一種團頭魴肌間骨總rna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取團頭魴肌間骨總RNA的方法，其步驟：1）以團頭魴為材料：取其肌間骨置于滅菌預(yù)冷的研缽中，研磨，至肌間骨研磨至粉末狀后轉(zhuǎn)入離心管中，加Trizol搖勻，室溫放置；2）4℃，離心，取上清液，加入1/5體積的氯仿，搖晃，充分乳化為無分層的均勻白色乳液，室溫放置；3）4℃，離心，取上清液用氯仿重復(fù)抽提；4）取上清液，加入等體積的異丙醇、檸檬酸鈉、氯化鈉混勻，-20℃靜置；5）靜置后，4℃，離心，棄上清液留沉淀，加DEPC水配置的乙醇，震蕩，重復(fù)洗滌沉淀；6）4℃，離心，棄上清液留沉淀，自然晾干，加DEPC水溶解RNA，得總RNA溶液。過程簡單，成本低，獲得總RNA濃度高、純度高、完整性好，滿足進一步分子生物學(xué)研究。
【專利說明】—種團頭魴肌間骨總RNA提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種魚類骨骼總RNA的提取方法，具體來說是一種適用于團頭魴肌間骨總RNA提取的方法。本方法也適用于其它魚類肌間骨總RNA的提取，提取的總RNA可用于進一步分子生物學(xué)的cDNA合成和基因表達研究。
【背景技術(shù)】
[0002]魚肉因為營養(yǎng)成分含量高，脂肪含量低，易于消化，適于一般人群食用而越來越受到人們的青睞。團頭鮮(Megalobramaamblycephala)隸屬于鯉形目,鯉科
,舶亞科(Cidterinae),舫屬(Megalobrama)。是我國特有的重要草食性經(jīng)濟魚類之一，由于其食性廣、成本低、生長快、成活率高、易捕撈，且具有味美、頭小、含肉率高、體形好、規(guī)格適中等優(yōu)點，因而被作為優(yōu)良的草食性魚類品種在全國普遍推廣。團頭魴從養(yǎng)殖推廣至今，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，居我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的第六位，成為了國內(nèi)淡水養(yǎng)殖的后起之秀和市場上的暢銷魚類。但是團頭魴肌間骨的存在，對團頭魴的加工與食用造成了很大的不利影響，所以研究團頭魴肌間骨發(fā)生的分子機制，進而培育無肌間骨的團頭魴具有重大意義。
[0003]魚類的肌間骨(intermuscular bone)也稱肌間刺,位于肌節(jié)之間，是由肌膈結(jié)締組織連續(xù)同源骨化而來的膜骨 。進行肌間骨基因表達研究的Northern blot、cDNA克隆、RT-PCR等，都需要以提取肌間骨總RNA為基礎(chǔ)。肌間骨形態(tài)多樣，分布于肌肉間，不易于采樣；體積小，相對表面積大，采樣過程中RNA易降解；附著肌肉不易除去，易導(dǎo)致蛋白污染等。諸多因素造成了提取團頭魴肌間骨總RNA的困難。
[0004]目前，從骨組織中提取總RNA的方法并不多見。從體積小、易降解、易受肌肉蛋白污染的肌間骨中提取總RNA的方法更是尚未出現(xiàn)。用傳統(tǒng)方法提取的肌間骨總RNA量少，污染高，無法支持進一步的分子實驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是在于提供一種團頭魴肌間骨總RNA的提取方法。本方法首次特異性針對團頭魴肌間骨組織總RNA提取的困難性，提供了一種實施過程簡單，無需多種儀器設(shè)備，成本低，獲得的總RNA濃度高、純度高、完整性好，可以滿足進一步分子生物學(xué)研究的方法。本方法所使用的試劑除Trizol外，都是用實驗室常用藥品配制而成；所用儀器僅有離心機與無菌操作臺；所用工具為基本的分子實驗工具與解剖器材。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施:
一種團頭魴肌間骨總RNA提取方法，其步驟是:
O以團頭魴為材料:采用200-300g團頭魴，為防止血液對肌間骨的污染，采用無菌注射器從團頭魴尾靜脈抽取1.5-2.0ml血液，死亡后l_2min取其肌間骨置于滅菌預(yù)冷的研缽中，后邊加液氮邊研磨，至肌間骨研磨至粉末狀后轉(zhuǎn)入2ml離心管中，每50mg肌間骨粉末加ImlTrizol，搖勻，室溫(20 — 25°C，以下相同)放置4 — 6min ；2)4°C, 12000rpm離心4 — 6min,取上清液,加入1/5體積的氯仿,劇烈搖晃15sec,充分乳化為無分層的均勻白色乳液，室溫放置4 - 6min ； 3)4°C, 12000rpm離心14_16min,取上清液用氯仿重復(fù)抽提I 一 2次；
4)取上清液，加入等體積的異丙醇、200μ I檸檬酸鈉(0.8mol/L)、200y I氯化鈉(1.2mol/L)充分混勻，-20°C靜置3 — 5小時；
5)靜置過后，4°C，12000rpm離心9-llmin，棄上清液留沉淀，加DEPC水配置的75%(體積比)乙醇，溫和震蕩，重復(fù)洗滌沉淀I 一 3次；
6)4°C，7500rpm離心4一 6min，棄上清液留沉淀，自然晾干，加30 μ IDEPC水溶解RNA，既得總RNA溶液。
[0007]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果: 從肌間骨中直接提取總RNA能更有針對性的研究肌間骨相關(guān)基因的表達情況，但特異性針對魚類肌間骨總RNA的提取方法之前尚未出現(xiàn)。由于肌間骨組織中蛋白多糖含量高，用傳統(tǒng)裂解法提取的肌間骨總RNA降解高，蛋白殘留高。對于這些問題，本發(fā)明針對性的作出了解決，通過將肌間骨迅速與肌肉分離并置于液氮研磨中充分研磨，使得骨細(xì)胞充分暴露，后加入Trizol，其中含有的異硫氰酸胍有防止RNA酶發(fā)揮作用的功能，又能使細(xì)胞迅速破裂，抑制核酸酶的釋放。重復(fù)使用氯仿抽提保證了 RNA的純度和完整性。在使用異丙醇將RNA沉淀出來的同時，加入高濃度的鹽溶液，使得蛋白多糖溶解析出，降低了蛋白殘留。
[0008]對所提取的RNA進行濃度檢測、瓊脂糖凝膠電泳、反轉(zhuǎn)錄PCR檢驗，得出該方法提取的肌間骨總RNA濃度高、純度高、完整性好，可以滿足進一步的分子生物學(xué)研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為一種提取的團頭魴肌間骨總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
[0010]圖2為一種團頭魴肌間骨總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板對特定基因PCR擴增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
[0011]圖中條帶I為cDNA模板對團頭魴內(nèi)參β-actin基因PCR擴增結(jié)果的電泳圖；條帶II為cDNA模板對團頭鮮Ras homo log gene family member Ab基因PCR擴增結(jié)果的電泳圖；條帶 III 為 cDNA 模板對團頭鮮 transforming growth factor β -2-like 基因 PCR擴增結(jié)果的電泳圖。
【具體實施方式】
[0012]實施例1:
一種團頭魴肌間骨總RNA提取方法，其步驟是:
1)取樣，以團頭魴為材料:隨機挑選200-300g的團頭魴樣本魚三條，為防止血液對肌間骨的污染，采用無菌注射器從團頭魴尾靜脈抽取1.5-2.0ml血液，死亡后l-2min從魚體肌肉中分離肌間骨并剔凈肌肉組織，立即置于滅菌預(yù)冷的研缽中，依次在滅菌預(yù)冷的研缽中邊加液氮邊研磨，至研磨成粉末狀。每條魚取50mg肌間骨粉末，分別放進預(yù)先裝有ImlTrizol的2ml滅菌離心管,搖勻，室溫放置4或5或6min ；
2)將放置后的離心管在4°C，12000rpm離心5min后，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另外一支2ml滅菌離心管，加入上清液1/5體積的氯仿，劇烈搖晃15sec，使混合液充分乳化為無分層的均勻白色乳液，室溫放置4或5或6min ；
3)將離心管在4°C，12000rpm離心14或15或16min，取上清液重復(fù)抽提I或2或3次；
4)抽提結(jié)束后再次取上清液轉(zhuǎn)移至另外一支2ml離心管，加入等體積的異丙醇、200 μ 1檸檬酸鈉(0.8mol/L)、200μ1氯化鈉(1.2mol/L)，輕搖離心管充分混勻，_20°C靜置4小時；
5)靜置過后，將離心管4°C，12000rpm離心9或10或llmin，棄掉上清液留沉淀，向離心管中加DEPC水配置的75% (體積比)乙醇，溫和震蕩，充分洗滌；
6)將沉淀重復(fù)洗漆I或2或3次；
7)最后一次洗滌后，將離心管4°C，7500rpm離心4或5或6min，棄掉上清液留沉淀。在沉淀物自然晾干后，加30 μ 1 DEPC水溶解RNA，即得總RNA溶液；
8)取少量總RNA溶液用于濃度檢測，其余_80°C保存，留待后續(xù)實驗。
[0013]團頭魴肌間骨總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1。
[0014]團頭魴肌間骨總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板對特定基因PCR擴增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2。條帶I為cDNA模板對團頭魴內(nèi)參β-actin基因PCR擴增結(jié)果的電泳圖；條帶II為cDNA模板對團頭鮮Ras homo log gene family member Ab基因PCR擴增結(jié)果的電泳圖；條帶III為cDNA模板對團頭鮮transforming growth factor β -2-like基因PCR擴增結(jié)果的電泳圖。
[0015]本方法中三條樣本魚提取的肌間骨總RNA濃度依次為452.9ng/μ 1、370.5 ng/μ 1,470.1 ng/μ l，0D260/280值均大于2.00，并且，后續(xù)檢測實驗結(jié)果良好，完全達到提取肌間骨總RNA的要求。
【權(quán)利要求】
1.一種團頭魴肌間骨總RNA提取方法，其步驟是: 1)以團頭魴為材料:取其肌間骨置于滅菌預(yù)冷的研缽中，后邊加液氮邊研磨，至肌間骨研磨至粉末狀后轉(zhuǎn)入2ml離心管中，每50mg肌間骨粉末加ImlTrizol，搖勻，室溫放置4 一6min ； 2)4°C, 12000rpm離心4 一 6min，取上清液，加入1/5體積的氯仿，搖晃15sec，充分乳化為無分層的均勻白色乳液，室溫放置4 - 6min ； 3)4°C, 12000rpm離心15min,取上清液用氯仿重復(fù)抽提I 一 2次； 4)取上清液，加入等體積的異丙醇、200μ 10.811101/1檸檬酸鈉、20(^11.2mol/L氯化鈉，充分混勻，_20°C靜置3 — 5小時； 5)靜置過后，4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清液留沉淀，加DEPC水配置的75%體積比乙醇，溫和震蕩，重復(fù)洗滌沉淀I 一 3次； 6)4°C，7500rpm離心4一 6min，棄上清液留沉淀，自然晾干，加30 μ IDEPC水溶解RNA，得總RNA溶液。
【文檔編號】C12N15/10GK103642797SQ201310673534
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】高澤霞, 萬世明, 易少奎, 鐘嘉, 王衛(wèi)民 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)