一個(gè)信號(hào)肽序列和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)Pf-egf 1 具有一個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域，有6個(gè)半胱氨酸殘基，由3個(gè)二硫鍵維持，是表皮生長(zhǎng)因子家 族及其相關(guān)蛋白的特征結(jié)構(gòu)域，但其余序列與現(xiàn)有相關(guān)基因序列差異較大，是一個(gè)新的 EGF-like 基因；
[0015] (2)本發(fā)明構(gòu)建的合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子樣基因Pf-egf ImRNA在合浦珠母貝外 套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、珍珠囊、腸、性腺中都有表達(dá)，在腸中的表達(dá)顯著高于其他組織； 在合浦珠母貝幼體發(fā)育的擔(dān)輪期、D型期、殼頂期、眼點(diǎn)期和變態(tài)期的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的 趨勢(shì)，并且在變態(tài)期的表達(dá)量極顯著地高于其它時(shí)期。上述結(jié)果表明Pf-egf 1基因在合浦 珠母貝腸道修復(fù)和幼蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育階段起著重要作用，為進(jìn)一步開(kāi)展育珠與生長(zhǎng)調(diào)控奠定了 一定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是實(shí)施例1中Pf-egf 1與EGF家族及其相關(guān)蛋白EGF-like結(jié)構(gòu)域比對(duì)；
[0017]