用于檢測(cè)亞砜化活性的亞精胺生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)由參與微生物過(guò)程的微生物產(chǎn)生的亞精胺生物標(biāo)志物的存在來(lái)評(píng)價(jià)所述過(guò)程中的亞砜化活性的方法。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)亞砜化活性的亞精胺生物標(biāo)志物發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種通過(guò)檢測(cè)由參與微生物過(guò)程的微生物產(chǎn)生的生物標(biāo)志物亞精胺的存在來(lái)評(píng)價(jià)所述方法中的亞砜化(sulfoxiding)活性的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在微生物過(guò)程，如生物浸出中，亞砜化活性是基礎(chǔ)，由此礦物質(zhì)中存在的還原硫的組分，尤其，如硫化物、硫代硫酸鹽或元素硫，被氧化，最終產(chǎn)生硫酸。一方面，此過(guò)程允許直接溶解礦物質(zhì)中與硫化物相關(guān)的金屬，而另一方面，通過(guò)產(chǎn)生硫酸，其允許常規(guī)的氧化礦物質(zhì)的酸浸出，溶解礦物質(zhì)中存在的金屬。
[0004]在亞砜化微生物中，涉及硫或硫還原組合物存在的工業(yè)方法中最常見和普遍發(fā)現(xiàn)的是嗜酸氧化硫硫桿菌(Acdith1bacillus th1xidans)。
[0005]請(qǐng)求人B1sigma SA已經(jīng)獲得了嗜酸氧化硫硫桿菌的特定菌株，LicanantayDSM1318株的專利權(quán)(參見B1sigma SA.CL2001-05的專利或其同族US$700, 343B2)，其在硫組分的氧化中顯示出改善的特性，防止礦物質(zhì)的鈍化(passivising)。LicanantayDSN173218株可以方便地用于任何微生物過(guò)程中，尤其是需要亞砜化活性的任何生產(chǎn)性微生物過(guò)程中。
[0006]迄今為止，評(píng)價(jià)微生物過(guò)程中的亞砜化活性的方式是通過(guò)測(cè)定這樣的方法中存在的亞砜化微生物(如，嗜酸氧化硫硫桿菌)的數(shù)量，例如，測(cè)量反應(yīng)器或生物浸出堆中存在的微生物的數(shù)量。評(píng)價(jià)微生物的濃度是復(fù)雜的，因?yàn)槠涫紫刃枰蛛x存在的微生物，然后特異性地鑒定它們。在所有這些階段中都存在困難，因?yàn)檫@些微生物常常與固體礦物質(zhì)、非常酸性的溶液和高濃度的鹽相關(guān)，這干擾了標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)或分子生物學(xué)過(guò)程，特別地，必須對(duì)其進(jìn)行改變，以能夠評(píng)價(jià)這些微生物。此外，特異性鑒定的過(guò)程通常是緩慢的，使得不能用作即時(shí)操作的控制參數(shù)。
[0007]然后產(chǎn)生了需求，需要一種允許快速評(píng)價(jià)微生物過(guò)程中的亞砜化活性的方法。
[0008]本發(fā)明的方法解決了這一技術(shù)問(wèn)題，提供了一種評(píng)價(jià)亞砜化活性的方法，快速且特異性地確定生物標(biāo)志物亞精胺的存在。
[0009]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了令人驚訝地，亞砜化活性與培養(yǎng)物的上清液中或微生物程序的流出物中的亞精胺的存在相關(guān)。
[0010]亞精胺(NH2-(CH2)4-NH-(CH2)3NH2)，是與腐胺一起的，為所有活的生命體中最大量和最廣泛分布的聚胺。它們的功能尚未得到清楚地確定，但估計(jì)它們與核酸的保護(hù)相關(guān)，并且在分裂、生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞死亡中是十分重要的。在嗜熱微生物，如一些亞砜化微生物中，認(rèn)為亞精胺參與對(duì)抗溫度變化的核酸和蛋白質(zhì)的保護(hù)。
[0011]發(fā)明人已經(jīng)確定了亞砜化細(xì)菌，如嗜酸氧化硫硫桿菌，主要產(chǎn)生亞精胺，而其他革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生腐胺。
[0012]令人驚訝地，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通常以胞內(nèi)形式發(fā)現(xiàn)的亞精胺，在不溶性硫化合物存在下，以及在可溶性硫化合物(如，例如連四硫酸鹽)的存在下(但程度較低)，被亞砜化微生物以顯著的數(shù)量分泌至上清液或胞外培養(yǎng)基中。不希望被理論限制，中間分泌的亞精胺是針對(duì)所需生物膜的形成的群聚感應(yīng)(quorum sensing)的信號(hào)是可能的，所述生物膜是針對(duì)對(duì)不溶性硫組合物的亞砜化活性。根據(jù)以上內(nèi)容，已經(jīng)開發(fā)了本發(fā)明的方法，當(dāng)檢測(cè)亞精胺生物標(biāo)志物存在時(shí)，證明了微生物過(guò)程中的亞砜化活性。
[0013]我們?cè)诂F(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何文獻(xiàn)描述了生物標(biāo)志物用于確定微生物過(guò)程中的亞砜化活性的用途。
[0014]同樣，雖然亞精胺已經(jīng)用作生物標(biāo)志物，但其應(yīng)用與本發(fā)明的那些非常不同。例如，Higuchi CM 和 Wang ff.(J.Cell.B1chem.1995 年 2 月;57 (2): 256-61)描述了亞精胺作為結(jié)直腸粘膜異常增殖的生物標(biāo)志物的用途，作為結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)劑。Einspahr JG等人(CancerEpidem1l B1markers Prev.2006年 10月;15 (10): 1841-8)測(cè)定了患有皮膚曬傷和光化性角化病的病人活檢樣本中的亞精胺濃度，作為化學(xué)預(yù)防皮膚癌的生物標(biāo)志物。Reynoso Orozco R.等人(Interciencia2008Ma33 (5) 384-388)描述了聚胺作為腫瘤活性生物標(biāo)志物的用途，并且使用它們來(lái)測(cè)定芬芳橄欖(Bursera fagaroides)的抗腫瘤活性。在另一個(gè)領(lǐng)域中，Shoeb F.等人(Plant Science2011 年 5 月；160 (6) 1229-1235)揭示了腐胺和亞精胺之間的比例作為植物再生能力生物標(biāo)志物的用途，特別是在水稻植物中。概括地，亞精胺已經(jīng)用作增殖活性的生物標(biāo)志物，并且用于離微生物過(guò)程和亞砜化活性非常遠(yuǎn)的環(huán)境中。
[0015]附圖描述
[0016]圖1.
[0017]來(lái)自含有5ng/ μ L亞精胺的溶液的質(zhì)譜；在146觀察到特征性峰，1648m/z。
[0018]圖2.
[0019]在用于生產(chǎn)嗜酸氧化硫硫桿菌株Licanantay DSM17318生物質(zhì)的反應(yīng)器中檢測(cè)亞精胺的圖，S元素和不同的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間:指數(shù)生長(zhǎng)期(Tl)、早靜止期(T2)和晚靜止期(T3)，如實(shí)施例1.1中所述。
[0020]圖3.
[0021]來(lái)自用于實(shí)施例2.1中所述的硫酸生產(chǎn)柱的流出物的質(zhì)譜，其中在146觀察到亞精胺的特征性峰，148m/z。
[0022]發(fā)明描述
[0023]本發(fā)明涉及證明微生物過(guò)程中的亞砜化活性的方法，檢測(cè)胞外培養(yǎng)基中生物標(biāo)志物亞精胺的存在。亞精胺，(NH2- (CH2) 4-NH- (CH2) 3NH2)，是生物來(lái)源的分子，當(dāng)通過(guò)本發(fā)明的亞砜化微生物在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和分泌時(shí)，只能存在于硫氧化過(guò)程中。
[0024]發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了亞砜化過(guò)程中最重要的微生物，嗜酸氧化硫硫桿菌，在不溶性硫化合物(如，硫化物、硫代硫酸鹽和元素硫)的存在下，以及在可溶性硫化合物(如，例如，連四硫酸鹽)的存在下(程度較低)，以極大的量在胞外培養(yǎng)基中分泌亞精胺。這些相同的硫化合物是這些細(xì)菌的亞砜化活性的底物，其中還原的硫化合物被氧化，最終產(chǎn)生硫酸。也就是說(shuō)，亞砜化活性與胞外培養(yǎng)基中亞精胺生物標(biāo)志物的存在相關(guān)。
[0025]亞砜化活性在許多微生物過(guò)程，例如，生物浸出、從元素硫生產(chǎn)硫酸、生產(chǎn)亞砜化生物質(zhì)等中是非常重要的。亞砜化活性在生物采礦中如此重要，使得在該過(guò)程中通過(guò)連續(xù)接種礦物質(zhì)來(lái)?yè)饺刖哂衼嗧炕钚缘奈⑸锸巧锝鲞^(guò)程的慣例，所述微生物如嗜酸氧化硫硫桿菌(參見，專利B1sigma SA.CL2911-06或其同族(US7837760))。盡管如此，由于礦物質(zhì)的性質(zhì)，亞砜化微生物常常暴露于抑制其活性或?qū)⑵湎挠卸疚镔|(zhì)。為此，能夠快速確定在生產(chǎn)性微生物過(guò)程(如，生物浸出、硫酸的生產(chǎn)或亞砜化生物質(zhì)的生產(chǎn))中是否真實(shí)存在亞砜化活性是非常重要的。
[0026]本發(fā)明解決了這一技術(shù)問(wèn)題，如在亞精胺生物標(biāo)志物的情況下，因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)測(cè)量胞外培養(yǎng)基中分泌的代謝產(chǎn)物，允許快速確定該過(guò)程中是否存在亞砜化活性，而不需要定量亞砜化微生物。
[0027]可以通過(guò)本領(lǐng)域可利用的任一種方法來(lái)檢測(cè)亞精胺，如，例如，薄層色譜(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)、基于改性酚酞的比色法或質(zhì)譜。對(duì)其沒(méi)有偏見，發(fā)明人認(rèn)為優(yōu)選的檢測(cè)方法是質(zhì)譜。
[0028]為了通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)微生物過(guò)程的上清液或流出物中的亞精胺，必須將樣品過(guò)濾，以消除存在的大分子，便利地使用3kDA截留大小的濾器，隨后必須將其蒸發(fā)并懸浮于水中。通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)由此制得的樣品，其中使其接受溶液A至B的梯度，其中A是水中0.1%的甲酸溶液，而B是乙腈中0.1%的甲酸溶液。如果樣品中存在亞精胺，則在譜中觀察到146的峰，1648m/z，參見圖1，其中顯示了 5ng/μ L亞精胺溶液的質(zhì)譜分析的譜。
[0029]在Tanima D 等的出版物(Tanima，D 等，(Tanima，D 等，O B1mol.Chem.2009，7，4689-4694))中描述了基于改性酚酞的亞精胺的比色檢測(cè)方法，其允許通過(guò)簡(jiǎn)單目測(cè)具有特征性粉色的酚酞來(lái)鑒定亞精胺。
[0030]如我們已經(jīng)指出的，由于所用的檢測(cè)方法在本發(fā)明的方法中不是關(guān)鍵的，所以可以通過(guò)本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中可利用的或?qū)?lái)可能開發(fā)的任一種方法來(lái)鑒定亞精胺。其中，本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)亞砜化微生物的胞外培養(yǎng)基中的胞內(nèi)分子的意義，即，這樣的分子亞精胺是亞砜化活性的生物標(biāo)志物。
實(shí)施例
[0031]在具有或不具有亞砜化活性的不同微生物過(guò)程的流出物中測(cè)定亞精胺的存在。
[0032]實(shí)施例1.嗜酸氣化硫硫桿菌和嗜酸氣化亞鐵硫桿菌(Acidith1baciIIusferrooxidans)培養(yǎng)物中亞精胺生物標(biāo)志物的檢測(cè)。
[0033]1.1)使用嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318的元素硫的生物質(zhì)生產(chǎn)反應(yīng)器。
[0034]對(duì)于菌株嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318，使用元素硫作為底物，分析了生物質(zhì)生產(chǎn)反應(yīng)器的不同生長(zhǎng)階段培養(yǎng)物的方式，在此過(guò)程中，存在高亞砜化活性。
[0035]使所述培養(yǎng)物生長(zhǎng)于KMDO，25X 培養(yǎng)基，((NH4)2S04，247，5mg/L ；NaH2PO4.H20，36，5mg/L ；KH2PO4,13，125mg/L ；MgS04 *7H20,25mg/L ;CaCl2，5, 25mg/L)中，含有 I %元素硫，pHl.8，連續(xù)攪拌，并且在30°C下。
[0036]在指數(shù)生長(zhǎng)期(Tl)、早靜止期(T2)和晚靜止期(T3)，從所述培養(yǎng)物獲取樣品。并且通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)方案，通過(guò)質(zhì)譜來(lái)分析。
[0037]樣品的制備:
[0038]-從所述培養(yǎng)物或者從流出物獲取5mL樣品。
[0039]-用0，22μ m孔徑的濾器過(guò)濾樣品，以收集胞外培養(yǎng)基。
[0040]通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)亞精胺:[0041 ]-將10 μ L制得的樣品注入HPLC設(shè)備中
[0042]-使樣品通過(guò)反相柱AgilentZorbax Extend C18 (產(chǎn)品編號(hào)727700-902)運(yùn)行。
[0043]-使其接受A至B溶液的梯度，其中A是水中0.1 %的甲酸溶液，而B是乙腈中
0.1 %的甲酸溶液。時(shí)間:0至5分鐘。
[0044]-通過(guò)正向模式的電離作用將其離子化，并且通過(guò)質(zhì)譜來(lái)檢測(cè)。
[0045]-如果樣品中存在亞精胺，則在譜中將觀察到146的峰，1648m/z。
[0046]結(jié)果表明了胞外培養(yǎng)基中亞精胺的存在，并且可以在圖2中看到。觀察到在元素硫的存在下，在嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318的3個(gè)生長(zhǎng)階段中，在上清液中存在亞精胺，并且亞精胺的濃度隨著時(shí)間提高，在生長(zhǎng)指數(shù)期(Tl)為0.03單位的相對(duì)豐度(A.r.)，在早靜止期(T2)為0.09A.r.，在晚靜止期(T3)為0.12A.r.。
[0047]1.2)使用嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Wenelen DSM16786，在Fe+2存在下，沒(méi)有元素硫的生物質(zhì)生產(chǎn)反應(yīng)器。
[0048]對(duì)于菌株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Wenelen DSM16786，使用硫酸亞鐵作為底物，分析了生物質(zhì)生產(chǎn)反應(yīng)器的不同生長(zhǎng)階段培養(yǎng)物的方式，在此過(guò)程中，不存在亞砜化活性。
[0049]使所述培養(yǎng)物生長(zhǎng)于KMD0.25X培養(yǎng)基中，含有6g/l Fe+2，pHl.8，連續(xù)攪拌，并且在30°C下。
[0050]在指數(shù)生長(zhǎng)期(Tl)、早靜止期(T2)和晚靜止期(T3)，從所述培養(yǎng)物獲取樣品。并且通過(guò)實(shí)施例1.1描述的實(shí)驗(yàn)方案，通過(guò)質(zhì)譜來(lái)分析，其中沒(méi)有可能檢測(cè)到胞外基質(zhì)中亞精胺的存在。
[0051]實(shí)施例2.具有亞砜化活性的生產(chǎn)性微生物過(guò)程中生物標(biāo)志物亞精胺的檢測(cè)。
[0052]2.1)硫酸生產(chǎn)柱。
[0053]從元素硫分析了硫酸生產(chǎn)柱的流出物。這是完全亞砜化的過(guò)程。
[0054]所用的硫酸生產(chǎn)柱為I米高，具有12cm的直徑，并且裝載有:
[0055]-12.5kg的石英，具有低于3/8英寸(0，4cm)和高于1/4英寸(0.63cm)范圍的大小
[0056]-1kg元素S (濃度為80Kg S/噸石英)
[0057]-1*108細(xì)胞/g S，接種嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 Wenelen DSM16786。
[0058]該柱在20°C下運(yùn)行，并且在開路中以lL/h/m2的速率用實(shí)驗(yàn)室水澆灌。在10天過(guò)程中，澆灌具有PH3，并且在隨后的數(shù)日，沒(méi)有調(diào)節(jié)pH，使用自然通風(fēng)(也就是說(shuō)，沒(méi)有空氣注入)。
[0059]作為平均，柱的硫酸生產(chǎn)為0.6kg硫酸/噸石英/天。即，證實(shí)了該柱中存在亞砜化活性。
[0060]在柱運(yùn)行的第16天，使用實(shí)施例1.1中描述的實(shí)驗(yàn)方案，獲取流出物樣品，并且通過(guò)質(zhì)譜分析，檢測(cè)流出物中亞精胺的存在。參見圖3。
[0061]作為陽(yáng)性對(duì)照，將5ng/yL加入柱的流出物中，并使其接受實(shí)施例1.1中所述的相同亞精胺檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案；如所預(yù)期的，在譜中觀察到了亞精胺的存在，參見圖1。
[0062]2.2)鐵離子生產(chǎn)柱。
[0063]分析了鐵離子生產(chǎn)柱的流出物，其中固定化細(xì)菌將柱進(jìn)料中存在的亞鐵離子氧化成鐵離子；在此過(guò)程中，不存在明顯的亞砜化活性。
[0064]評(píng)價(jià)了鐵離子生產(chǎn)柱，具有以下特征。
[0065]柱高I米，直徑為12cm，裝載有:
[0066]礦物質(zhì)浸出無(wú)菌礦物質(zhì)
[0067]大小80%低于 1/2 英寸(1，25cm)
[0068]礦物質(zhì)加載量 12kg
[0069]1*107細(xì)胞/g礦物質(zhì)，接種嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 Wenelen DSM16786。
[0070]該柱在20°C下運(yùn)行，并且在開路中以5L/h/m2的速率用KMD0.25X澆灌，補(bǔ)充1g/L Fe+2 ο在38天過(guò)程中，澆灌在pHl.4下進(jìn)行，并且在隨后的數(shù)日，沒(méi)有調(diào)節(jié)pH，使用自然通風(fēng)(也就是說(shuō)，沒(méi)有空氣注入)。
[0071]在第39天，使用實(shí)施例1.1中描述的實(shí)驗(yàn)方案，獲取流出物樣品，并且通過(guò)質(zhì)譜分析，其中沒(méi)有可能檢測(cè)到流出物中亞精胺的存在。
[0072]這些結(jié)果表明在其中存在亞砜化活性過(guò)程中(實(shí)施例1.1和2.1)，在胞外培養(yǎng)基中檢測(cè)到了亞精胺，而在其中不存在亞砜化活性的情況下(實(shí)施例1.2和2.2)，以胞外方式?jīng)]有檢測(cè)到亞精胺。以這種方式，證實(shí)了本發(fā)明方法的功效，其允許通過(guò)檢測(cè)由參與微生物過(guò)程的亞砜化微生物產(chǎn)生的生物標(biāo)志物亞精胺的存在來(lái)證明所述過(guò)程中的亞砜化活性。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)微生物過(guò)程的亞砜化活性的方法，其中是檢測(cè)胞外培養(yǎng)基中由參與所述微生物過(guò)程的亞砜化微生物產(chǎn)生的生物標(biāo)志物亞精胺的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中存在的亞砜化微生物主要是嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidith1bacillus th10xidans)類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)定所述微生物過(guò)程的流出物中亞精胺的存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述微生物過(guò)程是使用亞砜化微生物從元素硫生產(chǎn)硫酸的過(guò)程。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)定所述亞砜化微生物參與的生產(chǎn)性過(guò)程的上清液中亞精胺的存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述亞砜化微生物參與的生產(chǎn)性過(guò)程是亞砜化微生物的生物質(zhì)生產(chǎn)的反應(yīng)器。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述亞砜化微生物參與的生產(chǎn)性過(guò)程是生物浸取過(guò)程。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)薄層色譜(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)、基于改性酚酞的比色法或質(zhì)譜來(lái)檢測(cè)所述亞精胺生物標(biāo)志物的存在。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104508139SQ201280058977
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月2日
【發(fā)明者】P·瑪?shù)偌{茨貝朗熱, P·帕拉達(dá)瓦爾德坎托斯 申請(qǐng)人:拜奧希格馬股份有限公司