格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，涉及用于分子生物學和醫(yī)學的檢測試劑盒。包括BCR-ABL基因PCR反應液、Taq酶、對照品、配套的多重PCR擴增程序和包裝物。通過檢測格列衛(wèi)藥物靶向位點BCR-ABL融合基因存在與否來幫助胃腸道間質(zhì)瘤選擇合適藥物并評估個體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效，可應用于胃腸道間質(zhì)瘤的臨床輔助用藥的選擇和預后判斷等多個領域。
【專利說明】格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑
合
Sl
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及用于分子生物學和醫(yī)學的檢測試劑盒，尤其是涉及一種格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]胃腸道間質(zhì)瘤(胃腸道間質(zhì)瘤的英文全稱為gastrointestinal stromal tumors,英文縮寫為GIST)起源于胃腸道間葉組織的腫瘤，是一種發(fā)生于消化道的少見腫瘤，于 I983 年首次提出。(Mazur MT, Clark HB.Gastric stromal tumors.Reappraisal ofhistogenesis [J].Am J Surg Patholl983; 7:507-519)。GIST 占胃腸道惡性腫瘤的 1% ~3%，估計年發(fā)病率約為(10~20)/100萬，且20%~30%是惡性的。但隨著分子生物學的迅速發(fā)展，GIST的診斷以及治療也取得了巨大進展。尤其是目前治療腫瘤的靶向藥物，針對特異性靶點進行治療，從而避免對正常細胞的傷害，取得高效低副作用的治療模式，在市場上占據(jù)了重要份額。
[0003]靶向藥物伊馬替尼，商品名為格列衛(wèi)，其活性成分為甲磺酸伊馬替尼，是由諾華公司開發(fā)研制的第一個上市并用于臨床的酪氨酸激酶抑制劑。它被FDA批準用于治療慢性粒細胞白血病及胃腸道間質(zhì)瘤，它的主要作用是能選擇性的結合于某些相關的酪氨酸激酶受體，阻止磷酸基團從三磷酸腺苷向蛋白質(zhì)底物的轉移，使之不能催化底物酪氨酸殘基的磷酸化而激活下游效應分 子的信號轉導，從而抑制細胞增殖而誘導細胞凋亡(JABB0UR
E,CORTES J E, GHANEM H，et al.Targeted therapy in chronic myeloid leukemia[J].Expert review of anticancer therapy, 2008，8 (I):99-110.)。這些酪氨酸激酶包括BCR - ABL, TEL-ABL, ETV6-ABL、C-KIT等，它們胞外區(qū)是配體結合結構域，配體是可溶性或膜結合的多肽或蛋白類激素，包括胰島素和多種生長因子，胞內(nèi)段是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，并具有自磷酸化位點。磷酸化的酪氨酸部位立即成為細胞內(nèi)信號蛋白的結合位點，不同的細胞內(nèi)信號蛋白和受體尾部磷酸化部位結合后被激活。信號復合物通過幾種不同的信號轉導途徑，擴大信息，激活細胞內(nèi)一系列的生化反應；或者將不同的信息綜合起來引起細胞的綜合性應答，如細胞增殖等。
[0004]伊馬替尼最早即是抑制BCR - ABL酪氨酸激酶功能，用以治療不同病期的慢性粒細胞白血病患者，以慢性期療效最好，加速期和急變期的療效明顯較慢性期差。臨床數(shù)據(jù)顯示出較好的治療效果，具有完全的血液學緩解率，大約95%~98%，完全的細胞遺傳學緩解率，在慢性期時達到80%~90%，僅有10%慢性期病例能達到分子水平緩解(DEININGERM, BUCHDUNGER E, DRUKER B J.The development of imatinib as a therapeutic agentfor chronic myeloid leukemia[J] ? Blood, 2005，105 (7): 2640-2653.)。而在 2000 年，有研究報道了第I例格列衛(wèi)應用治療不能切除的GIST病患，表明不論是在臨床上還是組織學上都有明顯的的療效。另有研究應用格列衛(wèi)治療147例進展階段的GIST患者，認為甲磺酸伊馬替尼是有效的和安全的，其中54%的患者病情得到緩解，28%的患者病情穩(wěn)定，隨訪9個月未發(fā)現(xiàn)難以治療和控制的毒副作用。由于格列衛(wèi)在治療GIST的顯著作用，一些無法切除的晚期GIST患者，在應用其進行新輔助化療后，使得手術切除成為可能(DEMETRI G D, vonMEHREN M, BLANKE C D, et al.Efficacy and safety of imatinib mesylate in advancedgastrointestinal stronmal tumors [J].N Engl J Med, 2002，347 (7): 472-480.)。有研究者對126例不能切除(包括技術的原因和病人全身狀況的原因)的c-KIT呈陽性的GIST患者進行研究，其中16例病人在應用格列衛(wèi)治療后行完整的腫瘤切除術。另I例應用格列衛(wèi)輔助化療的GIST病例也取得了成功，此病例為一巨大(35cm)下腹部腫瘤，伴有肝內(nèi)和腸系膜轉移，因無法切除而應用格列衛(wèi)治療，用藥12周后腫瘤自35cm縮小至18cm，肝內(nèi)轉移灶轉為囊性病灶，原發(fā)腫瘤和腸系膜多發(fā)轉移灶隨后被完全切除(SCAIFE C L, HUNT K K，PATELS R, et al.1s there a role for surgery in patients with imatinib mesylate[J].AmJSury, 2003，186(6):665-669.)。
[0005]由BCR-ABL編碼出的融合蛋白作為一種具有持續(xù)活性酪氨酸激酶，參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，例如干擾有絲分裂原蛋白激酶通路而上調(diào)細胞增殖，干擾磷酸肌醇3 -激酶/蛋白激酶B通路導致凋亡減少，最終影響細胞的正常工作(MELO JV，DEININGER M W.Biology of chronic myelogenous leukemia—signaling pathwaysof initiation and transformation[J].Hematology/oncology clinics of NorthAmerica, 2004, 18(3):545-568.)。可見它在GIST以及慢性粒細胞白血病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，且作為靶向藥物格列衛(wèi)的特異性靶點，它的存在對于GIST的治療選擇以及使用格列衛(wèi)治療后的療效評價都具有重要意義，鑒于對于疾病的診斷、預后、療效評價等上的臨床價值，融合基因檢測技術的開發(fā)不得不說具有很大的市場價值以及臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的 在于提供一種格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒。
[0007]本發(fā)明的目的之二在于提供一種配套的PCR擴增程序。
[0008]所述格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，包括BCR-ABL基因PCR反應液、Taq酶、對照品、配套的多重PCR擴增程序和包裝物；
[0009]所述BCR-ABL基因PCR反應液由PCR反應緩沖液、2條BCR-ABL基因特異性上游引物、I條BCR-ABL基因特異性下游引物組成；BCR基因上游引物Fl序列為:5，-TTTGAGGATTGCGGAGGC-3，, F2 序列為 5’ -GGAGCAGCAGAAGAAGTGTT-3’，ABL 某閔下游引物R 序列為:5，-GGTCCAGCGAGAAGGTTT-3，；
[0010]所述PCR 反應緩沖液由 Tris-HCl 10mM、KC150mM、MgCl20.2mM 和 dNTPs0.2mM 組成，所述Tris-HCl 的 pH為 8.3 ;*PCR反應緩沖液由 IOOmM Tris-HCl, 500mM KCl,25mM MgCl2,25mM dNTPs 組成，所述 Tris-HCl 的 pH 為 8.8。
[0011]所用引物濃度可為10 PM，所述Taq酶的每次反應用量為IU。
[0012]所述PCR的擴增程序為:第一階段:95°C Iminl個循環(huán)；第二階段:95°C 30s, 66~61 °C 30s (每個循環(huán)降低 1°C)，72°C 20s，5 個循環(huán)；第三階段 95°C 30s，61°C 30s, 72°C 20s，25個循環(huán)；其中第二階段用于富集特異產(chǎn)物，第三階段用于擴增。
[0013]本發(fā)明通過檢測格列衛(wèi)藥物靶向位點BCR-ABL融合基因存在與否來幫助胃腸道間質(zhì)瘤選擇合適藥物并評估個體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效，可應用于胃腸道間質(zhì)瘤的臨床輔助用藥的選擇和預后判斷等多個領域，有助于選擇格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤并評價其療效，既快速、準確，又經(jīng)濟、價廉。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒中提供的BCR-ABL對照品、無模板對照品的色譜圖。圖中數(shù)字I表示BCR-ABL對照品結果，2表示無模板對照品結果。
【具體實施方式】
[0015]以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0016]實施例格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒的使用
[0017]I制備包括下列組成成分的試劑盒:BCR_ABL基因PCR反應液(1200 ii L) I管、Taq酶系(30ii L) I管、對照品(300ii L) I管。
[0018]2樣本的采集、保存和運輸:
[0019]2.1使用樣本類型:新鮮血液。
[0020]2.2樣本采集、保存和運輸:用抗凝管搜集新鮮血液后立即進行RNA抽提，或者提取白細胞放入液氮冷凍并保存于_80°C。樣本長途運送采用干冰。
[0021]3、核酸抽提:
[0022]建議利用MagCore Compact核酸抽提儀，按照其配套全血RNA抽提試劑盒(MRN-Ol)的說明書操作，最終每400 ii L血液樣本中可獲得洗脫體積為200 ii L的RNA樣品，之后立即進行逆轉錄。
[0023]4、逆轉錄:
[0024]建議使用QIAGEN QuantiTect ? Reverse Transcription 試劑盒。按照說明書進行操作。
[0025]5、多重 RT-PCR 檢測:
[0026]5.1試劑準備:按比例吸取相應量的BCR-ABL基因PCR反應液、Taq酶系(BCR-ABL基因PCR反應液19.8 u L/人份+Taq酶0.2 y L/人份)，充分混勻后按20 U L/人份分裝入PCR反應管，備用。
[0027]5.2加樣:分別向BCR-ABL基因PCR反應管加入5 ii L逆轉錄后的cDNA樣本，同時向BCR-ABL基因PCR反應管加入5 u L對照品樣本作為對照品，向BCR-ABL基因PCR反應管加入5iiL雙蒸水作為NTC。
[0028]5.3 編輯:在 Thermal Profile Setup 窗口編輯反應程序:第一階段:95°C Iminl個循環(huán)；第二階段:95°C 30s, 66~61 °C 30s (每個循環(huán)降低1°C)，72°C 20s，5個循環(huán)；第三階段95°C 30s,61°C 30s, 72°C 20s，25個循環(huán)；其中第二階段用于富集特異產(chǎn)物，第三階段用于擴增。所有設置完成后保存文件，運行。
[0029]5.4結果檢測:反應結束后，將PCR產(chǎn)物(上樣體積0.5 ii L以上)放于毛細管電泳儀內(nèi)，自動進行電泳結果檢測。檢測結束后打開分析窗口，選擇樣本孔，自動分析結果。將結果與試劑盒使用說明書提供的對照品色譜圖(見圖1)進行對比，樣本色譜圖中若出現(xiàn)與BCR-ABL對照品色譜圖相對應的峰值413bp、215bp、290bp，則建議選擇格列衛(wèi)藥物治療胃腸道間質(zhì)瘤。`
【權利要求】
1.格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，其特征在于包括BCR-ABL基因PCR反應液、Taq酶、對照品、配套的多重PCR擴增程序和包裝物； 所述BCR-ABL基因PCR反應液由PCR反應緩沖液、2條BCR-ABL基因特異性上游引物、I條BCR-ABL基因特異性下游引物組成；BCR基因上游引物Fl序列為:5，-TTTGAGGATTGCGGAGGC-3，, F2 序列為 5’ -GGAGCAGCAGAAGAAGTGTT-3’，ABL 某閔下游引物R 序列為:5，-GGTCCAGCGAGAAGGTTT-3，。
2.如權利要求1所述格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，其特征在于所述PCR反應緩沖液由Tris-HCl 10mM、KC150mM、MgCl20.2mM和dNTPs0.2mM組成，所述 Tris-HCl 的 pH 為 8.3。
3.如權利要求1所述格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，其特征在于所述 PCR 反應緩沖液由 IOOmM Tris-HCl, 500mM KCl,25mM MgCl2, 25mM dNTPs 組成，所述Tris-HCl的pH為8.8。
4.如權利要求1所述格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，其特征在于所用引物濃度為10 PM。
5.如權利要求1所述格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，其特征在于所述Taq酶的每次反應用量為1U。
6.如權利要求1所述格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤的用藥選擇及療效檢測試劑盒，其特征在于所述PCR的擴增程序為:第一階段:95°C Iminl個循環(huán)；第二階段:95°C 30s, 66~61。。30s，每個循環(huán)降低 10C, 720C 20s，5 個循環(huán);第三階段 95°C 30s，61。。30s, 72°C 20s, 25個循環(huán)；其中第二階段用于富`集特異產(chǎn)物，第三階段用于擴增。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627809SQ201310673737
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權日:2013年12月11日
【發(fā)明者】曾驥孟, 林輝暖, 呂曉楠, 劉祝君 申請人:廈門大學