本發(fā)明涉及一種兩種人galig重組蛋白的表達(dá)及抗血清的制備方法，屬于獲得肽的基因工程方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人類半乳糖凝集素-3 (galectin-3，Gal-3) 由基因LGALS3編碼，其中有兩個(gè)內(nèi)部基因galig（galectin-3 internal gene），它們的開放閱讀框（ORF，open reading frame）與Gal-3的ORF發(fā)生部分重疊，但是編碼蛋白的氨基酸序列與Gal-3完全不同，其中一種主要分布于線粒體中，故稱為mitogalig，編碼蛋白為Mitogaligin，另一種主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，故稱為cytogalig，編碼蛋白為Cytogaligin（參見序列1）。已有研究表明，兩者均參與細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。它們可能是通過促進(jìn)細(xì)胞色素 c 的釋放, 從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，mitogalig和cytogalig為腫瘤治療和抗腫瘤藥物研發(fā)提供新的希望。然而如何很好的實(shí)現(xiàn)人mitogalig和cytogalig密碼子優(yōu)化和化學(xué)合成，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

基于此，做出本申請(qǐng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有人類半乳糖凝集素-3表達(dá)與合成過程中所存在的上述缺陷，本申請(qǐng)根據(jù)DNAstar/EditSeq對(duì)人mitogalig和cytogalig進(jìn)行密碼子優(yōu)化并進(jìn)行化學(xué)合成，制備其原核表達(dá)重組質(zhì)粒并誘導(dǎo)其重組蛋白的表達(dá)以及制備其小鼠抗血清，為研發(fā)抗腫瘤藥物以及相關(guān)腫瘤診斷制劑奠定基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采取的技術(shù)方案如下：

兩種人galig重組蛋白的表達(dá)及抗血清的制備方法，具體步驟如下：

（1）密碼子優(yōu)化：

對(duì)大腸桿菌20個(gè)氨基酸所對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后對(duì)人mitogalig和cytogaligORF進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化的mitogalig和cytogaligORF進(jìn)行化學(xué)合成并連接至pET-28b的Nde I和Xho I克隆位點(diǎn)上，制備重組質(zhì)粒pET-28b-mitogalig-Homo和pET-28b-cytogalig-Homo；

（2）重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

①將pET-28b-mitogalig質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，將轉(zhuǎn)化液在含卡那霉素Kanamycin的瓊脂盤上劃線后37℃培養(yǎng)12 h，獲得大量單菌落；

②在誘導(dǎo)重組蛋白前一天，挑取單菌落接種于1 mL LB培養(yǎng)液中，進(jìn)行12h的前培養(yǎng)；

③將前培養(yǎng)按1%的體積接種于20 mL LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 介于0.7～1.0時(shí)，取菌液并向其中加入IPTG，然后繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)后，離心并徹底去上清；

④pET-28b-cytogalig-Homo按照上述步驟①-③相同的方法和步驟進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

步驟（1）中，所述的優(yōu)化是指：人mitogalig和cytogaligORF中某氨基酸所對(duì)應(yīng)的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率較高的，則保留該密碼子；反之，當(dāng)使用的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率很低的或不出現(xiàn)的時(shí)，則對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，將原密碼子修改為大腸桿菌的密碼子。步驟①中，所述的瓊脂盤中，卡那霉素Kanamycin的含量為50 μg /mL。步驟②和步驟③中，所述的LB培養(yǎng)液中，卡那霉素Kanamycin的含量為50 μg /mL。

進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：

步驟③中，所述的IPTG在菌液中的終濃度為0-1 mmol/L；添加IPTG后，所述的培養(yǎng)時(shí)間為2-3小時(shí)。

采用上述方法表達(dá)的重組蛋白作為抗原，將其與弗氏佐劑充分乳化，所形成的乳化劑注射動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定效價(jià)，1周后心臟采血，分離血清，即為重組蛋白的抗血清，該抗血清于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Mitogalig和Cytogalig是人半乳糖凝集素-3（Gal-3）的兩個(gè)內(nèi)部基因（galig），分別編碼Mitogaligin和Cytogaligin，兩者在人體內(nèi)能夠引起線粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有良好的治療腫瘤藥物研發(fā)的前景。本申請(qǐng)通過優(yōu)化人Mitogalig和CytogaligORF密碼子及其化學(xué)合成，制備重組pET-28b-mitogalig-Homo和pET-28b-cytogalig-Homo，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，兩種重組質(zhì)粒均在標(biāo)準(zhǔn)分子量14.3kD的蛋白過量表達(dá)，使用抗his-tag抗體的免疫印跡證實(shí)其為目的重組人Mitogaligin和Cytogaligin。以該重組蛋白為抗原制備的小鼠抗血清顯示良好的特異性。人Mitogaligin和Cytogaligin重組蛋白及其抗血清的成功制備為相關(guān)腫瘤診斷試劑和抗腫瘤新藥物的研發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本申請(qǐng)中人重組Mitogaligin的誘導(dǎo)表達(dá)；

圖2為本申請(qǐng)中人重組Mitogaligin可溶性檢測(cè)、Western-blotting檢測(cè)及其鼠抗血清的特異性檢測(cè)；

圖3為本申請(qǐng)中人重組Cytogaligin的誘導(dǎo)表達(dá)；

圖4為本申請(qǐng)中人重組Cytogaligin可溶性檢測(cè)、Western-blotting檢測(cè)及其鼠抗血清的特異性檢測(cè)。

其中，圖1、圖3中，泳道1為未加IPTG的陰性對(duì)照，2-4分別為0.001 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h的樣品，5-7分別為0.01 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h的樣品，8-10分別為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h的樣品，11-13分別為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h的樣品；圖2中，1-4為考馬斯亮藍(lán)染色、5-12為Western-blotting檢測(cè)，且5-8的一抗為鼠抗6xHis單克隆抗體，9-12為鼠抗人重組Mitogaligin抗血清；泳道1、5、9為未加IPTG的陰性對(duì)照，2、6、10為全菌，3、7、11為上清，4、8、13為沉淀；圖4中，1-4為考馬斯亮藍(lán)染色，5-12為Western-blotting檢測(cè)，且5-8的一抗為鼠抗6xHis單克隆抗體，9-12為鼠抗人重組Cytogaligin抗血清，泳道1、5、9為未加IPTG的陰性對(duì)照，2、6、10為全菌，3、7、11為上清，4、8、13為沉淀。

具體實(shí)施方式

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌(E. coli)感受態(tài)細(xì)胞BL21購(gòu)自天根生化科技有限公司；X-Tractor裂解液購(gòu)自TAKARA；Protein Ladder、脫脂奶粉、PVDF膜、小鼠抗His-tag 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；DNA片段合成和載體質(zhì)粒構(gòu)建委托蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1密碼子優(yōu)化

統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)室常用的重組蛋白原核表達(dá)載體，對(duì)大腸桿菌20個(gè)氨基酸所對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后對(duì)人mitogalig和cytogaligORF進(jìn)行密碼子優(yōu)化。具體而言，兩者ORF中某種氨基酸所對(duì)應(yīng)的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率較高的，則保留該密碼子。反之，如果使用的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率很低的或不出現(xiàn)的，則對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，即將原密碼子修改為大腸桿菌的密碼子（參見序列2：人Mitogalig 密碼子優(yōu)化前后ORF及其編碼氨基酸的推導(dǎo)序列和序列3：人Cytogalig 密碼子優(yōu)化前后ORF及其編碼氨基酸的推導(dǎo)序列）。將優(yōu)化的mitogalig和cytogaligORF進(jìn)行化學(xué)合成并連接至pET-28b的Nde I和Xho I克隆位點(diǎn)上，制備重組質(zhì)粒pET-28b-mitogalig-Homo和pET-28b-cytogalig-Homo。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-28b-mitogalig質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，將轉(zhuǎn)化液在含卡那霉素Kanamycin（Kan，50 μg /mL）的瓊脂盤上劃線后37℃培養(yǎng)12 h，獲得大量單菌落。在誘導(dǎo)重組蛋白前一天，挑取單菌落接種于1 mL LB培養(yǎng)液中 （含50 μg /mL Kan），進(jìn)行12h的前培養(yǎng)。將前培養(yǎng)按1%的體積接種于20 mL LB培養(yǎng)液中（含50 μg /mL Kan），37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 介于0.7～1.0時(shí)，取2 mL菌液作為對(duì)照樣品，將剩余菌液分為4管，加入IPTG，使其終濃度分別為0.001 mmol/L、0. 01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L，然后繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)時(shí)間為2、3、4h時(shí)分別取兩個(gè)0.5 mL樣品進(jìn)行離心（13200rpm，1min），徹底去上清。將其中一管的菌體溶于50 μL的蛋白質(zhì)上樣緩沖液中，連同Protein Marker一起于干燥恒溫器中100℃處理3 min，取出后迅速置于冰上冷卻，最后將所有樣品分別取5μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)人重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況。剩下的一管保存于-20℃用于后續(xù)的重組蛋白的可溶性檢測(cè)。

1.2.4重組蛋白的可溶性檢測(cè)

（1）分別取1mL經(jīng)IPTG（終濃度1mmol?L^-1）誘導(dǎo)4h的菌液加入已知重量的1.5ml離心管，13 200rpm離心1min，去上清，再次稱量離心管重量，得出菌體重量。

（2）按1μg菌體對(duì)應(yīng)20μL比例加入X-tractor裂解液，充分懸浮菌體。加入DNaseⅠ約0.1μL避免溶液出現(xiàn)粘稠，另加入一定量溶菌酶（終濃度為1mg?mL^-1），室溫放置10min，每2min上下顛倒一次。4℃ 13 200rpm離心20min。

（3）取上清到另一個(gè)離心管中（作為上清樣品保留檢測(cè)用），再在離心管中加入與X-tractor等量的ddH₂O，將沉淀充分懸浮。

（4）取上清和沉淀懸浮液各10μL，加入2.5μL的5×SDS上樣緩沖液，100℃處理5min后迅速置于冰上。

（5）取5μL處理過的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白水溶性。

將有表達(dá)重組蛋白的細(xì)菌溶解于X-Tractor裂解液。離心后，用SDS-PAGE檢測(cè)包涵體和沉淀。可溶性蛋白分布于上清中，而不可溶性蛋白分布于包涵體中。

1.2.5 免疫印跡檢測(cè)

誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白在15%分離膠，5%濃縮膠中進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳后用PVDF膜將凝膠在轉(zhuǎn)印緩沖溶液中轉(zhuǎn)移電泳，65 V恒壓轉(zhuǎn)印3 h，5%脫脂奶封閉，小鼠抗血清和小鼠抗His-tag分別為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，超敏Ecl 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。

1.2.3 抗血清制備

純化后的重組蛋白作為抗原與弗氏佐劑充分乳化，注射動(dòng)物體內(nèi)（劑量，次數(shù)，途經(jīng)等均要適宜）。測(cè)定效價(jià)（如效價(jià)高，則不必加強(qiáng)免疫），1周后頸動(dòng)脈放血，分離血清， -70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-28b-mitogalig-Homo的構(gòu)建、重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及其抗血清的制備

將優(yōu)化的密碼子進(jìn)行化學(xué)合成并將其連接至pET28b的5’NdeI 和 3’XhoI克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pET-28b-Mitogalig-Homo，預(yù)測(cè)其重組蛋白的分子量為13.330 kD（參見序列4和序列5，即Mitogaig密碼子優(yōu)化后的ORF插入pET28b的5’NdeI 和 3’XhoI克隆位點(diǎn)及其重組蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列）。按材料與方法所述進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)。SDS-PAGE結(jié)果表明，0.001mmol/L的IPTG不能誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，當(dāng)IPTG濃度介于0.01-1mmol/L時(shí)，均在標(biāo)準(zhǔn)分子量14.3附近出現(xiàn)明顯過量表達(dá)的蛋白，與預(yù)期13.330 kD基本吻合（參見圖1、圖2）。

當(dāng)IPTG介于達(dá)到0.1-1mmol/L時(shí)重組蛋白表達(dá)量沒有明顯區(qū)別；表達(dá)量亦隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生改變，3h時(shí)表達(dá)量最佳。根據(jù)可溶性檢測(cè)結(jié)果表明，該重組蛋白分布于沉淀（包涵體）中，表明是非水溶性蛋白（參見圖2）?；谏鲜龇治觯T導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件選擇為：37℃條件下，IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)3 h。使用純化的重組Mitogaligin包涵體免疫小鼠獲得的抗血清顯示良好的特異性（參見圖1）。

2.2 pET-28b-cytogalig-Homo的構(gòu)建、重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及其抗血清的制備

將優(yōu)化的密碼子進(jìn)行化學(xué)合成并將其連接至pET28b的5’NdeI 和 3’XhoI克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pET-28b-Cytogalig-Homo，預(yù)測(cè)其重組蛋白的分子量為13.414 kD（參見序列6和序列7，即人Cytogalig密碼子優(yōu)化后的ORF插入pET28b的5’NdeI 和 3’XhoI克隆位點(diǎn)及其重組蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列）。按材料與方法所述進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)。SDS-PAGE結(jié)果表明，0.001mmol/L的IPTG不能誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，當(dāng)IPTG濃度介于0.01-1mmol/L時(shí)，均在標(biāo)準(zhǔn)分子量14.3附近出現(xiàn)明顯過量表達(dá)的蛋白，與預(yù)期13.414 kD基本吻合（參見圖3和圖4)。當(dāng)IPTG介于達(dá)到0.1-1mmol/L時(shí)重組蛋白表達(dá)量沒有明顯區(qū)別。表達(dá)量亦隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生改變，3h時(shí)表達(dá)量最佳。根據(jù)可溶性檢測(cè)結(jié)果表明，該重組蛋白分布于上清，表明非水溶性蛋白（圖4）?；谏鲜龇治?，誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件選擇為：37℃條件下，IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)3 h。使用純化的重組Cytogaligin免疫小鼠獲得的抗血清顯示良好的特異性（圖4）。

本申請(qǐng)成功優(yōu)化了人Mitogalig和CytogaligORF密碼子并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28b-mitogalig-Homo（參見序列4、5）和pET-28b-cytogalig-Homo（參見序列6、7），獲得人重組蛋白Mitogaligin及Cytogaligin的表達(dá)，兩者表達(dá)的最佳條件相同，均為37℃，IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)3h（圖1、3）以及特異性良好的鼠抗人重組蛋白Mitogaligin的抗血清（圖2）和鼠抗人重組蛋白Cytogaligin的抗血清（圖4）。

截至目前，通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)等研究發(fā)現(xiàn)，galig產(chǎn)生的蛋白均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Mitogaligin位于線粒體中，能誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而Mitogaligin表達(dá)細(xì)胞毒性特性不僅針對(duì)線粒體可能還針對(duì)細(xì)胞核。因此，通過本申請(qǐng)對(duì)Mitogaligin和Cytogaligin的深入研究，一方面對(duì)其生理功能的研究具有重要意義，另一方面為腫瘤診斷、治療和抗腫瘤新藥物的研發(fā)具有重要的參考意義。