專利名稱：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種生物醫(yī)學(xué)中對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)最初是從血清中分離出的一種能夠刺激肝細(xì)胞增殖的多肽生長(zhǎng)因子。研究結(jié)果表明，HGF是α、β鏈組成，含728氨基酸的異二聚體。
HGF的受體是由原癌基因c-met編碼的跨膜氨酸蛋白的激酶。HGF通過(guò)與其受體c-Met相結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用。HGF的主要作用包括1、作為有絲分裂原刺激細(xì)胞增殖生長(zhǎng)；2、促進(jìn)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分化；3、促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)；4、抗致細(xì)胞凋亡的作用，延長(zhǎng)細(xì)胞的存活；5、參與上皮細(xì)胞(如腎小管上皮細(xì)胞)的成管過(guò)程和器官的形成；6、能夠加速某些癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，HGF是具有多種生物活性作用的生長(zhǎng)因子，其在機(jī)體器官生長(zhǎng)發(fā)育、組織或臟器損傷的修復(fù)，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)過(guò)程中都起著十分重要的作用。
體內(nèi)HGF只產(chǎn)生于間質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。HGF的受體主要分布于各臟器及其腫瘤組織內(nèi)的上皮細(xì)胞中。在疾病狀態(tài)下，如重癥肝炎、腎功能衰竭及某些腫瘤，循環(huán)中HGF水平可發(fā)生顯著的變化。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)機(jī)體HGF濃度將有助于疾病的診斷，也為應(yīng)用HGF治療慢性肝炎、慢性腎功能衰竭提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
三、技術(shù)內(nèi)容1、技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種方便、可靠的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法。
2、技術(shù)方案本發(fā)明的特征在于測(cè)定的方法為首先建立抗肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體和多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法測(cè)定肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體的制法為以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子多次免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株融合，得到雜交瘤細(xì)胞株，再將雜交瘤細(xì)胞株植入小白鼠腹腔內(nèi)，待1～2周腹水形成后，收集腹水，經(jīng)離心、純化后即得到抗人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體。酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法為酶聯(lián)吸附測(cè)定方法或酶聯(lián)免疫印跡法。
3、技術(shù)效果
HGF是95Kd的糖蛋白，在正常循環(huán)血液及其它體液中含量甚低。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(ELASA)可以有效地檢測(cè)HGF水平。同時(shí)，抗HGF抗體還能夠有效地抗HGF的生物活性，用于腫瘤的臨床治療。在疾病狀態(tài)下，如重癥肝炎，腎功能衰竭，循環(huán)中HGF水平可發(fā)生顯著的變化。及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)機(jī)體HGF濃度將有助于疾病的診斷，也為應(yīng)用HGF治療慢性肝炎、慢性腎功能不全提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1抗人HGF單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)的建立材料4～6周齡的Balb/c小鼠，不拘雌雄。骨髓瘤細(xì)胞株，人重組HGF(R & D Co.USA)。
方法以人重組HGF多次免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株融合。經(jīng)篩選后得10個(gè)雜交瘤細(xì)胞株，分別將雜交瘤細(xì)胞株植入小鼠腹腔內(nèi)，待1～2周腹水形成后，收集腹水。經(jīng)離心，純化后即得到抗人HGF單抗。
抗HGF單抗的鑒定采用免疫印跡法(Western Blot)鑒定抗體的特異性。
實(shí)施例2應(yīng)用抗人HGF單抗，建立檢測(cè)HGF濃度的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELASA)。
1、材料HGF重組人HGF(Genotech Co.USA)，單抗及多克隆抗體，辣根過(guò)氧化酶、蛋白A，和標(biāo)記辣根過(guò)氧化酶的蛋白A。
2、方法(A)酶與抗體的偶聯(lián)將辣根過(guò)氧化酶溶于0.1M的碳酸緩沖液中(pH9.2)，加入新配制的過(guò)碘酸鈉，再加抗HGF抗體，混勻后室溫下避免光放置2h。加Sephadex G-25，以碳酸鹽緩沖液流洗，再加新配制的NaBH4至洗脫物中，室下避光放置30min。加飽和過(guò)硫酸銨溶液，4℃振搖30min后，離心棄上清，TEN緩沖液溶解沉積，透析過(guò)液。酸出偶聯(lián)物，加入適量牛血清的蛋白溶液，-20℃保存待用。
(B)檢測(cè)HGF的ELASA方法用1μg/ml的單抗HGF單抗包被ELASA板放室溫2h，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)洗滌3遍后，加5％牛血清白蛋白封閉，室溫下1h。PBS洗滌3遍后，加入不同濃度人HGF或待側(cè)標(biāo)本，室溫孵育60min，PBS洗滌3次，加入標(biāo)記的抗HGF多克隆抗體，繼續(xù)在室溫下作用60min，隨后PBS洗滌3遍，加入200μl顯色液，室溫下作用10～20min，450μm波長(zhǎng)下，ELASA儀比色，記錄OD值。
4、結(jié)果本方法可以數(shù)異性地檢測(cè)HGF，重復(fù)性好。其相關(guān)系數(shù)0.982，最低檢測(cè)濃度為0.2μg/ml。
實(shí)施例3抗人HGF單抗中和HGF，封閉HGF的生物學(xué)作用。
1、材料人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ1，R & D Co，USA)，人HGF(Genotech Co.USA)，抗α平滑肌動(dòng)蛋白抗體(αSMA，SigmaCo.USA)，抗人HGF抗體。
2、方法將5％小牛血清MEM培養(yǎng)中的HKC，換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)，加入TGFβ1的同時(shí)，加或不加不同濃度的抗HGF單抗，作用于2h后收集細(xì)胞于SDS標(biāo)本緩沖液中，進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)αSMA表述。
3、結(jié)果與對(duì)照組相比，TGFβ1能夠刺激HKC表達(dá)αSMA，人HGF能夠抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HKC表達(dá)αSMA。經(jīng)抗人HGF單抗孵育的人HGF加入培養(yǎng)液中，TGFβ仍然能夠刺激HKC表達(dá)αSMA，說(shuō)明，此時(shí)，抗人HGF單抗已經(jīng)完全中和人HGF，使其失去抑制TGFβ1的作用。即使人HGF單抗能夠封閉人HGF的生物學(xué)作用。
權(quán)利要求
1.一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法，其特征在于測(cè)定的方法為首先建立抗肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體和多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法測(cè)定肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法，其特征在于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體的制法為以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子多次免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株融合，得到雜交瘤細(xì)胞株，再將雜交瘤細(xì)胞株植入小白鼠腹腔內(nèi)，待1～2周腹水形成后，收集腹水，經(jīng)離心、純化后即得到抗人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法，其特征在于酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法為酶聯(lián)吸附測(cè)定方法或酶聯(lián)免疫印跡法。
全文摘要
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法是一種生物醫(yī)學(xué)中對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子進(jìn)行方便、可靠的測(cè)定方法,該肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法,其特征在于測(cè)定的方法為:首先建立抗肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體和多克隆抗體,在此基礎(chǔ)上應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法測(cè)定肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體的制法為:以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子多次免疫Balb/c小鼠,取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株融合,得到雜交瘤細(xì)胞株,再將雜交瘤細(xì)胞株植入小白鼠腹腔內(nèi),待1～2周腹水形成后,收集腹水,經(jīng)離心、純化后即得到抗人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體。酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法為酶聯(lián)吸附測(cè)定方法或酶聯(lián)免疫印跡法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1376923SQ0211285
公開(kāi)日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2002年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日
發(fā)明者劉友華, 楊俊偉, 陳實(shí)平 申請(qǐng)人:劉友華, 楊俊偉, 陳實(shí)平