包含表皮生長(zhǎng)因子的囊泡和含有所述囊泡的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于人類(lèi)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)、美容學(xué)和組織工程的領(lǐng)域，特別地屬于在其組成 中包含表皮生長(zhǎng)因子（EGF)的囊泡類(lèi)型的釋放系統(tǒng)的領(lǐng)域。本發(fā)明的囊泡具有相比于游離 的EGF而言經(jīng)改善的治療效力。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 基于由并入了在治療上有活性的物質(zhì)的兩親性分子構(gòu)成的囊泡系統(tǒng)（通常，脂質(zhì) 體）的藥物釋放系統(tǒng)是制藥業(yè)中最常使用的系統(tǒng)之一，因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁┗钚猿煞值母?的穩(wěn)定性，增加其穿過(guò)生物膜的滲透性，和允許活性物質(zhì)緩慢釋放而無(wú)需反復(fù)施用。
[0003] EGF是在組織再生期間刺激細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)性的主要生長(zhǎng)因子之一。它還通過(guò) 調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的增殖和其迀移來(lái)幫助維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。此外，EGF誘導(dǎo)血管發(fā)生，其 為組織提供了營(yíng)養(yǎng)支持（Hudson 和 McCawley, J. Microsc. Res. Tech. 1998, 43:444-455 ; Koivisto 等人，Exp. Cell Res. 2006,312:2791-2805 ;Liang 等人，Wound Repair Regen. 2008, 16:691-698)。該生長(zhǎng)因子在制藥領(lǐng)域中（Wong 等人，Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001，18:51-71 ;Girdler等人，Am. J. Clin. Oncol. 1995, 18:403-406 ;Haedo等人，Rev. Esp. Enferm. Dig. 1996, 88:409-413 ；Majima, Ophthalmologica 1998,212:250-256), 在美容學(xué)中（Hasegawa 和 Yamamoto, Mech. Ageing Dev. 1992, 66:107-114 ;US 專(zhuān) 利號(hào) 5,618,544)，和在組織工程中（Christopher 等人，Biomacromolecules 2011，12:3139-3146)具有多種應(yīng)用。
[0004] 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了采用不同脂質(zhì)體系統(tǒng)的EGF制劑。作為例子可提及：將EGF包括 在包含磷脂酰甘油（PG)、磷脂酰膽堿（PC)和膽固醇的單層脂質(zhì)體中（Brown等人，Ann. Surg. 1988, 208:788-794)。還報(bào)道了將EGF包括在包含PC、膽固醇和透明質(zhì)酸（Yerushalmi 等人，Arch. Biochem. Biophys. 1994, 313:267-273)或者包含膽固醇和二棕櫚酰基磷脂酰 膽堿（DPPC) ( Alemdaroglll等人，J. Biomed. Mater. Res. A 2008, 85A:271-283 ; Degim 等人，Int. Wound. J. 2011,8:343-354)的多層脂質(zhì)體中。已報(bào)道的另一類(lèi)脂質(zhì)體為多囊泡 脂質(zhì)體，其包含二油?；字Ｄ憠A（DOPC)、二肉豆蔻?；字８视停―MPG)、膽固醇和 油酸甘油酯（Li 等人，Arch. Pharm. Res. 2005, 28:988-994)。
[0005] 另一方面，已報(bào)道了包含與EGF相綴合的陽(yáng)離子型脂質(zhì)的脂質(zhì)體（Kikuchi等 人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227:666-671);包覆有聚乙二醇（PEG)的脂質(zhì) 體，其還包含與PC或與DPPC相組合的膽固醇和二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE) (Li等 人，Int. J. Pharm. 2003,258:11-19)。還已報(bào)道了包含DPPC和溶血磷脂酰膽堿（LPC)的 脂質(zhì)體（Saddi 等人，The Angle Orthodontist 2008,78:604-609 ;Alves 等人，Life Sci.2009, 85:693-699)。
[0006] 采用脂質(zhì)體系統(tǒng)的EGF制劑也已受到專(zhuān)利保護(hù)，例如這樣的專(zhuān)利，其公開(kāi)了： "EGF/脂質(zhì)體"凝膠組合物，以及包括將EGF包載在包含中性和帶負(fù)電荷的磷脂的脂質(zhì)體中 的方法（US專(zhuān)利號(hào)4944948);脂質(zhì)體的凝膠組合物，以及使用帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體和EGF并 且包括帶負(fù)電荷的脂質(zhì)例如PG、PC和膽固醇的方法（國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O 9009782)。另一 個(gè)專(zhuān)利申請(qǐng)涉及局部使用在脂質(zhì)體中的EGF以防止糖尿病性足的切斷術(shù)，并且使用包含PC 和脫氧膽酸鈉的脂質(zhì)體。該專(zhuān)利申請(qǐng)限制于EGF的任何類(lèi)型的脂質(zhì)體/非離子型表面活性 劑脂質(zhì)體（niosomes)用于通過(guò)局部途徑來(lái)治療糖尿病性足的IV和V級(jí)慢性局部缺血性損 傷的用途（國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O 2007/073704)。在現(xiàn)有技術(shù)中，還未發(fā)現(xiàn)將EGF整合入由膽 固醇和陽(yáng)離子型表面活性劑構(gòu)成的囊泡系統(tǒng)中。
[0007] 用于獲得脂質(zhì)體的傳統(tǒng)方法例如薄膜蒸發(fā)（Agrawal等人，J. Liposome Res. 2005, 15:141-155)、脫水-再水化（Kirby 和 Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 1984, 2:979-984)、冷凍-解凍（Ristori 等人，Biophys. J. 2005, 88:535-547) 和擠出（MacDonald 等人，Biochim. Biophys. Actal991, 1061:297-303)具有某些缺點(diǎn)。這 些缺點(diǎn)中的一些與大量的之后難以去除的溶劑的使用相關(guān)，或者與由這些方法中的一些所 要求的高溫相關(guān)，這些將其使用限制于熱穩(wěn)定的物質(zhì)。另一方面，材料的大小和納米構(gòu)造結(jié) 果難以控制，并且它們是在擴(kuò)大期間（多階段工藝過(guò)程）具有低的可重復(fù)性的方法。脂質(zhì) 體制備物的另一個(gè)缺點(diǎn)是其差的穩(wěn)定性。
[0008] 用壓縮流體（CF)或高密度氣體（無(wú)論以液態(tài)還是以超臨界狀態(tài)）作為溶媒來(lái) 進(jìn)行的材料加工在學(xué)術(shù)和工業(yè)上都喚起了很大的期望，以用于制備微米結(jié)構(gòu)化或納米結(jié) 構(gòu)化的材料，例如具有比用常規(guī)方法而得到的那種更大的結(jié)構(gòu)均一性的顆粒材料、囊泡系 統(tǒng)、復(fù)合顆粒、結(jié)構(gòu)化表面等（Holmes 等人，Chem. Eur. J. 2003, 9:2144-2150 ;Cooper, Adv. Mater. 2001，13: im-1114;Cooper，Adv. Mater. 2003,15:1049-1059 ;Woods 等人，了· Mater. Chem. 2004, 14:1663-1678)。CF或高密度氣體是存在于其臨界溫度和壓力附近或 之上的并且在正常條件下為氣體的物質(zhì)。在超臨界的區(qū)域或接近超臨界條件的區(qū)域中，CF 以獨(dú)特的相存在，具有在氣體特性和液體特性之間的中間特性。最常使用的CF為二氧化 碳（CO2)，其被歸類(lèi)為綠色溶劑，因?yàn)樗菬o(wú)毒的，不易燃的，易于去除，在顆粒中沒(méi)有殘留， 便宜，并且易于回收。自90年代之初起，整個(gè)開(kāi)發(fā)了一系列方法，其使用CF來(lái)制備具有 微米范圍、亞微米范圍和納米范圍的顆粒大小的微細(xì)材料（Jung和Perrut, J. Supercrit. Fluid，2001，20:179-219)。CF的溶劑化能力可以通過(guò)溫度和組成的變化而發(fā)生改變（如在 常規(guī)液體溶劑的情況下一樣），和還通過(guò)壓力的變化（其在溶液內(nèi)快得多地進(jìn)行傳傳播）而 發(fā)生改變。因此，這些脫溶方法共同地具有在非常短的時(shí)間段內(nèi)達(dá)到非常高的過(guò)飽和程度 的能力，這有助于向著晶體生長(zhǎng)方向發(fā)展的成核作用，并由此獲得具有非常窄的大小分布、 受控的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和超分子組織的微米顆?；蚣{米顆粒。
[0009] 用于用CF來(lái)獲得微米結(jié)構(gòu)化或納米結(jié)構(gòu)化的材料的方法之一是 稱(chēng)為 DEL0S-SUSP (Depre ssurization of an Expanded Liquid Organic Solution-SUSPension (經(jīng)膨脹的液體有機(jī)溶液-懸浮液的減壓））的方法（國(guó)際 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?WO 2006/079889 ;專(zhuān)利號(hào) EP 1843836 ;Can〇-Sarabia 等人，Langmuir 2008, 24:2433-2437)，其基于事先用CF使之膨脹的有機(jī)溶液的減壓，通過(guò)所述減壓而產(chǎn)生 微米分散或納米分散系統(tǒng)。在該過(guò)程中，CF作為共溶劑起作用，所述共溶劑在確定的壓力 和溫度條件下與作為微米分散或納米分散系統(tǒng)的待穩(wěn)定化的溶質(zhì)的有機(jī)溶液是完全可混 溶的。所述穩(wěn)定化通過(guò)在介質(zhì)（通常為水性介質(zhì)）中添加劑的存在來(lái)實(shí)現(xiàn)，在所述介質(zhì)上 進(jìn)行經(jīng)膨脹的溶液的減壓，其中所述添加劑可以為乳化劑、離子型和非離子型去污劑、表面 活化劑、膠體穩(wěn)定劑和保護(hù)劑。通過(guò)該方法，可以獲得微米分散和/或納米分散系統(tǒng)，例如 脂質(zhì)體、乳狀液或懸浮液。脂質(zhì)體或囊泡由膽固醇和其他膜試劑（例如磷脂和表面活性劑） 構(gòu)成，并且對(duì)于其制備，需要將膽固醇和/或其他脂質(zhì)溶解在經(jīng)膨脹的有機(jī)溶液中，和使后 者在表面活性劑的水溶液中減壓。
[0010] 為了可能通過(guò)DELOS-SUSP將活性物質(zhì)摻入到囊泡或脂質(zhì)體中，和為了產(chǎn)生相應(yīng) 的囊泡，需要將活性物質(zhì)溶解在初始的經(jīng)膨脹的有機(jī)溶液中，或者溶解在其中進(jìn)行所述經(jīng) 膨脹的溶液的減壓的水溶液中，并且在這兩種情況下，所述溶解應(yīng)當(dāng)在脂質(zhì)、去污劑或表面 活化劑存在下進(jìn)行。
[0011] 在陽(yáng)離子型表面活性劑之中，季銨類(lèi)型的陽(yáng)離子型表面活性劑（QUAT)已在制藥 領(lǐng)域中和在美容學(xué)中廣泛使用。在制藥領(lǐng)域中，已經(jīng)通過(guò)局部、眼、口服、頰和鼻途徑來(lái)使 用它們。以前，報(bào)道了使用DELOS-SUSP技術(shù)來(lái)制備膽固醇：溴化鯨蠟基三甲基銨（CTAB) 的納米囊泡。通過(guò)該技術(shù)來(lái)?yè)饺胨苄曰衔锏睦訛槊枋鲇趨⒖嘉墨I(xiàn)"Liposomes and other vesicular Systems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine