含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體，所述綠色熒光蛋白基因為sfGFP基因，所述sfGFP基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。還涉及一種含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法以及所述含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體在陽性克隆子篩選上的應(yīng)用。本發(fā)明利用了sfGFP能在各種條件下完成超折疊并發(fā)光的特性，其發(fā)光能力和發(fā)光強度優(yōu)勢明顯強于普通GFP、EGFP等蛋白，為EGFP的1.6倍，肉眼即可觀察到明顯的綠色熒光，因此可以方便蛋白表達(dá)克隆過程中陽性克隆子的篩選，有利于快速、準(zhǔn)確的對陽性克隆子進(jìn)行篩選。
【專利說明】含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]綠色熒光蛋白，分子質(zhì)量約為28kDa，由238個氨基酸構(gòu)成，第65_67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，經(jīng)共價鍵連接而成為羥苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激發(fā)產(chǎn)生熒光，是主要發(fā)光的位置。綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個桶，發(fā)光的基團(tuán)位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一個裝有色素的“油漆桶”。其發(fā)光團(tuán)的形成不具有專一性，發(fā)出的熒光穩(wěn)定 ，且不需要依賴其他基質(zhì)而發(fā)光。
[0003]綠色熒光蛋白(GFP)在生物學(xué)領(lǐng)域中常被用作報導(dǎo)基因，是一種理想的示蹤標(biāo)記，已經(jīng)在生物技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因動物、環(huán)境工程、微生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。利用綠色突光蛋白特有的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白標(biāo)簽(protein tagging),就是利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化至合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，而后借助熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活體中標(biāo)記的蛋白質(zhì)。因為GFP只有238個氨基酸，相對較小，所以將其與其他蛋白融合后不影響其自身的發(fā)光功能，利用GFP的這一特性，已經(jīng)加深了對細(xì)胞內(nèi)一些過程的了解，如發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、染色體復(fù)制和分裂等。利用GFP來檢測目標(biāo)蛋白的定位提供了一種對細(xì)胞內(nèi)生理過程進(jìn)行觀察的新方法。
[0004]鑒于綠色熒光蛋白可以作為報告基因，且在生物技術(shù)中被廣泛應(yīng)用，但現(xiàn)有的帶有目的蛋白基因片段的表達(dá)載體在應(yīng)用中需要經(jīng)過挑取菌落和基因測序步驟來確定是否為正確的陽性克隆子，需要進(jìn)行大量的盲目挑斑以及PCR鑒定的工作，費時費力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種帶有綠色熒光蛋白的表達(dá)載體及該表達(dá)載體的制備方法。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]一種含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體，所述綠色熒光蛋白基因為SfGFP基因，所述sfGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]一種含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0009]合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sfGFP基因；
[0010]合成帶有酶切位點的引物，并在此引物的引導(dǎo)下，以核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的sfGFP基因為模板進(jìn)行PCR擴增，得到帶有酶切位點的核苷酸序列；
[0011]將空載質(zhì)粒以及所述PCR擴增得到的帶有酶切位點的核苷酸序列分別進(jìn)行雙酶切并回收酶切后片段，用DNA連接酶連接酶切后片段，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌；
[0012]用含有與空載質(zhì)粒中抗性基因相對應(yīng)的抗生素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑取發(fā)綠色熒光的克隆子檢測載體序列，通過基因測序檢測正確的載體即為所述的含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體。
[0013]在上述技術(shù)方案中，所述空載質(zhì)粒為pET_28a(+)或pGEX_6P_l。
[0014]在上述技術(shù)方案中，所述大腸桿菌為大腸桿菌RosettaBlue (DE3)。
[0015]以上所述含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體在陽性克隆子篩選上的應(yīng)用，步驟如下:
[0016]合成目的基因；
[0017]合成帶有酶切位點的引物，并在此引物的引導(dǎo)下，以合成的目的基因序列為模板，進(jìn)行PCR擴增得到帶有酶切位點的目的核苷酸序列；
[0018]將所述的表達(dá)載體和PCR擴增得到帶有酶切位點的目的基因序列分別進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段，用DNA連接酶連接酶切后的表達(dá)載體片段和目的基因片段，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用含有與權(quán)利要求1中所述的表達(dá)載體具有的抗性基因相對應(yīng)的抗生素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑取不發(fā)光的斑，即為帶有目的基因序列的克隆子。
[0019]本發(fā)明利用了 Superfolder GFP (sfGFP)能在各種條件下完成超折疊并發(fā)光的特性，其發(fā)光能力和發(fā)光強度優(yōu)勢明顯強于普通GFP、EGFP等蛋白，為EGFP的1.6倍，肉眼即可觀察到明顯的綠色熒光，因此可以方便蛋白表達(dá)克隆過程中陽性克隆子的篩選，有利于快速、準(zhǔn)確的對陽性克隆子進(jìn)行篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實施例提供的pET_28a(+)-sfGFP表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021]圖2為本發(fā)明實施例提供的pGEX-6P-l_sfGFP表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖3為本發(fā)明實施例提供的利用pET_28a (+) -sfGFP表達(dá)載體構(gòu)建的pET-28a (+) - β 2M載體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]圖4為本發(fā)明利用pGEX-6P-l_sfGFP表達(dá)載體構(gòu)建pGEX_6P_l- β 2Μ載體結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0025]實施例一
[0026]含有sfGFP基因的表達(dá)載體pET_28a (+) -sfGFP的構(gòu)建
[0027]①質(zhì)粒pET_28a(+)的準(zhǔn)備
[0028]將含有質(zhì)粒pET_28a(+)的大腸桿菌在LB (含卡那霉素50mg/L)固體培養(yǎng)基上在37°C條件下培養(yǎng)12小時。從培養(yǎng)基中挑取含有質(zhì)粒pET-28a(+)的大腸桿菌單菌落，并將其轉(zhuǎn)入LB (含卡那霉素50mg/L)液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為250rpm的搖床上在37 °C條件下，懸浮培養(yǎng)12小時。最后用Sangon公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET_28a(+)，并將獲得的質(zhì)粒保存在_20°C條件下備用。
[0029]②構(gòu)建含有sfGFP基因的表達(dá)載體pET_28a (+) -sfGFP
[0030]I)合成 SEQ ID NO:1 的 sfGFP 基因序列；
[0031 ] 2 )在引物 1: 5’ ACGCGTCGACTGATGTCCAAAGGAGAAGAGC3’
[0032]引物 2: 5，ATGCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGT3’[0033]的引導(dǎo)下，以SEQ ID NO:1的sfGFP基因序列為模板進(jìn)行PCR，擴增得到SEQ IDN0:2的帶有Sal I和Not I的核苷酸序列，50yL PCR擴增體系包括5 μ LlO X Buffer，2mmol/L Mg2+，200 μ mol/LdNTPs，200nmol/L 正、反向引物，Ing sfGFP 質(zhì)粒，2.5U KOD TagDNA聚合酶。35次循環(huán)的PCR程序為94°C /30S(第一次循環(huán)為5min)，55°C /30s，72°C /20s(最后一次循環(huán)為5min)。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析并回收純化。
[0034]3)將質(zhì)粒pET_28a(+)用Sal I和Not I進(jìn)行雙酶切。50 μ L酶切反應(yīng)體系含pET-28a(+) 10ug、10XBuffer4(NEB)5y L、Sal I 和 Not I 各 20U，用水補足至 50 μ L，37°C酶切4h后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用刀片將大片段切下，用TaKaRa公司的AgaroseGel DNA Purification kit 進(jìn)行回收純化。
[0035]4)將2)步得到的純化的PCR產(chǎn)物用Sal I和Not I進(jìn)行雙酶切。50 μ L酶切反應(yīng)體系含2)?0?產(chǎn)物101^、10父8肛€6『4 (NEB) 5 μ L, Sal I和Not I各20U，用水補足至50 μ L，37°C酶切4h后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用刀片將大片段切下，用TaKaRa公司的 Agarose Gel DNA Purification kit 進(jìn)行回收純化。
[0036]5)將3)步得到的產(chǎn)物與4)步得到的產(chǎn)物在16°C條件下以T4DNA連接酶連接反應(yīng)12小時，將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌RosettaBlue (DE3)，在LB (含卡那霉素50mg/L，0.2%乳糖)固體培養(yǎng)基上在37°C條件下培養(yǎng)12小時，從固體培養(yǎng)基上挑取發(fā)黃綠色光的單菌落，并通過基因測序鑒定其質(zhì)粒構(gòu)建的正確性，將正確的陽性克隆子保存、備用。
[0037]實施例二含有sfGFP基因的表達(dá)載體pGEX-6P-l_sfGPF的構(gòu)建
[0038]①質(zhì)粒pGEX-6P-l的準(zhǔn)備
[0039]將含有質(zhì)粒pGEX-6P-l的大腸桿菌在LB (含氨芐青霉素50mg/L)固體培養(yǎng)基上在37°C條件下培養(yǎng)12小時。從培養(yǎng)基中挑取含有質(zhì)粒PGEX-6P-1的大腸桿菌單菌落，并將其轉(zhuǎn)入LB (含氨芐青霉素50mg/L)液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為250rpm的搖床上在37 °C條件下，懸浮培養(yǎng)12小時。最后用Sangon公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pGEX_6P_l，并將獲得的質(zhì)粒保存在_20°C條件下備用。
[0040]②構(gòu)建含有sfGFP基因的表達(dá)載體pGEX-6P-l_sfGFP
[0041]I)合成 SEQ ID NO:1 的 sfGFP 基因序列；
[0042]2 )在引物 1: 5’ ACGCGTCGACTGATGTCCAAAGGAGAAGAGC3’
[0043]引物2:5’ ATGCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGT3’ 的引導(dǎo)下，以 SEQ ID NO:1 的 sfGFP基因序列為模板進(jìn)行PCR，擴增得到SEQ ID NO: 2的帶有Sal I和Not I的核苷酸序列，50 μ L PCR 擴增體系包括 5 μ LlO XBuffer，2mmol/L Mg2+，200 μ mol/LdNTPs，200nmol/L 正、反向引物，Ing sfGFP質(zhì)粒，2.5U KOD Tag DNA聚合酶。35次循環(huán)的PCR程序為94°C/30S(第一次循環(huán)為5min)，55°C/30s，72°C/20s (最后一次循環(huán)為5min)。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析并回收純化。
[0044]3)將質(zhì)粒pGEX-6P-l用Sal I和Not I進(jìn)行雙酶切。50 μ L酶切反應(yīng)體系含pGEX-6P-110ug、10XBuffer4(NEB)5y L、Sal I 和 Not I 各 20U，用水補足至 50μ L，37°C酶切4h后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用刀片將大片段切下，用TaKaRa公司的AgaroseGel DNA Purification kit 進(jìn)行回收純化。
[0045]4)將2)步得到的純化的PCR產(chǎn)物用Sal I和Not I進(jìn)行雙酶切。50 μ L酶切反應(yīng)體系含2)?0?產(chǎn)物101^、10父8肛€6『4 (NEB) 5 μ L, Sal I和Not I各20U，用水補足至50 μ L，37°C酶切4h后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用刀片將大片段切下，用TaKaRa公司的 Agarose Gel DNA Purification kit 進(jìn)行回收純化。
[0046]5)將3)步得到的產(chǎn)物與4)步得到的產(chǎn)物在16°C條件下以T4DNA連接酶連接反應(yīng)12小時，將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌RosettaBlue (DE3)，在LB (含氨芐青霉素50mg/L，0.2%乳糖)固體培養(yǎng)基上，在37°C條件下培養(yǎng)12小時，從固體培養(yǎng)基上挑取發(fā)黃綠色光的單菌落，并通過基因測序鑒定其質(zhì)粒構(gòu)建的正確性，將正確的陽性克隆子保存、備用。
[0047]實施例三利用質(zhì)粒pET_28a (+) -sfGFP構(gòu)建表達(dá)載體pET_28a (+) - β 2M
[0048]①質(zhì)粒pET_28a (+) -sfGFP 的準(zhǔn)備
[0049]將含有質(zhì)粒pET_28a(+)-sfGFP的大腸桿菌在LB(含卡那霉素50mg/L)固體培養(yǎng)基上在37°C條件下培養(yǎng)12小時。從培養(yǎng)基中挑取含有質(zhì)粒pET-28a(+)-sfGFP的大腸桿菌單菌落，并將其轉(zhuǎn)入LB(含卡那霉50mg/L)液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為250rpm的搖床上在37°C條件下，懸浮培養(yǎng)12小時。最后用Sangon公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET_28a (+)-sfGFP，并將獲得的質(zhì)粒保存在_20°C條件下備用。
[0050]②構(gòu)建含有β 2Μ基因的表達(dá)載體pET_28a (+) - β 2M
[0051]I)合成SEQ ID NO: 3的β2Μ基因序列；
[0052]2)在引物
【權(quán)利要求】
1.一種含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體，其特征在于:所述綠色熒光蛋白基因為sfGFP基因，所述sfGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:包括以下步驟: 合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sfGFP基因； 合成帶有酶切位點的引物，并在此引物的引導(dǎo)下，以核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的sfGFP基因為模板進(jìn)行PCR擴增，得到帶有酶切位點的核苷酸序列，帶有酶切位點的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 將空載質(zhì)粒以及所述PCR擴增得到的帶有酶切位點的核苷酸序列分別進(jìn)行雙酶切并回收酶切后片段，用DNA連接酶連接酶切后片段，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌； 用含有與空載質(zhì)粒中抗性基因相對應(yīng)的抗生素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑取發(fā)綠色熒光的克隆子檢測載體序列，通過基因測序檢測正確的載 體即為所述的含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求2所述的含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述空載質(zhì)粒為pET-28 a(+)或pGEX-6P-l。
4.如權(quán)利要求2所述的 含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述大腸桿菌為大腸桿菌RosettaBlue (DE3)。
5.如權(quán)利要求1中所述的表達(dá)載體在陽性克隆子篩選上的應(yīng)用，其特征在于:步驟如 下: 合成目的基因； 合成帶有酶切位點的引物，并在此引物的引導(dǎo)下，以合成的目的基因序列為模板，進(jìn)行PCR擴增得到帶有酶切位點的目的核苷酸序列； 將權(quán)利要求1中所述的表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，然后將酶切得到的質(zhì)粒片段經(jīng)過去磷酸化處理，回收去磷酸化的線性質(zhì)粒片段；將PCR擴增得到的帶有酶切位點的目的基因序列進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段，用DNA連接酶連接去磷酸化的表達(dá)載體片段和目的基因片段，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用含有與權(quán)利要求1中所述的表達(dá)載體具有的抗性基因相對應(yīng)的抗生素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑取不發(fā)光的斑，即為帶有目的基因序列的克隆子。
【文檔編號】C12N15/66GK103667332SQ201310673891
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】華權(quán)高, 馬峰, 易汪雪, 沈鶴霄, 余文祥, 黃林, 舒芹 申請人:武漢華美生物工程有限公司