一種快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒及其應(yīng)用，試劑盒由Bst?DNA聚合酶、LAMP擴增反應(yīng)體系，陰性對照液和陽性對照液組成。其中，LAMP擴增反應(yīng)體系由LAMP引物組和擴增反應(yīng)液組成，其中每25μL?LAMP擴增反應(yīng)體系由10μM?F3和B3，40μM?FIP和BIP，1×thermopol?buffer,1M甜菜堿,3.5μL?dNTP,6mM?MgCl2和1μL模板DNA組成，其余部分由滅菌雙蒸水補足。本發(fā)明可以對肉中污染的沙門氏菌進行快速簡便的檢測，無需復(fù)雜的熱循環(huán)儀，普通的水浴鍋就可以滿足溫度的要求。具有快速、靈敏、簡便、高效的優(yōu)點。
【專利說明】一種快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒及其應(yīng)用，屬于食品安全【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌在環(huán)境中廣泛存在，是一種引起食源性疾病的重要致病菌，能引起人胃腸炎、傷寒、敗血癥等癥狀。沙門氏菌菌屬類型多樣，抗原復(fù)雜，目前已分離出2500多個血清型。最近的一項研究美國食源性疾病暴發(fā)的報告中指出沙門氏菌是最常見的細菌性病原體，占所有細菌性食物中毒的52%。在我國近年來，沙門氏菌也是微生物引起食源性疾病中最主要的病原菌之一，占17.19%。許多動物性食品尤其是生肉，都是沙門氏菌污染的主要來源。目前檢測沙門氏菌的傳統(tǒng)方法費時費力，或者需要復(fù)雜昂貴的儀器等缺點已經(jīng)不適用于現(xiàn)代檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)由Notomi等人于2000年建立，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，通過對靶基因的6個區(qū)段設(shè)計的4條特異性的引物，在恒溫(60~65°C)、短時間(Ih)條件下達到對目的基因的高效擴增。由于LAMP的擴增產(chǎn)物是靶基因的一系列反向重復(fù)形成的類似花椰菜結(jié)構(gòu)，電泳呈現(xiàn)的是不同片段大小組成的階梯式圖譜，也可以根據(jù)生成的焦磷酸鎂沉淀通過肉眼來判斷反應(yīng)是否發(fā)生。本方法所采用的試劑盒技術(shù)能夠?qū)θ庵猩抽T氏菌進行快速靈敏的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒。目的在于解決傳統(tǒng)方法檢測沙門氏菌繁瑣和費時費力的缺陷以及現(xiàn)有PCR技術(shù)對儀器要求較高的不足，從而提供一種快速簡便，靈敏度更高的，并且適用于基層單位采用的檢測肉中沙門氏菌的方法及檢測試劑盒。
`[0004]本發(fā)明技術(shù)方案如下:一種快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒，由Bst DNA聚合酶、LAMP擴增反應(yīng)體系，陰性對照液和陽性對照液組成，其特征在于，LAMP擴增反應(yīng)體系含有以下兩組引物組中的任一一組:
[0005](I)上游內(nèi)引物 FIP:5，-gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3，；
[0006]下游內(nèi)引物 BIP:5，-ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3’ ；
[0007]上游外引物F3:5，-ggcgatattggtgtttatgggg-3’ ；
[0008]下游外引物B3:5’ -aacgataaactggaccacgg-3’ ；
[0009](2)上游內(nèi)引物 FIP:5，-cccagatccccgcattgttgatttttccgccccatattatcgctat-3，；
[0010]下游內(nèi)引物 BIP:5，-gaccatcaccaatggtcagcattttattggcggtatttcggtggg-3，；
[0011]上游外引物F3:5’ -gttcaacagctgcgtcatga-3’ ；
[0012]下游外引物B3:5’ -cgctattgccggcatcatta-3’。
[0013]進一步地，引物組的選擇對于檢出限至關(guān)重要，優(yōu)選引物組為:[0014]上游內(nèi)引物 FIP:5，-gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3，；
[0015]下游內(nèi)引物BIP:5，-ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3，；
[0016]上游外引物F3:5，-ggcgatattggtgtttatgggg-3’ ；
[0017]下游外引物B3:5， -aacgataaactggaccacgg-3’ 0
[0018]按照體積份數(shù)組成如下:1份8U/yL的Bst DNA聚合酶、24份的LAMP擴增反應(yīng)體系，1份的陰性對照液和1份的陽性對照液。
[0019]所述LAMP擴增反應(yīng)體系由LAMP弓丨物組和擴增反應(yīng)液組成，其中每25 μ L LAMP擴增反應(yīng)體系由 10 μ M F3 和 Β3，40μΜ FIP 和 ΒΙΡ，I X thermopol buffer, IM 甜菜堿，3.5yLdNTP, 6mM MgCl2和I μ L模板DNA組成，其余部分由滅菌雙蒸水補足。
[0020]所述陽性對照液為沙門氏菌標準菌株培養(yǎng)液中提取的基因組DNA溶液，陰性對照液為滅菌雙蒸水。
[0021 ] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述試劑盒快速檢測肉中沙門氏菌的方法。
[0022]所述試劑盒用于檢測肉中沙門氏菌具體步驟如下:
[0023]I)提取待測物DNA -M 25g待檢肉樣置于無菌均質(zhì)袋中，加入225mL生理鹽水，拍打勻漿，提取肉中沙門氏菌的DNA ；
[0024]2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增:以DNA提取物為模板進行LAMP擴增，將除Bst DNA聚合酶以外的LAMP反應(yīng)體系在95°C預(yù)變性5~lOmin，然后迅速置于O~4°C加入Bst DNA聚合酶，65°C酶促反應(yīng)60min，最 后升溫至80°C使酶失活2min ；
[0025]3)電泳檢測:取5yL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在IlOV電壓下電泳40min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
[0026]本發(fā)明快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒中按照體積份數(shù)由1份8U/y L的Bst DNA聚合酶、24份的LAMP擴增反應(yīng)體系，1份的陰性對照液和1份的陽性對照組成。所述LAMP擴增反應(yīng)體系由LAMP引物組和擴增反應(yīng)液組成。其中每25 μ L LAMP擴增反應(yīng)體系由10 μ MF3 和 Β3,40 μ M FIP 和 BIP,I Xthermopol buffer, IM betain, 3.5 μ L dNTP 和 6mM MgCl2,I μ L模板DNA組成，其余部分由滅菌雙蒸水補足。陽性對照為沙門氏菌標準菌株培養(yǎng)液中提取的基因組DNA ;陰性對照為滅菌雙蒸水。
[0027]引物均是針對沙門氏菌的吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白(invA)設(shè)計的，是高度保守的屬特異性基因。LAMP弓丨物組中外引物與內(nèi)引物比例關(guān)系為1:8時擴增效果最好。
[0028]本發(fā)明的有益效果:可以對肉中污染的沙門氏菌進行快速簡便的檢測，無需復(fù)雜的熱循環(huán)儀，普通的水浴鍋就可以滿足溫度的要求。由于LAMP的引物是針對靶基因的6個區(qū)段設(shè)計的，因此特異性很強。從反應(yīng)時間來看，LAMP只需2h就可以得出最終結(jié)果，而傳統(tǒng)方法對陰性樣品的確定需要4h。與同樣是基于核酸檢測的PCR方法相比，檢測靈敏度可以提高100倍，從而具有較高的靈敏度。因此，本發(fā)明為肉中的沙門氏菌的檢測提供了一個快速、靈敏、簡便、高效的新方法，特別是基層實驗室快速初篩沙門氏菌，提供了一個新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1【具體實施方式】實例I檢測結(jié)果電泳圖；
[0030](1，實施例1陽性對照；2，實施例2陽性對照；3，實施例1 ;4，實施例2 ;5，實施例I陰性對照；6，實施例2陰性對照)。
[0031]圖2為【具體實施方式】實施例1靈敏度測試實驗中LAMP擴增的電泳圖；
[0032](M, marker ;1，沙門氏菌濃度 9.8X 107CFU/mL ;2，沙門氏菌濃度 9.8X IO6CFU/HiL ;3，沙門氏菌濃度9.8 X 105CFU/mL ;4，沙門氏菌濃度9.8 X 104CFU/mL ;5，沙門氏菌濃度9.8X103CFU/mL ;6，沙門氏菌濃度 9.8 X 102CFU/mL ;7，沙門氏菌濃度 9.8 X IO1CFUZmL ;8，沙門氏菌濃度9.8X 10°CFU/mL ;9，沙門氏菌濃度9.8X K^CFU/mL ；10,陰性對照)。
[0033]圖3為【具體實施方式】實施例1靈敏度測試實驗中PCR擴增的電泳圖；
[0034](M, marker ;1，沙門氏菌濃度 9.8X 107CFU/mL ;2，沙門氏菌濃度 9.8X IO6CFU/HiL ;3，沙門氏菌濃度9.8 X 105CFU/mL ;4，沙門氏菌濃度9.8 X 104CFU/mL ;5，沙門氏菌濃度9.8X103CFU/mL ;6，沙門氏菌濃度 9.8 X 102CFU/mL ;7，沙門氏菌濃度 9.8 X IO1CFUZmL ;8，沙門氏菌濃度9.8X 10°CFU/mL ;9，沙門氏菌濃度9.8X K^CFU/mL ；10,陰性對照)。
【具體實施方式】
[0035]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面結(jié)合實施例說明。
[0036]實施例1
[0037]1.采用細菌基因組試劑盒提取待檢肉樣中的沙門氏菌DNA
[0038]2、以提取物作為模板進行LAMP擴增,反應(yīng)體系為25 μ L
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測肉中沙門氏菌的試劑盒，由Bst DNA聚合酶、LAMP擴增反應(yīng)體系，陰性對照液和陽性對照液組成，其特征在于，LAMP擴增反應(yīng)體系含有以下兩組引物組中的任一一組:
(1)上游內(nèi)弓丨物FIP:5’ -gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3’ ；
下游內(nèi)弓丨物 BIP:5，-ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3> ； 上游外引物 F3:5，-ggcgatattggtgtttatgggg-3’ ； 下游外引物 B3:5，-aacgataaactggaccacgg-3，； (2)上游內(nèi)引物FIP:5，-cccagatccccgcattgttgatttttccgccccatattatcgctat-3’ ； 下游內(nèi)引物 BIP:5’ -gaccatcaccaatggtcagcattttattggcggtatttcggtggg-3> ； 上游外引物 F3:5，-gttcaacagctgcgtcatga-3，； 下游外引物 B3:5，-cgctattgccggcatcatta-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述引物組為:
上游內(nèi)引 物 FIP:5’ -gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3> ；
下游內(nèi)弓丨物 BIP:5，-ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3> ； 上游外引物 F3:5，-ggcgatattggtgtttatgggg-3’ ； 下游外引物 B3:5，-aacgataaactggaccacgg-3? ?
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，按照體積份數(shù)組成如下:1份SU/μL的Bst DNA聚合酶、24份的LAMP擴增反應(yīng)體系，1份的陰性對照液和1份的陽性對照液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP擴增反應(yīng)體系由LAMP引物組和擴增反應(yīng)液組成，其中每25 μ L LAMP擴增反應(yīng)體系由10 μ M F3和Β3，40μΜ FIP和ΒΙΡ，I X thermopol buffer, IM 舌甘菜喊,3.5 μ L dNTP, 6mM MgCl2 和 I μ L 模板 DNA 組成，其余部分由滅菌雙蒸水補足。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述陽性對照液為沙門氏菌標準菌株培養(yǎng)液中提取的基因組DNA溶液，陰性對照液為滅菌雙蒸水。
6.權(quán)利要求1所述試劑盒用于檢測肉中沙門氏菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，步驟如下: 1)提取待測物DNA:取25g待檢肉樣置于無菌均質(zhì)袋中，加入225mL生理鹽水，拍打勻漿，提取肉中沙門氏菌的DNA ； 2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增:以DNA提取物為模板進行LAMP擴增，將除BstDNA聚合酶以外的LAMP反應(yīng)體系在95°C預(yù)變性5~lOmin，然后迅速置于O~4°C加入Bst DNA聚合酶，65°C酶促反應(yīng)60min，最后升溫至80°C使酶失活2min ； 3)電泳檢測:取5μ L擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在IlOV電壓下電泳40min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
【文檔編號】C12Q1/10GK103627811SQ201310673844
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】姜毓君, 滿朝新, 龐心怡, 周文琦, 趙玥明 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學