2aMMDHl的構建
采用實施例1中的cDNA為模板進行PCR擴增，反應所用引物組合、反應組分和擴增條件如下:
引物 P3:MMDHF2: 5'-CGCGGATCCATGGTCAAAGTTACAGTTTGCGG-3' (SEQ ID NO:5)
引物 P4:MMDHR2: 5'-CCGCTCGAGCAACTTGGCATCAGTGATGAAAG-3' (SEQ ID NO:6)
PCR擴增體系(50 μ L)組成如下:
5XFast Pfu Buffer10 μ L
dNTP (2.5ymol/L)5μ L
cDNAI μ L
MIMDHF2 (10ymol/L)I μ L
MIMDHR2 (10ymol/L)I μ L
Fast Pfu DNA polymerase (5U/ μ L) IuL 無菌ddH20補足至50 μ L ;
擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s,64°C 45s,72°C 2min進行30個循環(huán)，最后72 V 1min;取純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET_32a分別用BanR I和Xho I酶切過夜，50 μ I PCR產(chǎn)物反應體系:PCR產(chǎn)物 25 μ L，1XTango Buffer 10 μ I, BanR I 2 μ I 和 ZAo I1.5 μ L，用滅菌的雙蒸水補齊，37°C酶切過夜。50μ I質(zhì)粒pET-32a反應體系:質(zhì)粒pET_32a15 μ I, 1XTango Buffer 10 μ I, BanR I 2 μ I 和 ZAo I1.5 μ L，用滅菌的雙蒸水補齊，37°C酶切過夜。電泳檢驗酶切產(chǎn)物,并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化和回收。連接體系(1yL):純化的PCR產(chǎn)物和表達載體pET-32a按7:1加樣，T4DNA連接酶0.5 μ L，Τ4Buffer lyL，16°C連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中。37°C振蕩培養(yǎng)1.5h后，培養(yǎng)液涂布含氨芐的LB培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，挑取平板上的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR，篩選陽性克隆，構建獲得重組表達質(zhì)粒命名為pET32aMMDHl，該質(zhì)粒圖譜如圖1所示。進一步進行雙酶切分析鑒定，如圖2第3泳道所示，用BanR I和Xho I雙酶切，重組質(zhì)粒產(chǎn)生兩條帶，小分子條帶與泳道4中該基因的PCR產(chǎn)物大小一致，大分子條帶與泳道2中用相同兩個內(nèi)切酶酶切pET32a( + )產(chǎn)生的條帶大小一致，表明所構建的重組表達質(zhì)粒正確，進一步測序分析也證明這一點。此外，通過核苷酸序列所編碼的氨基酸相似性搜索表明，該基因編碼的蛋白與真菌來源的蘋果酸脫氫酶相似，但不完全相同。
[0013]實施例3:蘋果酸脫氫酶基因在大腸桿菌BL21中的誘導表達 1、蘋果酸脫氫酶蛋白MIMDHl的誘導表達及純化
為了驗證該基因編碼蛋白的活性，將I μ g重組質(zhì)粒pET32aMMDHl加入50 μ L大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，，將整個體系冰浴30min之后于42°C熱擊90s，再次冰浴2min，然后將連接體系吸取并加入至950 μ L LB液體培養(yǎng)基中，37°C、10rpm振蕩孵育Ih。孵育結束后于5000rpm離心10 min，留下約SOyL上清液懸浮沉淀后涂布于含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體平板，37°C倒置培養(yǎng)10h。
[0014]挑取陽性轉(zhuǎn)化子于100 mL LB(含100μ g/mL氨芐霉素)培養(yǎng)基中，37 °〇振蕩培養(yǎng)過夜，將富集的菌液按1%比例接種到IL LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，160rpm培養(yǎng)至0D600值約為0.8。取5ml菌液作為空白對照，其余加入IPTG至終濃度為lmmol/L，于15°C恒溫搖床80rpm誘導培養(yǎng)8小時，12000 rpm離心15min收集菌體。SDS-PAGE分析顯示，pET32aMMDHl轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達出一條分子量約為50kD的蛋白(見圖3泳道2)，但在空載體pET32a(+ )轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中沒有(見圖3泳道I)。
[0015]進一步用該菌體懸浮于適量(使菌懸液的0D_~ 20) 30 mM的咪唑緩沖液中，冰上超聲破碎細胞，4°C、14000 rpm離心15 min。將離心后的上清液用0.2 μ m的微型濾膜過濾，濾液上樣于已用30mM咪唑緩沖液平衡好的His Trap HP柱(I ml, GE Healthcare)，用200mM咪唑緩沖液進行洗脫，洗脫液用離心管按順序收集，洗脫樣品用SDS-PAGE電泳檢測，獲得一純蛋白條帶(見圖3泳道3)。
[0016]2、蘋果酸脫氫酶MMDHl的酶活測定
蘋果酸脫氫酶是調(diào)控蘋果酸代謝的關鍵酶，可以催化蘋果酸進行脫氫氧化，伴隨著產(chǎn)生草酰乙酸和NADH。由于MDH的酶活在一定的反應時間內(nèi)與反應產(chǎn)物NADH的濃度變化呈線性關系，所以MDH的活性可通過檢測NADH的濃度變化來測定。以蘋果酸和NAD ( + )為底物加入蘋果酸脫氫酶進行反應，用紫外分光光度計在340nm處測定酶活。MDH酶活的的計算:
單位定義:一個酶活力單位是指25°C時每分鐘生成IMmolNADH所需的酶量。
[0017]蘋果酸脫氫酶酶活計算公式:
E=[(Ae/At) XVtXdf]/( ε XDXVsXC)
=[(0.305-0.276) X 1.9 X 95] / (6.22 X I X 0.02 X 0.2482)
=168.85U/mg
Vt-----反應溶液總體積(ml)
ε-----340nm處測定的NADH的吸光度為6.22
D-----光路長(Icm)(比色皿直徑)
Vs-----酶液體積(ml)
C-----蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)
Δ e/ Δ t----1min內(nèi)340nm處吸光度的變化
df稀釋因子
結果顯示，所純化的蘋果酸脫氫酶MMDHl的酶活為168.85 U/mg，表明基因重組載體在大腸桿菌BL21中誘導表達出來的蘋果酸脫氫酶MMDHl具有蘋果酸脫氫酶的活性。
【主權項】
1.一種蘋果酸脫氫酶基因其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一種含有權利要求1所述蘋果酸脫氫酶基因的重組表達載體。
3.一種宿主細胞，所述宿主細胞含有權利要求1所述的蘋果酸脫氫酶基因MIMDHimi利要求2所述的重組表達載體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蘋果酸脫氫酶基因MIMDH1及其重組表達載體，其是從深黃被孢霉M6-22中分離的編碼蘋果酸脫氫酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，通過構建重組載體并在大腸桿菌中表達，表達產(chǎn)物具有蘋果酸脫氫酶功能，能催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸。
【IPC分類】C12N15-70, C12N15-53, C12N1-21, C12N9-04
【公開號】CN104673810
【申請?zhí)枴緾N201510033347
【發(fā)明人】張琦, 劉小嶺, 楊曉霞, 魏云林, 林連兵, 季秀玲
【申請人】昆明理工大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年1月23日