一種蘋果酸脫氫酶基因mimdh1及其重組表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蘋果酸脫氫酶基因及其重組表達(dá)載體，具體涉及以深黃 ^霉(Mortierella i sabel I ina)W)~22總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,擴(kuò)增得到編碼蘋果酸脫氫酶(MDH)的基因，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體后誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化后得到純酶，并對(duì)該酶進(jìn)行了酶活測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布于生物體內(nèi)，是一種活性非常強(qiáng)的酶，它催化草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)，與二核苷酸輔酶的氧化還原相關(guān)。草酰乙酸鹽在許多代謝途徑中都有重要作用，包括三羧酸循環(huán)、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原異生等，并維持氧化還原平衡，還能促進(jìn)胞質(zhì)和亞細(xì)胞器代謝物的交換。依生物體的功能不同、組織差異、細(xì)胞內(nèi)定位的不同其表達(dá)種類不同，MDH具有多種同工酶形式。胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(cMDH)存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，擔(dān)負(fù)著將NADH轉(zhuǎn)入線粒體的重任，并且還對(duì)調(diào)控三羧酸循環(huán)有作用，同時(shí)cMDH還是核酸通路(NACh)復(fù)合體的一個(gè)組成部分。
[0003]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布在動(dòng)物組織、微生物和植物中。它是一種活性最強(qiáng)的酶，根據(jù)亞細(xì)胞定位，蘋果酸脫氫酶可分為5種類型，存在于乙醛酸體、線粒體、過氧化物體、葉綠體、細(xì)胞漿以及錐蟲甘油體內(nèi)。MDH為多聚體酶，是由相同或相似亞基組成的二聚體或四聚體，亞基的分子量為30-35kDa，MDH在醫(yī)學(xué)方面也引起越來越多的關(guān)注如利用基因工程疫苗預(yù)防人體帶絳蟲病已是備受關(guān)注的研究方向，通過牛帶絳蟲亞洲亞種MDH基因的生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)到胞漿型MDH是一個(gè)潛在的診斷抗原，這為帶絳蟲在診斷、藥物及疫苗研究中的應(yīng)用前景提供了重要的線索，在臨床診斷中用于多酶分析及疾病的早期診斷，例如用于診斷DIC (彌散性血管內(nèi)凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品領(lǐng)域，蘋果酸脫氫酶用于有機(jī)酸含量的測(cè)定，如L-蘋杲酸、醋酸、檸檬酸等物質(zhì)的測(cè)定，應(yīng)用前景廣泛。利用MDH底物專一性，還可將其用于拆分D，L-蘋果酸酶。總之，MDHs作為生物體中樞代謝途徑的關(guān)鍵酶，國(guó)內(nèi)外對(duì)其己進(jìn)行了較為廣泛的研究，MDHs同工酶正應(yīng)用于生物分類、物種分化、遺傳變異、物種雜交和個(gè)體發(fā)育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、結(jié)構(gòu)及功能、催化機(jī)制，對(duì)于酶重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫特性分析，探討生物體中MDHs的代謝作用以及一些疾病的分子致病機(jī)制有著重要的意義。同時(shí)MDH的應(yīng)用研究也將會(huì)推動(dòng)MDHs轉(zhuǎn)基因植物及手性藥物的進(jìn)一步發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種從深黃被孢霉(#oriieri?77a 2???77Υ/7<3)Μ6-22中分離的蘋果酸脫氫酶基因該基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的核苷酸序列，該基因序列長(zhǎng)為990bp (堿基)，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或其片段。
[0005]本發(fā)明另一目的是提供一種含有所分離的蘋果酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體，是將SEQ ID NO:1所示基因直接與不同表達(dá)載體(質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體)連接所構(gòu)建的重組載體。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供一種含有該蘋果酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體或上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞大腸桿菌(ikcAericAia coif)菌株BL21。
[0007]用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，用CaCl2、電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。
[0008]本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效、特異性的蘋果酸脫氫酶基因，可以將其與載體連接后轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受場(chǎng)地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)商業(yè)化蘋果酸脫氫酶等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、可行性高等優(yōu)點(diǎn)，為蘋果酸脫氫酶基因工程化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0009]圖1為利用本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22蘋果酸脫氫酶基因構(gòu)建的大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aMMDHl質(zhì)粒圖譜；
圖2為本發(fā)明所構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aMMDHl的酶切分析圖；其中:1為DNAMarker ；2為pET32a(+)雙酶切后條帶；3為pET32aMMDHl雙酶切后條帶；4為基因MIMDHl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖3為本發(fā)明的蘋果酸脫氫酶基因誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的SDS-PAGE分析圖，其中:1為轉(zhuǎn)化了 pET32a⑴并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；2為轉(zhuǎn)化了pET32aMIMDHl并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；3為純化的目的蛋白條帶；4為蛋白電泳 Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。[0011 ] 實(shí)施例1:深黃被孢霉蘋果酸脫氫酶基因的克隆
米用 OMEGA 試劑盒 Ε.Z.N.A Fungal RNA Kit 從深黃被抱霉isabellina)中提取總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Thermo Scientific Maxima H Minus First Strand cDNASynthesis Kit合成cDNA,取I μ I為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。設(shè)計(jì)引物(引物I和引物2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)所用引物、組分和擴(kuò)增條件如下:
引物 Pl:MIMDHF1: 5' -ATGGTCAAAGTTACAGTTTGCGG-3' (SEQ ID NO: 3)
引物 P2:MMDHR1: 5'-TTACAACTTGGCATCAGTGATGAAAG-3' (SEQ ID N0:4)
PCR擴(kuò)增體系(50 μ L)組成如下:
5 X Trans PFU Buffer10 μ L
dNTP (2.5ymol/L)5μ L
cDNAI μ L MIMDHFI (10ymol/L)2μ L
MMDHRl (10ymol/L)2μ L
Fast Pfu DNA polymerase (5U/μ L)2 μ L
無菌ddH20補(bǔ)足至50 μ L
擴(kuò)增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s、64°C 45s,72°C 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin，反應(yīng)完后取產(chǎn)物I μ L，然后在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳分析。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像確認(rèn)片段大小正確后，用百泰克生物技術(shù)有限公司多動(dòng)能DNA純化回收試劑盒回收目的片段，然后將PCR擴(kuò)增得到的目的基因連接到pMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，用含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體平板進(jìn)行篩選，挑取平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，然后送去上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果結(jié)果顯示，獲得一段990bp長(zhǎng)的序列,命名為序列組成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0012]實(shí)施例2:重組表達(dá)質(zhì)粒pET3