本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物性別基因篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝦類雄性化基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國是世界上蝦蟹養(yǎng)殖大國，在沿海地區(qū)蝦蟹的養(yǎng)殖形成了龐大的產(chǎn)業(yè)，成為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟的重要支柱，推動農(nóng)民生活水平提高。在蝦蟹類的生長過程中，同齡雌性和雄性個體的大小、生長速度相差懸殊，表現(xiàn)出雙模態(tài)的生長模式。因此，全雄/全雌性的蝦蟹群體產(chǎn)生較高的可銷售產(chǎn)量，生長更快，且只需更短的養(yǎng)殖時間即可獲得更高的每單位面積受益。若利用好這種雄性/雌性特征的優(yōu)勢，開展全雌/全雄單性化養(yǎng)殖，則可以大幅提高上市商品規(guī)格和養(yǎng)殖產(chǎn)量，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖效益。因此，蝦蟹類性別控制一直是遺傳育種、良種選育研究的熱點之一。

目前，有關(guān)蝦蟹類性別分化和性別決定方面的認(rèn)識僅僅局限于少量性別調(diào)控基因的分子結(jié)構(gòu)和組織表達等，在動物水平上開展基因功能研究和育種方面的可操作性則幾乎為零。目前，利用移植蝦蟹的促雄性腺體生產(chǎn)單雄性蝦蟹群體的手段效率低，且包括冗長的方案，諸如人工分隔和從不成熟雄性顯微外科的移除促雄性腺體，這兩種方案都要求較高的操作技能。因此，對有效的、技術(shù)上改進和經(jīng)濟上有益的產(chǎn)生甲殼綱十足目動物，特別是經(jīng)濟蝦蟹的單雄性/單雌性群體的方法仍存在迫切需求。

因此，若能通過對動物體內(nèi)的雄性化基因進行克隆、表達特征分析及定位和基因功能等研究，進而在動物水平層面闡明雄性化基因在性別調(diào)控方面的功能和在單性育種的操作實踐，提供羅氏沼蝦雄性化基因在調(diào)控羅氏沼蝦雌雄性別和培育單性后代中的應(yīng)用，將對甲殼綱中單性群體的培育提供極佳的實驗思路和技術(shù)提升。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蝦類雄性化基因，及其在實現(xiàn)蝦類全雄苗種生產(chǎn)中的應(yīng)用，尤其是羅氏沼蝦的單性全雄苗種的培育技術(shù)。

本發(fā)明首先提供一種蝦類雄性化基因，其編碼的蛋白包含有：

1)氨基酸序列為SEQ ID NO:2的蛋白；

2)在1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，由1)衍生的蛋白。

上述的蝦類雄性化基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:1；

本發(fā)明再一個方面提供一種雙鏈RNA，所述的雙鏈RNA能在細(xì)胞水平上降低上述蝦類雄性化基因的表達量；

所述的雙鏈RNA分子包括正義鏈和反義鏈，所述反義鏈包含與SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列或同系物或片段至少70％互補的核苷酸序列。

作為實施例的優(yōu)選，上述的雙鏈RNA分子的序列為SEQ ID NO:3；

本發(fā)明再一個方面提供一種用于產(chǎn)生能夠下調(diào)雄性化基因表達的雙鏈RNA分子的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體用來轉(zhuǎn)錄表達上述的雙鏈RNA分子，從而能在細(xì)胞水平上降低或去除上述蝦類雄性化基因的表達量；

更進一步的，本發(fā)明提供一種用于在甲殼綱十足目的雄性生物體中下調(diào)上述的雄性化因子表達的方法，是向所述甲殼綱十足目的雄性生物體的至少一個細(xì)胞引入根據(jù)本發(fā)明主旨的雙鏈RNA或DNA構(gòu)建體。所述的引入所通過注射、浸入、經(jīng)皮或喂食來進行的。

根據(jù)進一步的實施方案，本發(fā)明提供與SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列或其同系物或片段互補的反義寡核苷酸序列，其中反義寡核苷酸序列能夠與SEQ ID NO:1或其同系物或片段特異性雜交，從而抑制甲殼綱十足目動物中雄性化蛋白的表達。

根據(jù)一些實施方案，核苷酸的區(qū)域選自5′非翻譯區(qū)、密碼子區(qū)、終止密碼子區(qū)和3’非翻譯區(qū)組成的組。根據(jù)某些實施方案，反義寡核苷酸序列包含至少20個核苷酸。應(yīng)理解的是，寡核苷酸序列可由長度是從約20個核苷酸到約3300個核苷酸，可選的，每個核苷酸序列包括從約340到約1300個核苷酸構(gòu)成。

本發(fā)明還提供一種獲得雌性或假雌性沼蝦類生物的方法，是將雄性沼蝦類生物中上述的雄性化基因的表達量降低或去除；

再一種獲得全雄性沼蝦類生物的方法，是使用上述方法獲得的假雌性沼蝦類生物與雄性交配來產(chǎn)生全雄性后代。

所述的沼蝦類生物，作為實施例的優(yōu)選，為羅氏沼蝦。

本發(fā)明基于雄性化基因的核酸和蛋白序列信息，綜合運用RNA干擾技術(shù)和基因表達調(diào)控等生物技術(shù)，實現(xiàn)蝦類雄性化基因的有效沉默，并對雄性個體進行定向性別控制，誘導(dǎo)性別逆轉(zhuǎn)，篩選獲得性別可控的雌性親本，培育快速生長的全雄單性苗種，開展全雄化單性養(yǎng)殖實踐應(yīng)用。

附圖說明

圖1：雄性化基因的氨基酸相似性比對圖；

圖2：雄性化基因的同源性比對圖；

圖3：雄性化基因的組織表達特征圖，

圖4：雄性化基因的RNA干擾樣品制備圖，

圖5：雄性化基因的RNA干擾效率測定圖，

圖6：雄性化基因沉默后的雌雄性別鑒定圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細(xì)的描述。

實施例1雄性化基因和多肽的鑒定

1)通過從蝦基因庫中獲得完整的羅氏沼蝦雄性化基因的序列，全雄化基因的全長利用ExPASx蛋白組學(xué)服務(wù)器(http://ca.expasy.org/tools/dna.html)計算機翻譯，并選擇最可能的框架。由SMART和CBS預(yù)測服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/)進一步評價推定的氨基酸和多肽序列。

羅氏沼蝦雄性化基因的cDNA序列全長3264bp(SEQ ID NO:1)，包括3′非翻譯區(qū)318bp，開放閱讀框1314bp，5′非翻譯區(qū)1632bp，推演生成含438個氨基酸的多肽序列(SEQ ID NO:2)。推演的開放閱讀框中存在兩個含CCCH的鋅指結(jié)構(gòu)：GDDDNICRDFLRNVCRRGKRCKYRHPED和KTELTFCHDFQNGNCSRPMCRFIHCTC。

利用NCBI平臺(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)對雄性化蛋白的氨基酸序列進行相似性和同源性比對。結(jié)果表明，羅氏沼蝦雄性化基因與哺乳動物狐蝠、脊索動物文昌魚、軟體動物海蝸牛和長牡蠣、棘皮動物海膽等都含有由CCCH保守氨基酸組成的兩個特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域，具有較高相似性和同源性(圖1和圖2)。

2)雄性化基因的組織表達特征鑒定

從健康、成熟羅氏沼蝦中取各組織，包括心、鰓、肝胰臟、神經(jīng)、肌肉、精巢和卵巢，并利用Trizol試劑盒的方法對各個組織的總RNA進行抽提。隨后通過分光光度法對RNA定量。第一鏈cDNA通過從1ug總RNA在42℃的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Reverse Transcriptase MMLV(RNase H-))30分鐘，以O(shè)ligod(T)作為引物來合成，根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)制造商的說明書制備。羅氏沼蝦雄性化基因的組織特異性表達通過熒光定量PCR擴增檢測。通過利用正向引物5’-AATGCTCGGGCAGACCATAAGT-3’(核苷酸(nt)936-957)和反向引物5’-CAAAATTTCTTCTAAGCCACGTCG-3’；(核苷酸(nt)1006-1029)特異性引物證明。羅氏沼蝦的18S核糖體基因用作陽性對照(GenBank序列號DQ642856)，選用恒定表達的基因18S作為內(nèi)參，通過利用正向引物5’-GGTAGTGACGAAAAATAACAAT-3’和反向引物5’-CCCACCCCAGTCCGGAACTGA-3’特異性引物證明。將雄性化基因的相對定量通過利用上述基因引物和SRYBGreen PCR Master混合物(ApplliedBiosystem)按照制造商的說明書(SYBR Premix Ex Taq^TM(TliRNaseH Plus),Takara)進行。將獲得的數(shù)據(jù)根據(jù)各組織和18S核糖體RNA水平標(biāo)準(zhǔn)化兩次，然后將標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)表示為2^-△ct。

熒光實時定量PCR結(jié)果顯示，羅氏沼蝦的雄性化基因的轉(zhuǎn)錄物在性成熟的羅氏沼蝦雌雄個體中差異分布，雄蝦體內(nèi)各組織中雄性化基因的含量明顯高于雌蝦中的含量(圖3)。同時，在羅氏沼蝦的生殖系統(tǒng)中，雄性化基因在雌蝦卵巢中的表達量卻明顯高于雄蝦精巢中的表達，推測雄性基因在羅氏沼蝦的性別維持和調(diào)控過程具有重要作用。

實施例2雄性化基因表達的沉默

雙鏈RNA制備

根據(jù)羅氏沼蝦雄性化基因的cDNA序列設(shè)計帶有酶切位點的正向引物5’-CGCGGATCCTCACAGCCCCTCCCAATTACA-3’(核苷酸(nt)1249-1269；SEQ ID NO:7，下劃線處為BamHI酶切位點)和反向引物5’-CCCAAGCTTATAGGACACAAGATGACCACCAGA-3’(核苷酸(nt)1567-1590；SEQ ID NO:8，下劃線處為HindIII酶切位點)，構(gòu)建包含羅氏沼蝦雄性化基因的dsRNA表達載體。以包含羅氏沼蝦雄性化基因的cDNA為模板，進行PCR擴增(94℃持續(xù)3分鐘，隨后是94℃持續(xù)30秒、55℃持續(xù)30秒、72℃持續(xù)30秒的35個循環(huán)，隨后是72℃持續(xù)10分鐘)，克隆雄性化基因片段，獲得目的基因序列的序列為SEQ ID NO：3；

PCR擴增產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用UV光在溴化乙錠中顯現(xiàn)，從凝膠切下并利用QIAquick RCR純化試劑盒(QIAGEN)純化。根據(jù)制造商的說明書，利用pET-T7質(zhì)粒構(gòu)建含有目的基因片段的表達載體，并將含有基因片段插入的pET-T7表達載體轉(zhuǎn)化到表達型菌株E.coli HT115中。利用雙鏈RNA表達載體pET-T7誘導(dǎo)表達合成dsRNA，隨后根據(jù)制造商的說明書利用Trizol試劑盒抽提菌體總RNA，通過加熱到65℃持續(xù)20分鐘來使兩條鏈雜交，然后自然冷卻至室溫，使其冷卻復(fù)性。隨后加入RNase A進行酶切處理，去除單鏈RNA，苯酚和氯仿純化雙鏈RNA，乙醇沉淀。溶解純化后的雙鏈RNA樣品并定量(圖4)，將其保存在-20℃直到使用。

應(yīng)理解的是，可對本發(fā)明的dsRNA進行化學(xué)修飾?？捎糜诒景l(fā)明的修飾的dsRNA化合物的具體實施包括修飾的骨架或非天然核苷鍵的寡核苷酸。另外，根據(jù)本發(fā)明的修飾的核苷酸還可以包含一個或多個取代的糖部分。另外，本發(fā)明的寡核苷酸可化學(xué)連接于增強寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的一個或多個部分或共軛物。這些部分或共軛物可包括共價結(jié)合于功能基團諸如伯羥基或仲羥基的共軛基團。本發(fā)明的共軛基團包括嵌入劑、報告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚物的藥效學(xué)特性的基團以及增強寡聚物的藥代動力學(xué)特性的基團。典型的共軛基團包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸酯、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素類和染料。

RNAi劑可通過包括但不限于以下技術(shù)向本發(fā)明的靶水生生物體施用：電穿孔、注射、微注射、快速注射、進入、攝食(喂食)、磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒注射、生物彈法(粒子轟擊，如使用基因槍)或病毒載體直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對于甲殼綱十足目動物，注射、微注射、經(jīng)由浸入或攝食(喂食)而口服、或經(jīng)皮方法是優(yōu)選。RNAi劑可以裸形式引入靶生物體。裸形式是指RNAi劑不含有可作用以促進浸入靶細(xì)胞的任何遞送媒介物，諸如脂質(zhì)體制劑、帶電荷的脂質(zhì)或沉淀劑。如有需要，可使用遞送劑。RNAi劑可以組合物遞送，組合物進一步包含核酸凝聚劑諸如亞精胺、硫酸魚精蛋白、聚賴氨酸、殼聚糖或本領(lǐng)域已知的其他核酸凝聚劑。雄性化基因的“基因遞送”或“基因轉(zhuǎn)移”是指用于可靠地將外源核酸插入靶細(xì)胞的方法或系統(tǒng)，且可導(dǎo)致目的基因的瞬時或長期表達。

RNAi劑可在生命周期的任何階段施用與甲殼綱十足目動物，包括為受精的卵或受精卵、或胚胎、或未成熟階段幼體、或幼蟲階段、或成熟階段。出于實踐考慮，如果RNAi劑將通過注射或微注射向動物體遞送，動物是肉眼可見將是優(yōu)選的。在羅氏沼蝦中，最有利的實施階段是在胚胎階段、幼蟲階段或幼蟲后(postlarvae,PL)階段之前或期間施用RNAi劑，諸如在幼蟲后階段的第1-200天，優(yōu)選地在幼蟲后階段的第1-80天。

在向靶生物體施用RNAi劑的方法的一個方式中，使用攜帶RNAi劑的飼料活生物體。例如，幼體和成體階段消耗單細(xì)胞和多細(xì)胞食物源，諸如鹵蟲(豐年蟲)或鹵蟲休眠卵、浮游生物、類似浮游生物的濾食生物、藻類和酵母。這些食物源可以在水產(chǎn)養(yǎng)殖中采用，可用RNAi劑轉(zhuǎn)化這些食物源以使靶生物體通過攝食食物源最終獲得RNAi劑。鹵蟲、螺旋藻屬、水蚤屬、鉤蝦屬、輪蟲、紅蚯蚓和游絲蚯蚓是用于喂養(yǎng)養(yǎng)殖的小蝦和成蝦的飼料活源的實例，其可被遺傳改造以向沼蝦遞送RNAi。飼料活生物體可以是活體的，也可制備為冷凍干燥、冷藏或冷凍形式。

本發(fā)明的組合物可以是固體、半固體或液體形式。取決于施用方式和RNAi劑的性質(zhì)，組合物可為了向靶生物體遞送而適當(dāng)?shù)嘏渲啤＝M合物可進一步包含載體。RNAi劑可與之混合的載體包括常規(guī)賦形劑，并可以是水性溶劑(諸如水、鹽水或PBS)、油、右旋糖、甘油、潤濕劑或乳化劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、包衣劑、粘合劑、填充劑、崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、pH緩沖劑及類似物。

對于跨粘膜或經(jīng)皮施用，在制劑中使用適于將被穿透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，包括如去垢劑、膽酸鹽和呋西地酸衍生物。本發(fā)明的dsRNA制劑包括但不限于溶液、乳劑、泡沫和含脂質(zhì)體的制劑等。雄性化基因在蝦體內(nèi)的沉默

選取體質(zhì)健壯、附肢完整的羅氏沼蝦進行RNA干擾。利用顯微注射的方法，經(jīng)頭胸甲與腹部交界處的第五步足基部腹膜處，向每只動物注射5-10μg雄性化基因的雙鏈RNA或?qū)φ誈FP基因的雙鏈RNA，放回水循環(huán)系統(tǒng)中繼續(xù)飼養(yǎng)。RNA干擾7天后，沼蝦解剖取樣，檢測雄性化基因的表達水平。抽提含目的基因的組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用熒光定量PCR的方法，以18S基因作為內(nèi)參，檢測雄性化基因的表達水平，熒光定量PCR方法同上所述。結(jié)果表明，RNA干擾后，沼蝦體內(nèi)雄性化基因的核酸表達水平顯著下調(diào)，與GFP對照組相比，雄性化基因的表達水平降低70％以上(圖5)，有效地沉默沼蝦體內(nèi)雄性化基因的表達。

實施例3基于雄性化基因沉默的性別調(diào)控

假雌親本的選育

對于雄性化基因長期沉默的RNAi實驗，選取體質(zhì)健壯、附肢完整的雄性溞狀幼體期(Post Larvae,PL，PL20-PL120)(N＝200)，體長0.8-1.2cm的雄蝦幼苗進行雄性化基因的RNA干擾，RNA干擾的顯微注射和操作流程如上所述。為維持高效持久的RNA干擾效率，每隔一個月重新注射同樣的雙鏈RNA樣品至蝦體內(nèi)，注射周期為3個月。RNA干擾后的蝦體置于室內(nèi)水泥池中繼續(xù)飼養(yǎng)，至體長3-5cm，抓捕并鑒定雌雄性別情況。首先，從外觀形態(tài)方面鑒定雌雄性別，利用顯微鏡觀察羅氏沼蝦雌雄性征的外觀差異和蝦體的雌雄生殖孔。第五步足基部存在生殖孔的為雄性蝦體，第五步足基部不存在生殖孔的為雌性蝦體，并從中篩選出雌性個體(假雌個體)。RNA干擾實現(xiàn)雄性化基因測長期沉默后，統(tǒng)計蝦體雌雄性別數(shù)據(jù)表明，在雄性幼體RNA干擾組留存的136尾沼蝦中，群體中雌蝦/雄蝦的比值為3：133，存在有3只雌性個體(假雌蝦)，即群體中2.2％雄性個體性發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)變成雌性個體。

在此基礎(chǔ)上，利用羅氏沼蝦的性別特異分子標(biāo)記，對群體中已鑒定性別的雌蝦和雄蝦做基因組上的遺傳性別鑒定。通過PCR擴增方法和核酸電泳鑒定，正常蝦群體中，雌性性別特異分子標(biāo)記體現(xiàn)為雌性樣本中可鑒定到編碼雌性特異性基因的多核苷酸或其同系物或片段，而雄性樣品中則不存在對應(yīng)片段。因此，在GFP對照組中，3尾雌性樣本中分別可以擴增獲得目的條帶，3為雄性樣本中不能擴增到目的條帶。相應(yīng)的，在雄性化基因RNA干擾組中鑒定結(jié)果則顯示5尾沼蝦樣本(3尾雌蝦和2尾雄蝦)中都未擴增到目的條帶，說明這5尾沼蝦在遺傳上都為雄性個體(圖6)。進一步分析表明，雄性化基因RNA干擾組中，3尾外觀表型為雌性的沼蝦其體內(nèi)攜帶雄性遺傳基因信息，為新雌性沼蝦(假雌個體)。

以上實驗結(jié)果表明，在性別分化關(guān)鍵時期，雄性體內(nèi)的雄性化基因沉默可導(dǎo)致其性別發(fā)生逆轉(zhuǎn)，變成新雌性(假雌個體)。所謂的假雌個體是指其體內(nèi)攜帶雄性遺傳信息，而表型(外觀特征和生殖系統(tǒng))則體現(xiàn)為雌性性征。因此，通過調(diào)節(jié)雄性化基因在體內(nèi)的核酸和蛋白表達，可以進一步調(diào)控蝦類的雌雄性別分化，尤其是調(diào)控羅氏沼蝦的性別分化，誘導(dǎo)雄性個體性別逆轉(zhuǎn)形成假雌個體。同時，因假雌個體同時兼有雄性的內(nèi)在遺傳背景和雌性的外在表型，可與正常雄性個體交配、受精和產(chǎn)卵，培育生產(chǎn)全雄子代群體，用于全雄單性養(yǎng)殖。實施例4全雄單性群體養(yǎng)殖

假雌親本和全雄苗種培育：將選育獲得的假雌個體置于室內(nèi)水泥池中繼續(xù)飼養(yǎng)至卵巢發(fā)育成熟，人工控溫，25±1度，充氣泵增氧，每天早晚投喂魚塊或配合飼料，并及時消除殘餌和糞便等。假雌親蝦繼續(xù)養(yǎng)殖至性腺發(fā)育成熟，待卵巢膨大呈橙黃色，卵粒隱約可分辨時，配養(yǎng)體質(zhì)健壯、附肢完整、性腺發(fā)育成熟的雄蝦進行交配受精。雌雄蝦交配受精完成后，將抱卵雌蝦置于水泥池內(nèi)的小網(wǎng)箱中，單獨飼養(yǎng)，人工控溫，27±1度，充氣泵增氧。觀察雌蝦腹部胚胎發(fā)育情況，待抱卵雌蝦腹部胚胎的顏色由淡黃色轉(zhuǎn)為淺灰色或灰色，胚胎發(fā)育至溞狀幼體期時，將雌蝦腹部的胚胎洗脫，酒精消毒后移至人工半咸水中集中孵育。同時，慢慢提升孵育溫度至30±1度，孵化幼苗。羅氏沼蝦全雄幼苗孵化后，每天投喂餌料，調(diào)控水質(zhì)，定期檢測育苗水體中的水質(zhì)化學(xué)指標(biāo)、生物指標(biāo)以及幼體發(fā)育狀態(tài)。羅氏沼蝦溞狀幼體經(jīng)過20-22天的培育，90％以上的幼體變成仔蝦。此時，進行蝦苗的淡化工作，直至鹽度降為2以下。同時，將苗池水溫逐漸降至27±1度，與外界水溫接近，仔蝦淡化完畢，成功培養(yǎng)出健康的羅氏沼蝦全雄苗種。

全雄羅氏沼蝦養(yǎng)殖優(yōu)勢

全雄單性蝦苗可用于沼蝦的池塘化養(yǎng)殖。從羅氏沼蝦的育苗基地挑選10萬尾淡化后的健康全雄苗種，放樣于6畝池塘水域中進行養(yǎng)殖。根據(jù)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境水溫和養(yǎng)殖習(xí)慣，開展為期4個月的養(yǎng)殖試驗。結(jié)果表明，池塘養(yǎng)殖收獲的各池中成熟雄蝦比例在94.6％-100％之間，平均雄性比例為97％，維持了高度雄性化比例。單性全雄沼蝦在池塘養(yǎng)殖過程中很好地保持其原有的性別特征，維持其雄性性征的穩(wěn)定性。養(yǎng)殖過程中，蝦苗放養(yǎng)密度降為1.7萬尾/畝時，平均產(chǎn)量可達為477斤/畝。全雄沼蝦的生長指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果表明，沼蝦體長范圍在6.2-11.3厘米，平均體長為9.3厘米；沼蝦體重范圍4.8-39.6g，平均體重為20.9g，達到目前市場對成品沼蝦的上市規(guī)格。

同時，單性沼蝦群體中各個不同發(fā)育階段的蝦(小蝦、橙爪蝦和藍(lán)爪蝦)共存，符合自然狀態(tài)下的沼蝦群體組成。此外，在單性沼蝦群體中，橙爪蝦所占的比例相較于小蝦和藍(lán)爪蝦的比例明顯偏高，說明其仍具有很好的生長潛能成長為藍(lán)爪大蝦。因此，在池塘養(yǎng)殖條件適宜的條件下，延長養(yǎng)殖周期，將能更好地發(fā)掘和體現(xiàn)沼蝦單性養(yǎng)殖中的雄性優(yōu)勢。綜上所述，在羅氏沼蝦全雄單性化養(yǎng)殖過程中，適當(dāng)降低苗種的放養(yǎng)密度，不僅可以維持養(yǎng)殖產(chǎn)量，而且可以較好地提升養(yǎng)殖產(chǎn)量，且全雄沼蝦在其生長后期有很好的生長潛力。

水產(chǎn)養(yǎng)殖蝦類具有良好的雄性/雌性特征優(yōu)勢，對這些種類進行定向性別控制，開展單性化養(yǎng)殖，不但可以產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益，而且具有重要的理論價值。本發(fā)明方法攻克目前水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域蝦類單性苗種培育中遇到的技術(shù)難題，通過RNA干擾技術(shù)和基因表達調(diào)控技術(shù)，進行定向性別控制，誘導(dǎo)蝦類動物性別逆轉(zhuǎn)，不僅構(gòu)建蝦類性別控制和單性培育的驗證技術(shù)體系和平臺，而且利用性別可控的親本培育單性苗種，實現(xiàn)基于蝦類雄性化基因的全雄蝦苗生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明操作方法具有原創(chuàng)性，實施步驟清晰。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江萬里學(xué)院

<120> 一種蝦類雄性化基因及其應(yīng)用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3264

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

gtcacgtgac attagcgtaa tcagcgtcat ctgtaaaaag ggtgttcaac ttatcatttg 60

ctcgggaaag gttgctaggt tcatttttaa caatttcgcc atattgtaaa caaaagtggt 120

tgcgtggtca cgaatttgag cgaaatattg tgaaaggtaa cacgctcctc ttaagctttg 180

gttgtttatg aaagttgtcc tgcaactgaa tccaggagat aaaaagaggc agtgagctat 240

actgtgacag acttctgtgt ttgcgttagg agacattcaa caggaaccaa ggggaatact 300

gtaaacaagg accatgaaat ggttgagggc atgaatggtc acaccaaaga ggagggaaca 360

ggtcctgtat caggagatga tgacaacatt tgtcgggatt ttctgcgaaa tgtttgccga 420

cggggtaaac gatgcaaata cagacatcca gaagatatag ggcctggacc acctggaggg 480

aaccaagtta aaacagaatt aacattttgc catgactttc aaaatggcaa ctgctctaga 540

ccaatgtgca ggttcattca ttgcacttgt gaagatgaag actactatct ccgcacagga 600

gatattcctc catatgtttt ggatcaggct attcgcaggg gacagatcaa tgatgttact 660

ctggatggag atattccaat ttgtaaggac tacctcatgg gtgagtgctc aagaaggagg 720

gggggcaaat gcaagtttag acacctcaca cttgctgaat atgagcaagc agtatatggt 780

acaaaccaac caaaacagtg cccacaagaa ccacctccta gtagtatagg acccccagat 840

ccaaaaagac agagatatga acctaaatca gtcagtgcag aatttgcaag agagagagat 900

ttcttgcggc ctgttgaaga acttggtaga gaagcaatgc tcgggcagac cataagttta 960

agagattttc gtgatagaga tagagagcga gacaaagaaa gagatcgacg tggcttagaa 1020

gaaattttga tcttaagaaa acaaattgat gatctcaaga aggataacgc caatctcaag 1080

aaagaaaatt ctgatcttcg agcaactaat gaattcttat tagatcaggt aactactcta 1140

agattaagca aagcaagtgg aagtgtgaca gctgtaactg tgccagctgt gagcttggca 1200

tctactatcc ctgttgcaac aagtgtacag cctttgactg cacaactctc acagcccctc 1260

ccaattacat cagatgttgt tgccttgcct actggtccac ctcggccacc accaccacct 1320

caagcacctc agcaagcacc accacattca ttggctcccc catctcagca agttgtagca 1380

cctccaggtt cagcagtagt aggatcagtc ggtggtgtgc aagtttcgtt gcctcaggca 1440

acagctctta cagctgtgtc tttgtcaact gttactctaa atccacagat tgcaccagca 1500

acatcaatgg caccctcaat ggccccccca tcagcacaga atatggctat ttccatgagt 1560

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caactgcagt agatgtcagg agatgtctaa ctgatggctg tgtcttttta ggtattttat 1680

ggcagtctgc ttatgttcat atttaatgat tgcaaataat ttattgactt tctgttgtta 1740

cctgccaagt tatacacaag ttgataggat ttttgttgta agcatgtgtc ccgttcattt 1800

aaggtaggat gattgataat gtagattttc attgtcagtt gcttatcatt gataccatac 1860

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attcaacatg ttcttggttg agtagagtat cttttgtaga gtatatacct aaaggatagc 2040

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taagataata agacttagga cattttagac cagaagaaag tgaaaggaaa gttcagagcg 2700

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gtgattcaat caagaaagtc taagtatgcc aagatgtata agtaaagaac aagatgtata 2820

agtaaagaaa gggaagaaat aaaaagccca gagaactaat aatatatgag agctagaggg 2880

aattgtgtgt ttgctgaata ataagagaaa atttgtgtga tcatatttag ccactgtagt 2940

tgagggagaa acattttata cggaaaaaga cacacatttt ttgtgtgata acattttaca 3000

tctaaactta catggttcat gatattttat aaagttcttt gagagcaacc ttatagagga 3060

tgagtgttca gttgtttggt ttcttgatct aaacagtatc ttatcctgtt taaaaatttg 3120

cttatactgc agagtacagt aaccataaat ttttttttgc tatactgcat acgggaaaag 3180

tttactgcag gtagttgata tttttgcttt atactgtaat gttctttata acatccattt 3240

catattctct ctctctctct ctct 3264

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<212> PRT

<213> 2

<400> 2

Met Val Glu Gly Met Asn Gly His Thr Lys Glu Glu Gly Thr Gly Pro

1 5 10 15

Val Ser Gly Asp Asp Asp Asn Ile Cys Arg Asp Phe Leu Arg Asn Val

20 25 30

Cys Arg Arg Gly Lys Arg Cys Lys Tyr Arg His Pro Glu Asp Ile Gly

35 40 45

Pro Gly Pro Pro Gly Gly Asn Gln Val Lys Thr Glu Leu Thr Phe Cys

50 55 60

His Asp Phe Gln Asn Gly Asn Cys Ser Arg Pro Met Cys Arg Phe Ile

65 70 75 80

His Cys Thr Cys Glu Asp Glu Asp Tyr Tyr Leu Arg Thr Gly Asp Ile

85 90 95

Pro Pro Tyr Val Leu Asp Gln Ala Ile Arg Arg Gly Gln Ile Asn Asp

100 105 110

Val Thr Leu Asp Gly Asp Ile Pro Ile Cys Lys Asp Tyr Leu Met Gly

115 120 125

Glu Cys Ser Arg Arg Arg Gly Gly Lys Cys Lys Phe Arg His Leu Thr

130 135 140

Leu Ala Glu Tyr Glu Gln Ala Val Tyr Gly Thr Asn Gln Pro Lys Gln

145 150 155 160

Cys Pro Gln Glu Pro Pro Pro Ser Ser Ile Gly Pro Pro Asp Pro Lys

165 170 175

Arg Gln Arg Tyr Glu Pro Lys Ser Val Ser Ala Glu Phe Ala Arg Glu

180 185 190

Arg Asp Phe Leu Arg Pro Val Glu Glu Leu Gly Arg Glu Ala Met Leu

195 200 205

Gly Gln Thr Ile Ser Leu Arg Asp Phe Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg

210 215 220

Asp Lys Glu Arg Asp Arg Arg Gly Leu Glu Glu Ile Leu Ile Leu Arg

225 230 235 240

Lys Gln Ile Asp Asp Leu Lys Lys Asp Asn Ala Asn Leu Lys Lys Glu

245 250 255

Asn Ser Asp Leu Arg Ala Thr Asn Glu Phe Leu Leu Asp Gln Val Thr

260 265 270

Thr Leu Arg Leu Ser Lys Ala Ser Gly Ser Val Thr Ala Val Thr Val

275 280 285

Pro Ala Val Ser Leu Ala Ser Thr Ile Pro Val Ala Thr Ser Val Gln

290 295 300

Pro Leu Thr Ala Gln Leu Ser Gln Pro Leu Pro Ile Thr Ser Asp Val

305 310 315 320

Val Ala Leu Pro Thr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Pro Gln Ala

325 330 335

Pro Gln Gln Ala Pro Pro His Ser Leu Ala Pro Pro Ser Gln Gln Val

340 345 350

Val Ala Pro Pro Gly Ser Ala Val Val Gly Ser Val Gly Gly Val Gln

355 360 365

Val Ser Leu Pro Gln Ala Thr Ala Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Thr

370 375 380

Val Thr Leu Asn Pro Gln Ile Ala Pro Ala Thr Ser Met Ala Pro Ser

385 390 395 400

Met Ala Pro Pro Ser Ala Gln Asn Met Ala Ile Ser Met Ser Gly Ala

405 410 415

Ser Gly Gly His Leu Val Ser Tyr Pro Ile Met Thr Gln Pro Gly Leu

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Arg Pro Gln Leu Gln

435

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<211> 342

<212> DNA

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tcacagcccc tcccaattac atcagatgtt gttgccttgc ctactggtcc acctcggcca 60

ccaccaccac ctcaagcacc tcagcaagca ccaccacatt cattggctcc cccatctcag 120

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ttgcctcagg caacagctct tacagctgtg tctttgtcaa ctgttactct aaatccacag 240

attgcaccag caacatcaat ggcaccctca atggcccccc catcagcaca gaatatggct 300

atttccatga gtggtgcatc tggtggtcat cttgtgtcct at 342