加壓素-2受體的肽拮抗劑的制作方法
【專利說明】加壓素-2受體的肽拮抗劑
[0001] 本發(fā)明涉及可用于治療、診斷、醫(yī)學(xué)成像、藥物篩選和研宄的一組新的具有加壓 素-2受體拮抗活性的蛇毒堿性蛋白酶抑制劑。
[0002] G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)構(gòu)成內(nèi)在膜蛋白最大的家族。已經(jīng)鑒別超過800個(gè)GPCR， 相關(guān)的基因占人基因組中編碼序列的2~3%。它們參與調(diào)控大部分的生理功能，并且是 當(dāng)前銷售的大約30 %的藥物的靶標(biāo)。GPCR中，精氨酸-加壓素 V2受體亞型（也稱為加壓 素-2、加壓素2、加壓素類型2或V2受體，并且縮寫為AVPR2或V2R)被認(rèn)為是結(jié)合到細(xì)胞 內(nèi)環(huán)化腺核苷單磷酸酯（cAMP)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的受體的原型。它代表基本的治療模型。
[0003] 精氨酸-加壓素（AVP)也稱為抗利尿激素，是在下丘腦產(chǎn)生的9個(gè)氨基酸的環(huán) 肽。它通過3種不同的受體亞型發(fā)揮作用：加壓素 Ia(VlaR)、加壓素 Ib(VlbR)和加壓素 2 (V2R)。VlaR和VlbR的功能通過它們與G蛋白質(zhì)Gq的相互作用而介導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃 度的提高。VlaR主要在肝臟、平滑肌細(xì)胞（血管收縮）、血小板、腦、視網(wǎng)膜和生殖器官中表 達(dá)，而VlbR主要在垂體前葉表達(dá)，在此在應(yīng)激響應(yīng)中其刺激作用控制皮質(zhì)激素軸。VlbR還 在胰腺和腎上腺中表達(dá)，其在此調(diào)節(jié)胰高血糖素、胰島素和兒茶酚胺的分泌。V2R位于腎收 集管，其在此結(jié)合G蛋白。G蛋白活化腺苷酸環(huán)化酶，轉(zhuǎn)而導(dǎo)致環(huán)化AMP的產(chǎn)生提高。cAMP 活化蛋白激酶A，蛋白激酶A磷酸化和活化負(fù)責(zé)腎臟中水的再吸收的稱為水通道蛋白的水 通道。V2R還在內(nèi)耳中表達(dá)，其在此調(diào)節(jié)滲透壓。
[0004] V2R參與主要生理功能的調(diào)節(jié)，并且是用于開發(fā)治療病癥的新治療藥物的靶標(biāo)。 已經(jīng)開發(fā)了稱為vaptan的非肽類V2R拮抗劑，并在許多臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試，但是它們 中大多數(shù)由于其肝毒性而未得到藥物批準(zhǔn)機(jī)關(guān)的批準(zhǔn)。目前，F(xiàn)DA和/或EMEA僅批準(zhǔn)了 Tolvaptan(0PC-41061)和 Conivaptan(YM-087)。
[0005] 以正常容量性低鈉血癥或高容量性低鈉血癥為特征的病理狀況
[0006] AVP的過度分泌是諸如低鈉血癥的疾病的主要病理原因，并且解釋了為何使 用V2R拮抗劑在以正常容量性低鈉血癥或高容量性低鈉血癥為特征的病理狀況中，例 如在SIADH (抗利尿激素分泌不當(dāng)綜合征）、肝硬化和充血性心力衰竭（CHF ;Ghali et al.，Cardiology, 2008, 111，147-157)中，如此有效。SIADH 由 AVP 的過度分泌引起，AVP 的過度分泌導(dǎo)致過量的水的留存并由此產(chǎn)生Na+濃度的減小以及肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 的水腫。V2R拮抗劑通過它們的利尿作用提高血清的Na +水平，或使血清的Na+水平正 常。Tolvaptan (0PC-41061)和 Conivaptan (YM-087)已經(jīng)被 FDA 和 / 或 EMEA 批準(zhǔn)用于 診斷正常容量性低鈉血癥或高容量性低鈉血癥、SIADH、充血性心力衰竭和肝硬化的患者 (Arai et al.,Curr Opin Pharmacol. , 2007, 7, 124-129 ；Manning et al. , Prog. Brain Res.，2008, 170, 473-412)。V2R拮抗劑可能潛在有益于以正常容量性低鈉血癥或高容量 性低鈉血癥為特征的其它病理狀況（例如腦水腫）（Walcott et al. ,Neurotherapeuti cs, 2012, 9, 65~72) 〇
[0007] 抗利尿不適當(dāng)腎病綜合征（Nephrogenic Syndrome of Inappropriate Antidiuresis, NSIAD)
[0008] NSIAD的起因是V2R突變，例如負(fù)責(zé)受體的組成型活性的R137C和R137L。盡 管血清加壓素水平低，但患者表現(xiàn)為低鈉血癥以及高的尿的滲透摩爾濃度。在細(xì)胞培 養(yǎng)物（Tenenbaum et al.，PLoS One，2〇〇9, 4, e8333)或患有NSIAD 的患者（Decaux et al.，JASN, 2007, 18, 606-612)中，V2R 拮抗劑 Satavaptan 和 Tolvaptan 不能夠抑制該組成 型活性。
[0009] 先天腎原性尿崩癥（Congenital Nephrogenic Diabetes Insipidus，cNDI)
[0010] 該疾病與V2R的失活突變相關(guān)。不足的受體被隔離在細(xì)胞內(nèi)，并且不能被循環(huán) 的AVP獲得。這導(dǎo)致特別是在兒童中的具有嚴(yán)重脫水的多尿癥。V2R拮抗劑（vaptan) 作為藥物伴侶，它們能夠滲透細(xì)胞，并且可解救突變的受體（Morello et al.，J.Clin. Investigation, 2000, 105, 887-895)。在一些情況下，這使得受體被AVP刺激，以恢 復(fù)抗利尿作用（Bernier et al.，J. Am. Soc. Nephrol.，2006, 17, 232-243 ;Robben et al.，Am. J. Physiol. Renal. Physiol.，2007, 292, 253-260)。Vaptan 在臨床試驗(yàn)中進(jìn) 行了測(cè)試，但是大多數(shù)由于其毒性而未被FDA批準(zhǔn)（Manning et al.，Prog. Brain Res. ,2008, 170,473-512)。目前，僅 Tolvaptan 被 FDA 批準(zhǔn)。
[0011] 多囊性腎病
[0012] 多囊性腎病特征為出現(xiàn)許多囊，在大多數(shù)患者中最終導(dǎo)致末期腎衰竭。盡 管在血液中具有高的加壓素濃度，但在PKD1和PKD2基因中具有突變的患者不能夠 濃縮尿。對(duì)于該病癥目前可用的治療為透析或移植。V2R拮抗劑在隱性和顯性多 囊性腎病的不同動(dòng)物模型（包括⑶l pey/pey小鼠模型）中被證明減緩病程（Gattone et al. , Nature Medicine,2003, 9, 1323-1326 ；Torres,V.E. , Clin.J.Am. Soc. N印hrol.，2008, 3, 1212-1218 ;Wang et al.，J. Am. Soc. N印hr.，2008, 19, 102-108)。CDlpcy/ pey小鼠是由編碼腎胱素_3(n印hrocystin-3)的NPHP3基因中的錯(cuò)義突變引起的常染色體 隱性囊性腎病的模型，腎胱素-3是參與腎小管的發(fā)育和功能的蛋白質(zhì)。該突變導(dǎo)致腎囊腫 的形成以及末期腎衰竭。此外，對(duì)于患有常染色體顯性多囊性腎病的患者的III期臨床試 驗(yàn)顯示，在3年期間給患者施用Tolvaptan減少了囊襯里上皮細(xì)胞的增殖（Higashihara et al. , Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , 2011, 6, 2499-2507) 〇
[0013] 癌癥
[0014] 通過與抑制蛋白（arrestin)的相互作用，V2R刺激導(dǎo)致cAMP和MAP激 酶參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，從而有助于增殖反應(yīng)。例如，注射AVP到小鼠引 起可被V2R詰抗劑抑制的腎小管上皮細(xì)胞的增殖（Alonso et al.，Endocrinolo gy，2009, 150, 239-250)。此外，諸如V2R拮抗劑的利尿劑能夠抑制腎癌細(xì)胞（Bolignano et al·，Urol. Oncol. ,2010, 28, 642-647)和肺癌細(xì)胞（Pequeux et al·，Endocr. Relat. Cancer, 2004, 11,871-885)的增殖。這些結(jié)果表明V2R拮抗劑是抗不同類型的癌癥的良好 的治療候選物。
[0015] 血栓
[0016] 血管性血友病因子（VWF)涉及初步止血。已經(jīng)證明AVP還有V2R特異性激動(dòng)劑， dDAVP(minirin@)，通過它們與V2R的相互作用而提高VWF和VIII因子的水平（Kaufmann et al.，J. Clin. Invest.，2000, 106, 107-116)。過量的凝固可導(dǎo)致血栓（血塊），可通過使 用V2R拮抗劑而限制凝血因子的分泌，得到治愈。
[0017] 美尼爾氏病
[0018] 在法國，估計(jì)美尼爾氏病的發(fā)病率為1/13, 300,其發(fā)病機(jī)制大部分未知。內(nèi) 淋巴腫脹認(rèn)為是特有的病癥，其可由內(nèi)淋巴分泌過多或由再吸收不充分引起。內(nèi)耳美 尼爾氏病看來是諸如眩暈、惡心、耳鳴和聽力喪失的癥狀的根源。耳蝸壓力提高被認(rèn)為 損害了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞正確檢測(cè)聲波或運(yùn)動(dòng)的能力（Kitahara et al.，J. Neuroendocrin ol.，2008, 20, 1295-1300)。目前，使用抑制碳酸酐酶并用作低鉀血利尿劑的乙酰唑胺（醋氮 酰胺）進(jìn)行治療。V2R可通過降低向內(nèi)耳的滲透壓而用于治療美尼爾氏病。
[0019] 雖然已經(jīng)清楚地證明了 vaptan對(duì)多種病癥均具有V2R拮抗劑的治療效果，但是它 們的治療用途仍受限于一些主要缺點(diǎn)：
[0020] 一Vaptan由于它們對(duì)細(xì)胞色素 CYP3A4的抑制作用而具有肝毒性。由于這個(gè)原因， 使用它們必須要嚴(yán)格監(jiān)測(cè)患者，并且限制它們的長期施用。一些Vaptan僅靜脈注射，這限 制了它們用于住院患者。
[0021] 一Vaptan僅對(duì)V2R具有一些選擇性，V2/Vla選擇性指數(shù)為112 (Satavaptan)至 0·15 (Conivaptan)〇
[0022] 一Vaptan是MP激酶活化的激動(dòng)劑。因此，它們不能完全阻斷特異的V2R相關(guān)信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
[0023] -Vaptan在生理緩沖液中溶解度差，并且生物可用度有限（Bernier et al.，JASN，2006, 17, 591-)。
[0024] 因此，需要新的V2R拮抗劑，與目前可用的非肽V2R拮抗劑相比，所述新的V2R拮 抗劑用于治療用途的性能得到改善，尤其其V2R選擇性提高且毒性降低。
[0025] Kunitz結(jié)構(gòu)域是Kunitz-型蛋白酶抑制劑的活性結(jié)構(gòu)域。它們相對(duì)較小，具有 約50~60個(gè)氨基酸的長度，并具有富含二硫鍵的α和β折疊結(jié)構(gòu)。具有該結(jié)構(gòu)域的大 多數(shù)序列屬于kunitz/牛胰臟胰蛋白酶抑制劑家族，包括牛胰臟胰蛋白酶抑制劑（BPTI或 堿性蛋白酶抑制劑）和許多其它成員，例如蛇毒堿性蛋白酶抑制劑（如綠窄頭眼鏡蛇毒素 (dendrotoxins))、哺乳動(dòng)物的間-α -胰蛋白酶抑制劑、trypstatin(在老年癡呆癥的淀粉 樣蛋白的可選拼接形態(tài)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域）、在VI型和VII型膠原蛋白的α-l和α-3鏈的 C-末端的結(jié)構(gòu)域、組織因子通路抑制劑的前體和在豆類種子中包含的Kunitz STI蛋白酶 抑制劑。
[0026] 綠窄頭眼鏡蛇毒素為一組從黑曼巴蛇（Dendroaspis polyepis polyepis)和東 部綠曼巴蛇（Dendroaspis angusticeps)的毒液中分離的神經(jīng)毒素，它們?yōu)樯窠?jīng)元中特定 亞類的電壓門控鉀離子通道的選擇性阻斷劑，從而增強(qiáng)了乙酰膽堿在肌肉神經(jīng)接合處的釋 放。由于高的效能以及對(duì)鉀離子通道的選擇性，綠窄頭眼鏡蛇毒素代表了為研宄這些離子 通道蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及用于治療人類疾病的有用的藥物制劑（W0 2007/019267)。綠 窄頭眼鏡蛇毒素是由少于100個(gè)氨基酸（通常約57~60個(gè)氨基酸）的單肽鏈組成的小蛋 白，所述單肽鏈折疊成Kunitz結(jié)構(gòu)，即富含二硫鍵的α和β折疊，所述折疊包含具有1-6、 2-4、3_5連接的3個(gè)二硫鍵，并且排列形成扭曲的雙鏈反平行的β折疊片，隨后是α螺旋 (Berndt et al. , J. Mol. Biol. , 1993, 234, 735-750) 〇
[0027] 本發(fā)明人已經(jīng)從綠曼巴蛇的毒液分離了新的毒素，并且他們已經(jīng)證明命名為 U-Da2a的該毒素是kunitz/牛胰臟胰蛋白酶抑制劑家族的蛇毒堿性蛋白酶抑制劑的成員， 是競(jìng)爭(zhēng)性和選擇性的V2R拮抗劑。他們還發(fā)現(xiàn)U-Da2a序列的第15~18位中的氨基酸基序 對(duì)于U-Da2a對(duì)V2R的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗活性至關(guān)重要，并且在這些位點(diǎn)具有相似的基序的其它蛇 毒堿性蛋白酶抑制劑也是V2R拮抗劑，而不具有該基序的蛇毒堿性蛋白酶抑制劑不是V2R 拮抗劑。這些結(jié)果允許定義一組新的具有V2R拮抗活性的蛇毒堿性蛋白酶抑制劑，包括具 有該具體的氨基酸基序的新的以及已知的綠窄頭眼鏡蛇毒素。
[0028] 作為V2R的肽拮抗劑，該組蛇毒堿性蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)可用于各種應(yīng)用，包 括治療、診斷、治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)、醫(yī)學(xué)成像、藥物篩選和研宄。具體地，這些蛋白為治療涉及 V2R通