本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種油菜組織特異性啟動子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達的應用，本發(fā)明提供的油菜組織特異性啟動子能夠調(diào)控目的基因在植物花藥或花粉中特異轉(zhuǎn)錄或表達。

背景技術(shù)：

高等植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)控制。外源dna序列通過連接到特定的啟動子從而啟動在植物宿主中的表達，因此啟動子類型的選擇決定了基因的表達時間和部位。近些年比較熱門的研究對象是組織特異啟動子，這些組織特異啟動子主要包括葉片、韌皮部、維管束和根等器官特異表達啟動子以及花粉、花器官、果實、種子等生殖器官特異表達啟動子(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術(shù)通報，2007，(4)：21-24)。耿安奇等從白菜型油菜、甘藍型油菜、菜苔、甘藍中分離了4個啟動子并轉(zhuǎn)化煙草，gus染色分析其為花器官特異表達的啟動子(gengaq,zhaozj,niexl,etal.expressionanalysisoffourflower-specificpromotersofbrassicaspp.intheheterogeneoushosttobacco[j].africanjournalofbiotechnology,2009,8(20).)。ariizumi等分離了ltp12,xth3和pga4的啟動子并轉(zhuǎn)化擬南芥，gus染色表明這3個啟動子為花藥特異表達啟動子，且在表達時期上存在差異(ariizumit,amagaim,shibatad,etal.comparativestudyofpromoteractivityofthreeanther-specificgenesencodinglipidtransferprotein,xyloglucanendotransglucosylase/hydrolaseandpolygalacturonaseintransgenicarabidopsisthaliana[j].plantcellreports,2002,21(1):90-96.)。從玉米中克隆的zmglu1基因啟動子,連接gus報告基因后轉(zhuǎn)化至煙草中，檢測分析結(jié)果玉米的zmglu1啟動子驅(qū)動了gus基因在煙草根部高效表達(gur,zhaol,zhangy,etal.isolationofamaizebeta-glucosidasegenepromoterandcharacterizationofitsactivityintransgenictobacco[j].plantcellreports,2006,25(11):1157-1165.)。

以上這些報道都是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不同的植物間進行啟動子功能分析的例子，這些實例表明利用模式植物擬南芥、煙草等作為受體，通過轉(zhuǎn)基因植株的報告基因分析證實來自于其他植物的啟動子的功能是被廣泛認可和接受的。本發(fā)明從油菜中分離的一種組織特異啟動子的功能鑒定就是通過模式植物擬南芥完成的，最終在油菜中驗證。正是基于這個方法的成功應用，可以對組織特異啟動子的功能進行快速的體內(nèi)驗證，越來越多的組織特異啟動子被報道，這些都可能成為植物基因工程領(lǐng)域有實用價值的組織特異啟動子。組織特異啟動子成功應用的例子之一是通過基因工程調(diào)控植物花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系、恢復系和保持系，已在一些作物上獲得成功。

目前利用基因工程創(chuàng)造雄性不育的策略主要是利用花粉或花藥特異啟動子與外源基因融合，構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化植物，適時地阻斷花粉發(fā)育的過程從而達到雄性不育的目的。marianic等利用煙草花藥絨氈層特異啟動子ta29與rnaset1或barnase融合在一起，通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入煙草和油菜，獲得了穩(wěn)定的雄性不育的轉(zhuǎn)化株(marianc,debeuckeleerm,truettnerj,etal.inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene[j].nature,1990,347:737-741.)。兩年后，marianic等又用ta29驅(qū)動barstar基因，創(chuàng)建了上述雄性不育系的恢復(marianic,gosselev,debeuckeleerm,etal.achimaericribonuclease-inhibitorgenerestoresfertilitytomalesterileplants[j].nature,1992,357(6377):384-387.)。由此可見，即使不同的植物之間的體內(nèi)環(huán)境不同以及基因間存在互作差異，即使是與煙草性質(zhì)差異較大的植物，只要具有保守的核心啟動區(qū)域和相應保守的調(diào)控元件，就可以在其他不同植物中發(fā)揮啟動下游基因穩(wěn)定持續(xù)表達的生物學功能。

通過基因工程手段調(diào)控花粉育性、創(chuàng)造植物不育系、保持系及恢復系的關(guān)鍵之一是植物花粉或花藥啟動子的驅(qū)動活性和特異性。目前已知的驅(qū)動活性高且特異性良好的油菜花藥或花粉特異啟動子還相對較少，而油菜因其基因組較大且結(jié)構(gòu)復雜等原因，在花藥發(fā)育分子機制方面的研究不多，更多的是參考模式植物擬南芥中的相關(guān)研究。因此油菜花藥和花粉特異表達啟動子的克隆和鑒定，為油菜中利用基因工程調(diào)控花粉育性和創(chuàng)造植物雄性不育系提供新的調(diào)控元件，從而為油菜雜種優(yōu)勢資源在油菜育種中的充分利用打下基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種油菜組織特異性啟動子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達的應用，所述的油菜組織特異性啟動子序列為seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種油菜組織特異性啟動子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達的應用，包括利用本領(lǐng)域成常規(guī)手段，將包含有seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示啟動子驅(qū)動目的基因的表達載體轉(zhuǎn)入植物中，即可達到調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達；seqidno.5所示的啟動子序列可調(diào)控目的基因在植物花粉中特異表達，利用上述方法看創(chuàng)建基因工程不育系、保持系或恢復系。以上所述方案中，所述的植物為蕓薹屬植物，優(yōu)選的為油菜或擬南芥。

所述目的基因可以是促使碳水化合物降解的酶或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，或者是引起pcd過程的關(guān)鍵基因，更具體的如油菜的半胱氨酸蛋白酶基因、β-1、3-葡聚糖酶基因，哺乳動物的細胞毒素基因、細胞凋亡基因或者可選自原核調(diào)控系統(tǒng)，還可以是顯性的雄性不育基因。

所述的重組植物表達載體中還可含有選擇標記基因。所述的標記基因通常包括提供抗生素抗性或除草劑抗性的基因，諸如：潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。

可以采用任何一種的植物轉(zhuǎn)化方法將本發(fā)明所構(gòu)建的重組植物表達載體轉(zhuǎn)化到受體植物的細胞、組織中，得到轉(zhuǎn)化體；再由轉(zhuǎn)化體通過植物組織培養(yǎng)方法再生得到完整的植株及其無性系或其后代；所述的轉(zhuǎn)化方法包括：農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、顯微注射、電穿孔法、微粒轟擊等；所述的受體植物包括蕓薹屬植物；優(yōu)選的，所述的受體植物為油菜。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明將seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5的序列分別與報告基因可操作的連接，構(gòu)建得到重組植物表達載體；以擬南芥和油菜為受體材料，利用農(nóng)桿菌gv3101介導，將重組植物表達載體轉(zhuǎn)化到擬南芥和油菜中，不同轉(zhuǎn)化子的gus染色表明，seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示所示的啟動子能夠驅(qū)動報告基因在花藥中特異表達，而在角果、根、莖、葉等其它組織部位里沒有表達活性；seqidno.5所示的序列能夠驅(qū)動報告基因在花粉中特異表達，其它組織部位不表達。說明seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示的啟動子片段都具有組織特異性啟動子的功能。本發(fā)明對油菜花藥和花粉特異表達啟動子的克隆和鑒定，為油菜中利用基因工程調(diào)控花粉育性和創(chuàng)造植物雄性不育系提供新的調(diào)控元件，從而為油菜雜種優(yōu)勢資源在油菜育種中的充分利用打下基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是啟動子片段seqidno.1和seqidno.5檢測電泳圖；

其中泳道m(xù)：dnamarker；泳道1：seqidno.1所示的啟動子；泳道2：seqidno.5所示的啟動子。

圖2為表達載體pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost的示意圖。

圖3為啟動子seqidno.1啟動子元件示意圖。

圖4為啟動子seqidno.1轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織器官的gus染色。

其中，a為14d整株苗；b為莖生葉；c為花序；d為花蕾；e為5mm長角果；f為10mm長角果。

圖5為啟動子seqidno.5轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織器官的gus染色示意圖；

其中，a為14d整株苗；b為莖生葉；c為花序；d為花蕾；e為5mm長角果；f為10mm長角果。

圖6為啟動子seqidno.5轉(zhuǎn)基因擬南芥gus染色花藥的半薄切片。

其中，s11為花藥發(fā)育第11期；s12為花藥發(fā)育第12期；s13為花藥發(fā)育第13期；s14為花藥發(fā)育第14期，bar＝20μm。

具體實施方式

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實施例1：

油菜組織特異啟動子seqidno.1～seqidno.5的克隆及其植物表達載體構(gòu)建

利用ctab法提取油菜中雙11葉片基因組dna，以此dna為模板進行pcr擴增，反應體系為50μl。

擴增啟動子seqidno.1的引物為：

1-f：5′-(sali)cgcgtcgacccatcttactccaatagtattttgg-3'、1-r：5′-(smai)ccccgggccgttcttcttttcaatatttaaaa-3；

擴增啟動子seqidno.2的引物為：

2-f：5′-(sali)cgcgtcgacatggagaacttaaatagacaaatac-3'、2-r：5′-(smai)ccccgggccgttcttcttttcaatatttaaaa-3；

擴增啟動子seqidno.3的引物為：

3-f:5′-(sali)cgcgtcgacatggagaacttaaatagacaaatac-3'、3-r：5′-(smai)ccccgggaatcagattatttaagctgtctaaa-3；

擴增啟動子seqidno.4的引物為：

4-f：5′-(sali)cgcgtcgacatgaaacgaaagccacctc-3'、4-r：5′-(smai)ccccgggccgttcttcttttcaatatttaaaa-3；

擴增啟動子seqidno.5的引物為：

5-f：5′-(sali)cgcgtcgacatgaaacgaaagccacctc-3'和5-r：5′-(smai)ccccgggaatcagattatttaagctgtctaaa-3。

50μl體系如下：

pcr反應程序為：98℃預變性2min，然后以98℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s,進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％質(zhì)量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，pcr產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后，37℃酶切(sali和smai)2h，再次回收，分別與植物表達載體pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost在4℃過夜連接，熱激法轉(zhuǎn)化并挑取單克隆，pcr檢測陽性后送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與參考基因組序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5完全一致，即獲得了含有目的啟動子的植物表達載體，分別命名為pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-1，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-2，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-3，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-4和pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-5。

實施例2：

啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達的應用：

1)啟動子融合報告基因的表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥

實施例1構(gòu)建成功的含有啟動子植物表達載體的單克隆大腸桿菌菌液37℃活化并提取質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)法將pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-1，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-2，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-3，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-4和pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-5分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素(50μg/ml)和利福平(50μg/ml)的平板上培養(yǎng)后挑取單克隆，用啟動子的克隆引物檢測，確定陽性克隆。28℃活化陽性農(nóng)桿菌菌液，采用花序浸染法(zhangx,henriquesr,linss,etal.agrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthalianausingthefloraldipmethod[j].natureprotocols,2006,1(2):641-646.)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，浸染2次后收獲的種子，經(jīng)消毒后均勻地鋪在含有濃度為50μg/ml卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上生長，獲得的存活綠苗初步認定為陽性植株。將它們移栽到蛭石中，待植株長至5-7片真葉時取一個葉片，ctab法提取葉片基因組dna，對其進行pcr鑒定，引物為啟動子特異擴增引物，反應體系和程序如實施例1所述。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr反應產(chǎn)物，大小與目的啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的大小一致。結(jié)果表明5個啟動子的植物表達載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入擬南芥，收獲各陽性單株的t1代種子。

2)轉(zhuǎn)基因擬南芥不同組織器官的gus染色

在含有濃度為50μg/ml卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上篩選各陽性單株的t1代種子，每個啟動子表達載體確定符合孟德爾遺傳定律3:1分離的單拷貝的株系3-5個，在t3代進行不同組織(14d整株苗，開花后的莖、葉片、花序、5mm長角果、10mm長角果)進行g(shù)us染色，步驟如下：

(1)收集擬南芥材料到小離心管中或小玻璃瓶中(事先加入預冷的90％丙酮)，冰上放置，直到收集完所有樣品。

(2)材料收集完后在冰上放置20min。

(3)丙酮處理完，用預冷的gus染色緩沖液漂洗組織約10min。gus染色緩沖液的成分見下表。

gus染色緩沖液的成分

(4)換掉染色緩沖液，加入含有x-gluc的gus染液，抽真空15-30min。gus染液成分見下表。

gus染液的成分

(5)37℃染色過夜。

(6)去掉染液。在室溫下將染色樣品依次置于20％、35％、50％、70％乙醇溶液中，每個處理30min，其中在70％乙醇中，染色組織可以長期保存或觀察。

用olympusdp72數(shù)碼成像系統(tǒng)對染色結(jié)果照相并保存圖片。各株系的gus染色結(jié)果均表明：啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4可以驅(qū)動gus基因在擬南芥的花藥中特異表達，其它組織和器官中均不表達(圖4)；啟動子seqidno.5驅(qū)動gus基因在擬南芥花粉中特異表達(圖5)。

3)啟動子seqidno.5轉(zhuǎn)基因擬南芥gus染色花藥的半薄切片

為了確定啟動子seqidno.5驅(qū)動gus基因表達的具體時期，我們對啟動子seqidno.5的gus染色的花藥進行半薄切片。步驟如下：

l)脫水：保存在70％乙醇中的被gus染色的花序，分別在80％、95％和100％乙醇中逐級脫水，每級脫水2h。

2)脫水完成后，輕輕的將花序切開，分成單個的小花蕾，再進行如下操作：

a，預滲透：將小花蕾置于預滲透液(95％乙醇：baseliquidtechnovit7100＝1：1混合)中預滲透3h。

b，滲透：小花蕾轉(zhuǎn)入適量的滲透液(1g硬化劑i溶于100mlbaseliquidteclmovit7100)中滲透8-12h。

c，包埋：每個200μl小離心管內(nèi)加入100μl的包埋劑(硬化劑ⅱ：滲透液＝1：15混合)，將單個的小花蕾用尖頭鑷子輕輕地塞入離心管內(nèi)，盡量保持小花蕾垂直向下，然后將離心管垂直放置在pcr板上。室溫下幾分鐘后即開始凝固聚合，2h后將包埋好的樣品置于37度恒溫箱內(nèi)繼續(xù)聚合，1周后即可進行切片。

d，切片：用leicaultracutr型超薄切片機進行切片,切片厚度為8μm，邊切片邊鏡檢(nikoneclipse80i顯微鏡)，保證切片的完整性。

e，粘片：切好的片子用細銅絲繞制的小銅網(wǎng)撈片，直接轉(zhuǎn)到滴有水的干凈載玻片上，電熱臺上展片、烘干。

f，封片：加拿大樹脂封片，永久保存。

h，觀察照相：nikoneclipse80i顯微鏡下觀察，并用ds-ril數(shù)碼照相。

gus染色花藥的半薄切片表明啟動子seqidno.5的gus信號特異在花粉的雙核初期出現(xiàn)，持續(xù)至花粉粒成熟(圖6)。

綜合這些結(jié)果說明：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示的核苷酸序列是花藥特異啟動子，seqidno.5是一個花粉特異啟動子。這些特異啟動子片段為控制植物育性提供了新的有效調(diào)控元件，對基因工程育種具有很好的應用前景。

4)seqidno.5轉(zhuǎn)基因油菜花藥的gus染色

將pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-5轉(zhuǎn)入甘藍型油菜中，對陽性單株進行g(shù)us染色，發(fā)現(xiàn)gus基因只在花粉中表達，和擬南芥中結(jié)果一致。

實施例3：

啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5序列在蕓薹屬植物白菜、甘藍和油菜中的保守性

基于pcr反應，使用實施案例1中的引物分別克隆了啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5在白菜、甘藍和油菜中的同源片段并測序，通過序列比對發(fā)現(xiàn)它們的序列同源性高達100％，最低的為99.78％，僅1bp差異，而且該差異不在核心啟動子區(qū)域。這說明啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5序列在蕓薹屬植物白菜、甘藍和油菜中是高度保守。預示著啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的功能也是保守的。正如實施案例2中的seqidno.5啟動子在擬南芥和油菜中驅(qū)動gus基因表達的模式相同。也就是說將啟動子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的植物表達載體分別轉(zhuǎn)入到白菜、甘藍和油菜中，它們驅(qū)動目的基因表達的模式是相同的，均是花藥或花粉特異表達。

sequencelisting

<110>華中農(nóng)業(yè)大學

<120>一種油菜組織特異性啟動子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達的應用

<130>一種油菜組織特異性啟動子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達的應用

<160>5

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ccatcttactccaatagtattttggatcttactcattttctgtcttttgaaaacatctaa60

aacttgattatggagaacttaaatagacaaatacatttataagccgaaaactatgtcact120

acgctttgctgcttttggcatatacatgttgtttaatttactcgcatgaaacgaaagcca180

cctcacgtcgtgctattttcggtgtaaccttaacggtggatctttaaataaaaccaaact240

atttaaatttagggcacaatccaacaaaagtagtacaacacgtaaaaatcgttgcaactt300

tagacagcttaaataatctgattatgaccttttcttaaaccattcttttgttttaaatat360

tgaaaagaagaacgg375

<210>2

<211>306

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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tgcttttggcatatacatgttgtttaatttactcgcatgaaacgaaagccacctcacgtc120

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<210>3

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<212>dna

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<210>4

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