奶牛乳房炎主要致病菌四重pcr快速檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，包括由四對特異性引物構(gòu)成的引物對組。應(yīng)用本發(fā)明結(jié)合多重PCR技術(shù)可一次性同時擴增致病性無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌的特異性基因sip、nuc、rrnB和HblA，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，能對奶樣中存在的主要病原菌進行全面、高效、準(zhǔn)確的檢測與鑒定。本發(fā)明克服了常規(guī)病原菌檢測技術(shù)操作繁瑣、費時耗力等缺點，增加病原菌檢查的種類，提高了檢測的特異性和靈敏度，具有比常規(guī)檢測方法更特異、更敏感的特點，適合在基層獸醫(yī)站和奶牛養(yǎng)殖場中進行快速檢測，具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于奶牛乳房炎病原細菌檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]快速檢測與鑒定奶牛乳汁中的病原菌是及時有效地控制與預(yù)防病原菌傳播的前提，這對奶牛和人類健康都具有重要意義。目前，病原細菌的檢測方法主要依靠常規(guī)的細菌學(xué)培養(yǎng)方法，一般需4~7d，操作繁瑣，費時耗力；有關(guān)病原細菌檢測的乳膠凝集法、免疫磁珠分離法、酶免疫測定方法、核酸雜交技術(shù)和PCR技術(shù)，因其特異性強、敏感性高、操作簡單、檢測快速等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，但這些方法每次實驗通常只能檢測一種病原微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，適用于被無乳鏈球菌(S.agalactiae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、臘樣芽抱桿菌(Bacilluscereus)污染的奶樣樣品的分析。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，包括由四對特異性引物構(gòu)成的引物對組；四對特異性引物分別是鑒定無乳鏈球菌sip基因的引物對sip-F和sip-B，鑒定金黃色葡萄球菌Nuc基因的引物對Nuc-F和Nuc-B，鑒定大腸桿菌rrnB基因的引物對rrnB-F和rrnB_B，鑒定蠟樣芽孢桿菌HbIA基因的引物對HbIA-F和HbIA-B ；弓丨物對sip_F和sip-Β、引物對Nuc-F和Nuc-B、引物對rrnB-F和rrnB_B、引物對HblA-F和HblA-B的特異性引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和2、4和5、7和8、10和11的堿基序列。
[0005]上述奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，包括以下試液:
[0006]A試液:含10XPCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和四對特異性引物；
[0007]B試液:含無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的DNA，作為陽性對照；
[0008]C試液:去離子水，作為陰性對照。
[0009]A 試液每管 42 μ 1，含 10XPCR 緩沖液 5 μ 1、2.5mM MgCl25 μ 1、2.5mmol/L 的 dNTPs4μ 1、四對特異性引物包括:無乳鏈球菌上游和下游引物各2μ 1、金黃色葡萄球菌上游和下游引物各2 μ 1、大腸桿菌上游和下游引物各2 μ 1、蠟樣芽孢桿菌上游和下游引物各2 μl,引物濃度均為 10 μ mol/L, 5U/ μl Taq 酶 0.5 μl,去離子水 11.5 μl。
[0010]奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒的引物對組，包括四對特異性引物，分別是鑒定無乳鏈球菌sip基因的引物對sip-F和sip-B，鑒定金黃色葡萄球菌Nuc基因的引物對Nuc-F和Nuc-B，鑒定大腸桿菌rrnB基因的引物對rrnB-F和rrnB_B，鑒定蠟樣芽孢桿菌HblA基因的引物對HblA-F和HblA-B ;引物對sip-F和sip-B、引物對Nuc-F和Nuc-B、引物對rrnB-F和rrnB_B、引物對HblA-F和HblA-B的特異性引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和2、4和5、7和8、10和11的堿基序列。
[0011]奶牛乳房炎病因比較復(fù)雜，影響因子較多，傳統(tǒng)的檢測方法無法對乳汁中難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進行檢測，而且特異性不高、靈敏度低、操作煩瑣、耗時，實現(xiàn)有效的監(jiān)測、預(yù)防非常困難。針對這些問題，發(fā)明人結(jié)合多重PCR擴增技術(shù)，研制了本發(fā)明的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，據(jù)此建立的多重PCR快速檢測方法，可實現(xiàn)一次性、快速檢測乳汁中的出多種奶牛乳房炎主要病原菌(包括無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌)的目的。
[0012]本發(fā)明所篩選的各病原菌基因均具有較強的特異性和靈敏性:無乳鏈球菌的sip基因(序列表SEQ.1D.N0.3)序列具有高度保守性，比其他基因有更高的靈敏度；金黃色葡萄球菌nuc基因(序列表SEQ.1D.N0.6)只存在于金黃色葡萄球菌中，在其它葡萄球菌和病原菌中均檢測不出；大腸桿菌的rrnB基因(序列表SEQ.1D.N0.9)序列也具有高度保守性，比其他基因有更高的敏感性；蠟樣芽孢桿菌的hblA基因(序列表SEQ.1D.N0.12)也是其基因組中較為保守的序列。依據(jù)這些特定基因序列，發(fā)明人設(shè)計了四對特異性引物，以此為基礎(chǔ)的本發(fā)明的試劑盒，能對奶樣中存在的主要病原菌進行全面、高效、準(zhǔn)確的檢測與鑒定；所有反應(yīng)可在同一 PCR管中進行，操作簡單、快速，具很高的特異性和敏感度，為快速檢測與鑒定乳房炎病原菌提供了有效的手段，還可以推廣應(yīng)用于乳樣監(jiān)測、乳制品質(zhì)量檢測等領(lǐng)域；并為其它乳樣中不同致病菌檢測組合提供技術(shù)模式，可以大大提高檢測效率、縮短檢測周期、降低檢測成本，具有顯著的經(jīng)濟與社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是各菌種的單重PCR檢測結(jié)果圖，圖中:M是Marker，I無乳鏈球菌，2金黃色葡萄球菌,3大腸桿菌,4臘樣芽孢桿菌,5陰性對照。
[0014]圖2是退火溫度優(yōu)化的PCR電泳圖，圖中:M是Marker，53-57分別對應(yīng)退火溫度53。。、54。。、55。。、56。。、57。。。
[0015]圖3是Taq酶優(yōu)化的PCR電泳圖，圖中:M是Marker，1-4分別對應(yīng)Taq酶0.5 μ 1、
0.7 μ 1、0.9 μ 1、1.I μ I。
[0016]圖4是多重PCR凝膠電泳結(jié)果圖，圖中:Μ是Marker，1-4分別對應(yīng)無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌；5-10為2重PCR，分別對應(yīng)5蠟樣芽孢桿菌與大腸桿菌，6蠟樣芽孢桿菌與無乳鏈球菌，7蠟樣芽孢桿菌與金黃色葡萄球菌，8大腸桿菌與金黃色葡萄球菌，9大腸桿菌與無乳鏈球菌，10無乳鏈球菌與金黃色葡萄；11-14為3重PCR，分別對應(yīng)11金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌；12無乳鏈球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌；13無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌；14無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌；15為4重PCR，對應(yīng)無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌。
【具體實施方式】
[0017]1.1材料與方法
[0018]1.1.1 材料
[0019]1.1.1.1 菌株[0020]無乳鏈球菌、金黃色葡萄球?qū)?、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌；沙門氏菌、白色念珠菌，肺炎克雷伯氏囷、沙雷氏囷、綠胺桿囷、枯早牙抱桿囷由本實驗室保存。
[0021]1.1.1.2主要儀器和試劑
[0022]手提式壓力蒸汽滅菌器購于上海博訊實業(yè)有限公司，超凈工作臺購于蘇州凈化設(shè)備廠，電熱恒溫培養(yǎng)箱購于上海精宏實驗設(shè)備有限公司，光學(xué)顯微鏡購于Motic，電子天平購于島津，微量移液槍Eppend0rf，-8(TC超低溫冰箱購于海爾集團，離心機購于長沙湘儀離心機儀器有限公司。
[0023]1.1.1.3 引物設(shè)計[0024]根據(jù)GenBank收錄的無乳鏈球菌的sip基因序列、金黃色葡萄球菌的nuc基因、大腸桿菌的rrnB基因和蠟樣芽孢桿菌的hblA基因，利用Primer 510軟件和Oligo 6.0設(shè)計各種乳房炎致病菌特異性PCR引物，引物序列具體如下:
[0025]無乳鏈球菌引物sip-F:5 ' -TATTCTTCTGCGCCAGCTTTG-3 '(序列表 SEQ.1D.N0.1),
[0026]無乳鏈球菌引物sip-B:5 ' -GGGCTGCTACAGTTCTTACCG-3 '(序列表 SEQ.1D.N0.2),
[0027]金黃色葡萄球菌引物nuc-F:5 ' -GAAAGGGCAATACGCAAAGAGG-3 '(序列表 SEQ.1D.N0.4),
[0028]金黃色葡萄球菌引物nuc-B:5 ' -CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3 '(序列表 SEQ.1D.N0.5),
[0029]大腸桿菌引物rrnB-F:5/ -ACGGCAAAGTGTGGGTCAAT-3'(序列表 SEQ.1D.N0.7),
[0030]大腸桿菌引物rrnB-B:5' -AGCGTAAGGGTAATGCGAGG-3'(序列表 SEQ.1D.N0.8)，
[0031]蠟樣芽孢桿菌引物hblA-F:5 ' -GGACACGATGTTAGAGCATTTGG-3 '(序列表 SEQ.1D.N0.10)，
[0032]蠟樣芽孢桿菌引物hb IA-B: 5 ' -GATACAGCGAGTAGTTTATTAGGGATT-3 '(序列表SEQ.1D.N0.11)。
[0033]1.1.2 方法
[0034]1.1.2.1細菌DNA模板的制備
[0035]1.1.2.1.1直接加入法
[0036]挑取培養(yǎng)基上的單個菌落置于加有10 μ I滅菌水的EP管內(nèi)，反復(fù)吹吸后吸取2 μ I直接作為模板進行DNA反應(yīng)。
[0037]1.1.2.1.2試劑盒提取法
[0038]挑取培養(yǎng)基上的單個菌落37°C培養(yǎng)24h，生理鹽水洗脫細菌，用細菌基因組DNA提取試劑盒(Easypure genomic DNA kit, 50 x，transgene)抽提細菌DNA,提取方法按說明書進行。
[0039]1.1.2.2基因的擴增、克隆和測序
[0040]采用設(shè)計的特異性引物對抽提的細菌基因組DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物分別與載體過夜連接后轉(zhuǎn)化.用小量質(zhì)粒提取試劑盒(三博遠志質(zhì)粒提取試劑盒，50 X，北京三博遠志生物技術(shù)公司)提取轉(zhuǎn)化生長的菌落質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。
[0041]1.1.2.3 4重PCR條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化
[0042]對不同退火溫度(53_57°C )和PCR反應(yīng)液各成分在PCR儀上進行PCR擴增，摸索4重PCR的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。
[0043]1.1.2.4 4重PCR方法的特異性和敏感性試驗
[0044]用優(yōu)化的4重PCR方法對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌，沙門氏菌、白色念珠菌，肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌進行檢測，評價4重PCR方法的特異性。
[0045]將500ng的細菌DNA進行10倍梯度稀釋至500fg，用優(yōu)化的4重PCR方法分別對其進行檢測，評價4重PCR方法的敏感性。具體操作按以下操作進行:
[0046]<1>制備DNA樣本:采用直接加入法
[0047]〈2>4重PCR反應(yīng):取步驟〈1>所得DNA樣本作為模板進行PCR擴增，并同時分別以標(biāo)準(zhǔn)品DNA和去離子水為陽性對照樣本和陰性對照樣本進行PCR擴增；PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和擴增程序分別為:
[0048]反應(yīng)體系:PCR混合液50 μ 1，其中PCR反應(yīng)體系中含10XPCR緩沖液5 μ 1,2.5mMMgCl24 μ 1、dNTPs 5 μ 1， 引物各 2 μ I ；
[0049]擴增程序:95°C 5min ;隨后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括:95°C 5min ;隨后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C 45s, 55°C 40s, 72°C 45s ;最后72°C lOmin，于4°C停止反應(yīng)。
[0050]PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ IPCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，然后EB染色lOmin，漂洗，在紫外透射儀下觀察結(jié)果。
[0051]1.1.2.5 4重PCR試劑盒的組裝
[0052]A 試液屮0?反應(yīng)液(42“ 1)，含 IOXPCR 緩沖液 5 μ 1、2.5mM MgCl25 μ 1、2.5mmol/LdNTPs4l.! 1、四對特異性引物包括:無乳鏈球菌上游和下游引物各2 μ 1、金黃色葡萄球菌上游和下游引物各2 μ 1、大腸桿菌上游和下游引物各2 μ 1、蠟樣芽孢桿菌上游和下游引物各 2μ1 (濃度均為 10 μ mol/L), 5U/μ I Taq 酶 0.5 μ I,去離子水 11.5 μ I。
[0053]B試液:含無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌的DNA，作為陽性對照:
[0054]C試液:去離子水，作為陰性對照:
[0055]PCR反應(yīng)管
[0056]1.1.2.6檢測試劑盒保存期試驗
[0057]將檢測試劑盒共3批次保存_20°C冰箱中。分別于保存后1、3和6個月，用保存的試劑盒分別對10份奶樣陽性樣品檢測，每批檢測試劑盒的保存期都重復(fù)檢測3次，觀察檢測結(jié)果，同時每批檢測試劑盒的每個保存期都進行保存后的敏感性測定。
[0058]試劑盒的使用方法如下:
[0059]<1>樣品的處理和模板的制備:在無菌條件下將樣品接種在培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)18小時后取培養(yǎng)基上的單個菌落置于加有10 μ I滅菌水的離心管內(nèi)，反復(fù)吹吸后吸取2 μ I直接作為模板進行PCR反應(yīng):
[0060]<2>PCR反應(yīng):在加有試劑A液的反應(yīng)管中，分別加入8μ I預(yù)處理過的待檢樣品、8 μ I B液和8 μ I C液，混勻后在PCR儀中進行以下反應(yīng):95°C 5min ;隨后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C 45s, 55°C 40s, 72°C 45s ;最后72°C lOmin，于4°C停止反應(yīng)。
[0061] PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)電泳、染色、漂洗，最后在紫外透射儀下觀察結(jié)果。
[0062]2.結(jié)果
[0063]2.1細菌DNA模板制備的比較
[0064]直接加入法和試劑盒提取法均能達到預(yù)期的擴增效果。在DNA模板制備過程中試劑盒提取法提取細菌DNA需要0.5-lh，而直接加入法無需DNA提取，直接進行PCR即可，縮短了檢測時間。
[0065]2.2目的基因的擴增、克隆和測序
[0066]采用設(shè)計的特異性引物對抽提的4種細菌基因組DNA進行PCR擴增，如圖1所示，PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)與預(yù)期擴增長度相同的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和回收后，與載體過夜連接并轉(zhuǎn)換。獲得的陽性質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果與參考序列完全一致，證實引物可特異性擴增出4種相應(yīng)細菌的基因片段。
[0067]2.3 4重PCR條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化
[0068]如圖2所示，對PCR退火溫度和PCR反應(yīng)液各成分進行優(yōu)化，獲得了 4重PCR最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ;隨后進行35個95°C 45s, 55°C 40s，72°C 20s的循環(huán)；最后72°C延伸3min。
[0069]2.4 4重PCR方法的特異性和敏感性試驗
[0070]用建立的4重PCR方法檢測無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、臘樣芽孢桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌，肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌進行檢測，只能擴增出無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌4種細菌的基因目的片段，沒有擴增出其他細菌基因的任何片段，表明建立的方法特異性強。
[0071]用優(yōu)化的4重PCR方法分別對500ng-500fg的細菌DNA進行檢測，電泳結(jié)果表明方法最低檢測極限是50pg的細菌DNA。
[0072]2.5檢測試劑盒保存期試驗
[0073]配制好的5批檢測試劑盒在-20°C條件下保存，每3個月取出對樣品重復(fù)進行3次檢測，結(jié)果5批檢測試劑盒1、3、6、9和12個月后，其敏感性都沒有發(fā)生變化，均能檢測到50pg的4種細菌的DNA模板，對10份陽性樣品的檢測均為陽性，對10份陰性樣品的檢測均為陰性，這表明試劑盒在_20°C條件下保存12個月仍具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
[0074]本研究利用PCR可以在基因水平上直接進行檢測的優(yōu)點，以4種細菌的特異性基因為靶目標(biāo)，針對基因特異性區(qū)域設(shè)計引物進行4種細菌的PCR鑒定。結(jié)果表明，本檢測方法及試劑盒僅對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌呈陽性，不能檢出其他相關(guān)細菌，具有較高的特異性；同時，操作省時簡便，敏感性很好，最低可檢測出50pg的細菌DNA。
【權(quán)利要求】
1.一種奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，其特征在于包括由四對特異性引物構(gòu)成的引物對組；四對特異性引物分別是鑒定無乳鏈球菌Sip基因的引物對Sip-F和sip-B，鑒定金黃色葡萄球菌Nuc基因的引物對Nuc-F和Nuc-B，鑒定大腸桿菌rrnB基因的引物對rrnB-F和rrnB_B，鑒定蠟樣芽孢桿菌HblA基因的引物對HblA-F和HblA-B ;所述引物對sip-F和sip-B、引物對Nuc-F和Nuc-B、引物對rrnB_F和rrnB_B、引物對HblA-F和HblA-B的特異性引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和2、4和5、7和8、10和11的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，其特征在于包括以下試液: A試液:含10XPCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和四對特異性引物； B試液:含無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的DNA，作為陽性對昭.>、、、? C試液:去離子水，作為陰性對照。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，其特征在于:所述 A 試液每管 42μ 1，含 10XPCR 緩沖液 5μ 1、2.5mM MgCl25y 1、2.5mmol/L 的dNTPs4l.! 1、四對特異性引物包括:無乳鏈球菌上游和下游引物各2 μ 1、金黃色葡萄球菌上游和下游引物各2 μ 1、大腸桿菌上游和下游引物各2 μ 1、蠟樣芽孢桿菌上游和下游引物各2 μ I,引物濃度均為 10 μ mol/L, 5U/ μ I Taq 酶 0.5 μ I,去離子水 11.5 μ I。
4.奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒的引物對組，其特征在于包括四對特異性引物，分別是鑒定無乳鏈球菌sip基因的引物對sip-F和sip-B，鑒定金黃色葡萄球菌Nuc基因的引物對Nuc-F和 Nuc-B，鑒定大腸桿菌rrnB基因的引物對rrnB_F和rrnB_B，鑒定蠟樣芽孢桿菌HblA基因的引物對HblA-F和HblA-B ;所述引物對sip-F和sip-B、引物對Nuc-F和Nuc-B、弓丨物對rrnB-F和rrnB_B、引物對HblA-F和HblA-B的特異性引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和2、4和5、7和8、10和11的喊基序列。
【文檔編號】C12Q1/14GK103627812SQ201310673972
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】何寶祥, 陳亞明, 杜向宏 申請人:廣西大學(xué)