專利名稱：鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物分子標(biāo)記技術(shù)，確切地說是一種鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育特異種質(zhì)資源的分子標(biāo)記方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已成為輔助育種及鑒別特異種質(zhì)資源的重要手段，利用分子標(biāo)記輔助選擇可以在育種早期如苗期進(jìn)行鑒定；選擇過程中不受環(huán)境等因素的影響。作物育種常用的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、SSR以及SCAP標(biāo)記等。該方法采用特異分子標(biāo)記技術(shù)獲得葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子標(biāo)記，并用于葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育特異種質(zhì)資源的篩選鑒定。
細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility)是植物中比較普遍的遺傳現(xiàn)象，在作物雜種優(yōu)勢利用中有著重要應(yīng)用價值。由于細(xì)胞質(zhì)雄性不育不能產(chǎn)生正常的功能花粉，因此，利用雄性不育既可以省去人工去雄的手續(xù)，又可以保證雜交一代種子的純度，同時它又是研究花粉發(fā)育、細(xì)胞質(zhì)遺傳和核質(zhì)互作的良好的實驗系統(tǒng)。十字花科作物存在著明顯的雜種優(yōu)勢，目前雜種一代的生產(chǎn)主要是利用自交不親和性和雄性不育性兩種途徑。細(xì)胞質(zhì)雄性不育由于其理論上可以獲得100％不育度和不育率的材料，因此，在十字花科作物優(yōu)勢育種利用中有著更廣闊的前景，十字花科中許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，如白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜等都選育出了綜合性狀良好的雄性不育系。
芥菜是中國的特產(chǎn)蔬菜，屬于十字花科植物，在浙江和四川等地有著廣泛的栽培，經(jīng)濟(jì)價值大，是重要的加工蔬菜，生產(chǎn)上存在病毒病嚴(yán)重和品質(zhì)下降等問題，而雜種優(yōu)勢的利用可以改良現(xiàn)有芥菜品種的品質(zhì)及提高抗性。由于芥菜類作物自交親和指數(shù)非常高，生產(chǎn)上很難利用自交不親和系進(jìn)行雜種優(yōu)勢的利用。因此，芥菜類作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的應(yīng)用與理論研究有著重要意義，采用細(xì)胞質(zhì)雄性不育獲得雜種優(yōu)勢一直是育種研究的熱點之一。迄今為止，在十字花科作物中，在生產(chǎn)上已經(jīng)應(yīng)用的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系主要有Ougra型的蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、Brassica nap型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以及Brassica pol型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。到目前為止，尚無葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的分子標(biāo)記報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的分子標(biāo)記方法。
鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟提取葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其回交各世代基因組DNA，以其為模板，根據(jù)nap類型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf222和pol型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf224設(shè)計兼并引物，進(jìn)行鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳在葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其回交各世代中檢測不育分子標(biāo)記的特征帶。
上述分子標(biāo)記方法中所述的兼并引物，即人工合成的核苷酸分子是正向引物5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’反向引物5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中R為G，A；K為G，T；Y為C，T上述鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)的具體步驟如下(1)首先將下列試劑混和在一起10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5微升(μl)模板DNA 1μl正向引物(1.25μg/l) 0.4μl反向引物(1.25μg/l) 0.4μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶0.4μl滅菌水 41.8μl總體積 50μl(2)將上述混和液94℃變性3分鐘，然后進(jìn)入下來循環(huán)94℃變性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個循環(huán)后72℃延伸10分鐘，結(jié)果擴(kuò)增到663的一條帶。
(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測本發(fā)明首次在葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系回交各世代中檢測葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的一個分子標(biāo)記，為鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育特異種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。


圖1葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子標(biāo)記在不育系及其回交各世代中的標(biāo)記圖；
圖中1為葉用芥菜保持系；2為不育源；3為不育源與葉用芥菜F1代；4為回交一代(BC2)；5為回交三代(BC3)；箭頭即為葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子標(biāo)記。
具體實施例方式
實施例1葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因分子標(biāo)記方法葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(Brassica juncea var.multiceps Tsen etLee)由本實驗室提供，材料在浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系蔬菜研究所種植。
(1)引物設(shè)計根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中Brassica nap型細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf222和Brassica pol型細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orrf224(orf222基因Genebank登錄號U10423，orf224基因Genebank登錄號S46795，均可以在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/中查找到)設(shè)計兼并引物。人工合成的核苷酸分子正向引物5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’反向引物5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中R為G，A；K為G，T；Y為C，T(2)CTAB法提取植物總DNA(a)取0.5g嫩葉于研缽中，液氮狀態(tài)下研磨，加入600ul 65℃預(yù)熱的2×CTAB，(30μl巰基乙醇混勻)，轉(zhuǎn)移到離心管中，65℃保溫1-2小時。
(b)加入等體積氯仿異戊醇(24/1)輕輕搖勻，4℃，13000rpm離心，10分鐘。
(c)取上清，重復(fù)(2)步驟一次。
(d)取上清于另一eppendorf管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置5分鐘，13000rpm，離心10分鐘。
(e)倒去上清，加入700ul Wash Buffer漂洗DNA沉淀，離心，重復(fù)一次。(f)加15微升TE-Rnase，37℃保溫1小時。
(g)加入2mol/L NaCl 100ul+100％乙醇250ul混勻，-20℃靜置30min，13000rpm離心10分鐘。
(h)倒去上清，加入500ul 70％乙醇，漂洗，倒去乙醇，重復(fù)一次，常溫晾干。
(i)加入30-50ul ddH2O或TE，回溶，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 注2×CTAB配方，200ulCTAB4gTris(pH8.0)20mlEDTA 1.488gNaCl 16.352gTE-RNase15ul TE加入1/100體積的RNaseWash Buffer10mmol/L乙酸氨76％乙醇(3)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)的試劑首先將下列試劑混和在一起10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5微升(μl)模板DNA 1μl正向引物(1.25μg/l) 0.4μl反向引物(1.25μg/l) 0.4μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶0.4μl滅菌水 41.8μl總體積 50μl(4)PCR反應(yīng)條件將上述混和液94℃變性3分鐘，然后進(jìn)入下來循環(huán)94℃變性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個循環(huán)后72℃延伸10分鐘，。
(5)分子標(biāo)記檢測擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(ethidiumbromide)中染色，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司產(chǎn)品)拍照記錄，結(jié)果在葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其回交各世代中均能檢測到該標(biāo)記的存在，如圖1箭頭所示標(biāo)記。
權(quán)利要求
1.一種人工合成的核苷酸分子，其特征在于具有下列堿基組成的特定序列的寡聚體正向引物5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’反向引物5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中R為G，A；K為G，T；Y為C，T。
2.一種鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的分子標(biāo)記的方法，其特征是提取葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其回交各世代基因組DNA，以其為模板，根據(jù)nap類型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf222和pol型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf224設(shè)計權(quán)利要求1敘述的兼并引物，進(jìn)行鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳在葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其回交各世代中檢測不育分子標(biāo)記的特征帶。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)的具體步驟如下(1)首先將下列試劑混和在一起10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5微升(μl)模板DNA 1μl正向引物(1.25μg/l) 0.4μl反向引物(1.25μg/l) 0.4μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶0.4μl滅菌水 41.8μl總體積 50μl(2)將上述混和液94℃變性3分鐘，然后進(jìn)入下來循環(huán)94℃變性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個循環(huán)后72℃延伸10分鐘，。(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
全文摘要
本發(fā)明的鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟提取葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其回交各世代基因組DNA，以其為模板，根據(jù)nap類型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf222和pol型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf224設(shè)計兼并引物，進(jìn)行鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳在葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其回交各世代中檢測不育分子標(biāo)記的特征帶。本發(fā)明首次在葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系回交各世代中檢測葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的一個分子標(biāo)記，為鑒別葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育特異種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12P19/00GK1699588SQ200510050319
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者張明方, 楊景華, 陳竹君 申請人:浙江大學(xué)