專利名稱：綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
Noggin BMPs (bone morphogenetic proteins,S ) ^白，是從非洲蟾蜍體內(nèi)分離，能誘導(dǎo)神經(jīng)組織發(fā)生和腹側(cè)中胚層背側(cè)化。由于它與BMP2和 BMP4具有高度親和力，從而阻止它們與BMP受體的相互作用。因此，BMPs活性受到BMP拮抗蛋白noggin基因的抑制性調(diào)節(jié)。目前普遍認(rèn)為，毛囊的發(fā)生也是由表皮干細(xì)胞引發(fā)的。在毛囊的形成過(guò)程中，表皮干細(xì)胞通過(guò)改變他們的極性以及細(xì)胞間的相互聯(lián)系而啟動(dòng)這一過(guò)程。2003年，由洛克斐勒大學(xué)HHMI研究所Elaine Fuchs領(lǐng)導(dǎo)的研究人員發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)信號(hào)分子，即WNT及BMP 抑制劑Noggin，能夠影響未成熟的干細(xì)胞形成毛囊的過(guò)程。在之前的研究中，F(xiàn)uchs將 beta-catenin基因?qū)胄∈笊a(chǎn)出具有很多毛囊的轉(zhuǎn)基因老鼠。beta-catenin受Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)，研究人員證明Wnt能使beta-catenin穩(wěn)定，而noggin則能阻斷BMP的功能， 產(chǎn)生Lefl。這樣，beta-catenin即可結(jié)合并活化Lefl轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，下調(diào)E-cadherin基因的表達(dá)，降低E-cadherin的水平，從而改變細(xì)胞的極性以及細(xì)胞間相互連接，引發(fā)毛囊的起始過(guò)程。如果提高E-cadherin的水平，毛囊則不再形成。這就是說(shuō)，通過(guò)來(lái)源于不同類型細(xì)胞的WNT及noggin兩個(gè)影響毛囊形成的信號(hào)分子，將細(xì)胞外的信號(hào)通路與細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)系在一起，共同作用于目標(biāo)基因，可以重塑細(xì)胞間聯(lián)系、啟動(dòng)毛囊的形成。毛發(fā)是少數(shù)幾個(gè)能規(guī)律性再生的器官之一，是研究器官再生的主流模式之一，也是目前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。2008年，來(lái)自美國(guó)南加州大學(xué)鐘正明教授的研究小組發(fā)現(xiàn)，毛發(fā)(即使是正常小鼠中的毛發(fā))并不是以個(gè)體為單位生長(zhǎng)，而是波浪式再生的，這說(shuō)明毛發(fā)干細(xì)胞不僅受到一個(gè)毛囊中微環(huán)境的調(diào)控，也被鄰近的毛囊、皮膚區(qū)間，以及系統(tǒng)激素有等級(jí)地進(jìn)行調(diào)控。在分子水平上，BMP和Noggin的表達(dá)呈周期性變化。在毛囊生長(zhǎng)期，尤其是細(xì)胞增殖時(shí)，Noggin 表達(dá)高、BMP表達(dá)低；在退行期和不應(yīng)期，BMP表達(dá)高、Noggin表達(dá)低。這些發(fā)現(xiàn)表明皮膚宏觀環(huán)境(macro-environment)下，BMP和Noggin的周期性表達(dá)在毛發(fā)干細(xì)胞活性機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)許多毛發(fā)再生的時(shí)候，毛發(fā)必須在它們其間交換活性信號(hào)，在宏觀環(huán)境的不同時(shí)間位點(diǎn)，這些干細(xì)胞活性受到抑制或者促進(jìn)。研究人員還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中過(guò)量上表達(dá)noggin，毛囊的不應(yīng)期顯著縮短，而毛囊的再生明顯加快；將該轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚移植到正常小鼠皮膚則發(fā)現(xiàn)，供體和受體皮膚的毛囊會(huì)受相互作用影響，其毛囊最終的命運(yùn)則取決于真皮內(nèi)BMP的活性；而人為調(diào)控皮膚BMP活性即可造成毛囊生長(zhǎng)周期的變化。 所以，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)及其拮抗因子Noggin在控制毛囊活動(dòng)周期中起重要作用。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)Noggin基因的表達(dá)干預(yù)BMP的活性，能夠影響毛囊生長(zhǎng)周期，延長(zhǎng)毛囊生長(zhǎng)期、加快毛囊循環(huán)周期的進(jìn)程。Andrey的研究還發(fā)現(xiàn)，Noggin基因的過(guò)量表達(dá)還將改變毛囊的大小和毛發(fā)的形狀，這些變化無(wú)疑對(duì)提高毛產(chǎn)量和品質(zhì)提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。本發(fā)明利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出綿羊Noggin基因cDNA全長(zhǎng)編碼區(qū)，進(jìn)一步構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，利用慢病毒卵周隙注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)Noggin基因綿羊，以便進(jìn)一步分析 Noggin基因在綿羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的克隆綿羊Noggin基因的cDNA序列和構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，對(duì)分析其在細(xì)毛羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育中的功能有重要的科學(xué)價(jià)值與實(shí)踐意義。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，1)確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全序列；2)設(shè)計(jì)克隆Noggin基因全長(zhǎng) cDNA 的 PCR 弓丨物，上游引物 Nl :ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG，下游引物 N2 CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC ；上下游引物酶切位點(diǎn)外側(cè)含有酶切的保護(hù)堿基ATA和 CGA ；3)將目的基因定向克隆于pET41a原核表達(dá)載體中，獲得pET41a-N0ggin重組原核表達(dá)載體；4)設(shè)計(jì)將目的基因定向克隆與慢病毒表達(dá)載體的引物上游引物Pl :ATAGGATCCGG AGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物 P2 :CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAC GAGCACTTGCACTC (包含HA抗體標(biāo)簽)；將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表達(dá)載體中，獲得Noggin基因慢病毒載體，生產(chǎn)重組病毒，利用慢病毒卵生產(chǎn)轉(zhuǎn)Noggin基因綿羊力)通過(guò) PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因羊。所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用特異性引物m和N2進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系為2uL cDNA模板，2.5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO，IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調(diào)整至 25uL;其 PCR 反應(yīng)條件為94°C 4min，94°C 30s, 64 °C 30s, 72 °C lmin，;35 個(gè)循環(huán)， 72°C IOmin ；取反應(yīng)液5uL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)，將綿羊Noggin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及 pET41a載體同時(shí)進(jìn)行BamH I-Xho I雙酶切，分別回收純化酶切后的PCR產(chǎn)物和pET41a載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和pET41a載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α ；利用卡納霉素和藍(lán)白斑標(biāo)記進(jìn)行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行序列鑒定后，命名為pEI^la-Noggin。所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，構(gòu)建表達(dá)載體，生產(chǎn)慢病毒，生產(chǎn)轉(zhuǎn) Noggin基因綿羊其構(gòu)建載體以pET41a-N0ggin為模板，利用特異性引物Pl和P2進(jìn)行PCR反應(yīng)； 其反應(yīng)體系為luL pET41a-Noggin，2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaqSI (寶生物，Pfu)，用 ddH20調(diào)整至 25uL ；其 PCR 反應(yīng)條件為94°C 4min，94°C 30s，64°C 30s, 72°C lmin,35 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin ；取反應(yīng)液 5uL 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)，將綿羊Noggin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及pLex慢病毒載體同時(shí)進(jìn)行BamH IAhoI雙酶切，分別回收純化后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的 PCR產(chǎn)物和pLEX載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α ；利用氨芐青霉素進(jìn)行平板篩選，并以PCR法、限制性酶切法鑒定，并送由上海生物工程有限公司測(cè)序鑒定，新載體命名為pLEX-noggin ；其細(xì)胞培養(yǎng)條件37°C，5%的CO2,培養(yǎng)基采用DMEM+10 %的胎牛血清， 每IOcm面積中鋪2-2. 5X IO6個(gè)細(xì)胞，保證第2天細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達(dá)到70-80% ；其Lipectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染加入1. 5ml預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例加入轉(zhuǎn)染載體(plex-noggin)12ug、包裝質(zhì)粒(pSPAX》9ug、包膜質(zhì)粒(pMD2G) 3. 5ug、 輕輕混勻，同時(shí)將50ul的脂質(zhì)體加入到1. 5ml opti-MEM培養(yǎng)基，室溫放置5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，混合物置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養(yǎng)基清洗待轉(zhuǎn)染細(xì)胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物加入細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育，2-4小時(shí)后，移去脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入IOml新鮮的培養(yǎng)液，重新將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后收集病毒；其收集病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將細(xì)胞上清用0. 45um過(guò)濾器過(guò)濾，收集過(guò)濾液，采用clontech公司的病毒滴度測(cè)定試劑盒(lenti-χ qrt-PCR Titration Kit)測(cè)定滴度，滴度大于106IFU/ml，超速低溫離心濃縮，將濃縮后的病毒分裝至1. 5ml的印pendorf中，置于液氮或者_(dá)70°C保存?zhèn)溆?。所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)基因羊的鑒定，采集臍帶和皮膚組織，利用酚-氯仿法提取基因組DNA，通過(guò)PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因羊；PCR上游引物 CACCAAAATCAACGGGACTT,下游引物CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGA GCACTTGCACTC ;PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) :PCR Mix 12. 5 μ L，引物(lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L， DNA 模板 600ng, ddH20 補(bǔ)至 25 μ L ；PCR 反應(yīng)程序95 V 5min ；95 °C 30sec ；60 °C 30sec ； 720C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的人 (NM_0(^450)，小鼠(NM_008711)和牛(XM_582573)的Noggin基因編碼區(qū)的保守序列，利用 01igo6. 0設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，其引物由上海生物工程公司合成。所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，選用的試劑盒、藥劑均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明構(gòu)思是確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全序列，設(shè)計(jì)克隆Noggin基因全長(zhǎng) cDNA的PCR引物，通過(guò)RT-PCR技術(shù)，從綿羊胎兒腦組織克隆綿羊Noggin基因全長(zhǎng)cDNA，確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)cDNA序列；將目的基因定向克隆于pET41a原核表達(dá)載體中，獲得pET41a-N0ggin重組原核表達(dá)載體；特別是該發(fā)明構(gòu)建Noggin基因慢病毒載體，生產(chǎn)重組病毒，利用慢病毒卵周隙注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)Noggin基因綿羊，具有重要的實(shí)踐價(jià)值，彰顯技術(shù)進(jìn)步。


本發(fā)明對(duì)照附圖作進(jìn)一步說(shuō)明。附圖1為綿羊Noggin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；如圖所示M為150bp marker, 1為擴(kuò)增到的noggin基因。附圖2為綿羊Noggin基因原核表達(dá)結(jié)果；如圖所示重組pET41-NogginSDS-PAGE 檢測(cè)1，3，5. pET41_Noggin 誘導(dǎo)后，2，4， 6. pET41-Noggin 誘導(dǎo)前，7. pET41 空載體。附圖3 為重組 pLEX-NogginWestern blot 檢測(cè)結(jié)果；如圖所示綿羊Noggin基因真核表達(dá)結(jié)果1，2pLEX_Noggin，3. pLEX空載體。圖4為轉(zhuǎn)Noggin細(xì)毛羊臍帶，皮膚組織PCR檢測(cè)結(jié)果；如圖所示轉(zhuǎn)基因羊鑒定的PCR結(jié)果第一排為臍帶，第二排為相對(duì)應(yīng)的皮膚組
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對(duì)照實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程(1)實(shí)驗(yàn)樣品采集與總RNA提取采集妊娠3個(gè)月的羊胚胎，快速分離腦組織，裝入凍存管中并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?；取IOOmg組織樣在液氮中研碎，然后按照杭州博日RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。(2)引物設(shè)計(jì)利用01igo6. 0設(shè)計(jì)的兩對(duì)(N1，N2和P1，P2)PCR引物，由上海生物工程公司合成。(3) RT-PCR對(duì)綿羊胚胎腦組織RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄方法參照說(shuō)明書(shū)；以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，利用特異性引物W和N2進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系為2uL cDNA模板，2.5uL 10XPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO，IUTaq酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調(diào)整至 25uL。PCR 反應(yīng)條件為94°C 4min，94°C 30s，64°C 30s, 72°C lmin, 35個(gè)循環(huán)，72°C IOmin ；反應(yīng)結(jié)束，取反應(yīng)液5uL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)其產(chǎn)物。(4)克隆和測(cè)序?qū)⒕d羊Noggin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及pEI^la載體同時(shí)進(jìn)行BamHI-XhoI雙酶切，分別回收純化酶切后的PCR產(chǎn)物和pET41a載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和 pET41a載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α ；利用卡納霉素和藍(lán)白斑標(biāo)記進(jìn)行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行序列鑒定分析后命名為pET41a-N0ggin。(5)原核表達(dá)將測(cè)序后的質(zhì)粒DNA及空載體分別轉(zhuǎn)化BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡納霉素(50ug/mL)的LB固體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆菌落接種到含有卡納霉素 (50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；然后將培養(yǎng)物按1 100的比例接種于新鮮的含有卡納霉素(50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖震培養(yǎng)至0P_ = 0. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG(終濃度lmmol/L)37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，按常規(guī)方法離心收集菌體，用200uLPBS重懸菌體，并加入200uL 2 X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，100°C變性lOmin，進(jìn)行SDS-PAGE和 Western-blot,分析目的蛋白的表達(dá)。(6)構(gòu)建noggin基因的慢病毒表達(dá)載體，生產(chǎn)高滴度慢病毒，利用慢病毒卵周隙注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)Noggin基因綿羊；a、構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體以pET41a-N0ggin為模板，利用特異性引物Pl和P2進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，其反應(yīng)體系為2uL cDNA 模板，2. 5uL 10XPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)， 上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調(diào)整至 25uL。PCR 反應(yīng)條件為94°C 4min,94°C 30s, 64°C 30s, 72°C lmin, 35 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin ；取反應(yīng)液 5uL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)。將綿羊Noggin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及pLEX慢病毒載體同時(shí)進(jìn)行BamHIAho I雙酶切，分別回收純化后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶
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7連接酶切后的PCR產(chǎn)物和pLD(載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a ；利用氨芐青霉素進(jìn)行平板篩選， 并以PCR法、限制性酶切法鑒定，并送由上海生物工程有限公司測(cè)序鑒定，新載體命名為 pLEX-noggin ；將綿羊Noggin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及pLex慢病毒載體同時(shí)進(jìn)行BamH I/Xho I雙酶切，分別回收純化后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和 pLEX載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a ；利用氨芐青霉素進(jìn)行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，新載體命名為pLEX-noggin ；b、在細(xì)胞中包裝重組慢病毒步驟第1日J(rèn)93T細(xì)胞培養(yǎng)和鋪板293Τ細(xì)胞培養(yǎng)條件，37°C，5%的CO2，培養(yǎng)基采用DMEM+10%的胎牛血清，每IOcm 面積中鋪2-2. 5X IO6個(gè)細(xì)胞，保證第2天細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達(dá)到70-80% ；第2 日Lipectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染首先，在聚丙烯管里準(zhǔn)備脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物；加入1. 5ml預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例加入目的載體及病毒包裝載體。輕輕混勻。室溫放置；轉(zhuǎn)染載體(plex-noggin)12ug包裝質(zhì)粒(pSPAX》9ug包膜質(zhì)粒(pMD2G)3. 5ug在使用Lipectamine 2000之前先輕輕混勻脂質(zhì)體；而后，在另一個(gè)管中加入 1. 5ml室溫的Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入50ul Lipectamine 2000，輕輕混勻后室溫放置，室溫放置5min后；將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，混合物置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養(yǎng)基清洗待轉(zhuǎn)染細(xì)胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物加入細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育，2-4小時(shí)后，移去脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入 IOml新鮮的培養(yǎng)液，重新將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第4日收集病毒收集含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將細(xì)胞上清用0. 45um過(guò)濾器過(guò)濾，收集過(guò)濾液； 采用clontech公司的病毒滴度測(cè)定試劑盒(lenti-xqrt-PCR TitrationKit)測(cè)定滴度，滴度大于106IFU/ml，超速低溫離心濃縮，保證濃縮后的病毒滴度大于109IFU/ml，將濃縮后的病毒分裝至1. 5ml的^pendorf中，置于液氮或者_(dá)70°C保存?zhèn)溆?；C、利用慢病毒卵周隙注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊。(7)轉(zhuǎn)基因羊的鑒定采集轉(zhuǎn)基因羊的臍帶和皮膚組織，利用酚-氯仿法提取基因組DNA ；通過(guò)PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因羊，PCR反應(yīng)體系(25yL) :PCR Mix 12.5yL，引物 (lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 600ng, ddH20 補(bǔ)至 25 μ L ；PCR 反應(yīng)程序95 "C 5min ；95 "C 30sec ；60 "C 30sec ；72 "C lmin，35 個(gè)循環(huán)； 72 0C 7min ；上游引物CACCAAAATCAACGGGACTT(pLEX 載體自帶引物)，下游引物CGACTCGAGCT AAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC。
權(quán)利要求
1.綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于1)確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全序列；2)設(shè)計(jì)克隆Noggin基因全長(zhǎng)cDNA 的 PCR 弓丨物，上游弓丨物 Nl :ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游弓丨物 N2 CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC ；上下游引物酶切位點(diǎn)外側(cè)含有酶切的保護(hù)堿基ATA和 CGA ；3)將目的基因定向克隆于pET41a原核表達(dá)載體中，獲得pET41a-N0ggin重組原核表達(dá)載體；4)設(shè)計(jì)將目的基因定向克隆與慢病毒表達(dá)載體的引物上游引物Pl :ATAGGATCCGG AGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物 P2 :CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAC GAGCACTTGCACTC (包含HA抗體標(biāo)簽)；將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表達(dá)載體中，獲得Noggin基因慢病毒載體，生產(chǎn)重組病毒，利用慢病毒卵生產(chǎn)轉(zhuǎn)Noggin基因綿羊力)通過(guò) PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因羊。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用特異性引物m和N2進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系為2uL cDNA模板，2.5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調(diào)整至 25uL ；其 PCR 反應(yīng)條件為94°C 4min,94°C 30s， 64°C 30s, 72°C lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C IOmin ；取反應(yīng)液5uL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)，將綿羊Noggin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及pET41a載體同時(shí)進(jìn)行BamH I-Xho I雙酶切，分別回收純化酶切后的PCR產(chǎn)物和pET41a載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和pET41a載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a ；利用卡納霉素和藍(lán)白斑標(biāo)記進(jìn)行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行序列鑒定后，命名為pET41a-N0ggin。
3.依據(jù)權(quán)利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于構(gòu)建表達(dá)載體，生產(chǎn)慢病毒，生產(chǎn)轉(zhuǎn)Noggin基因綿羊其構(gòu)建載體以pET41a-N0ggin為模板，利用特異性引物Pl和P2進(jìn)行PCR反應(yīng)；其反應(yīng)體系為luL pET41a-Noggin，2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物 (IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調(diào)整至 25uL ；其 PCR 反應(yīng)條件為94°C 4min，94°C 30s，64°C 30s, 72°C lmin, 35 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin ；取反應(yīng)液 5uL 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)；將綿羊Noggin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及pLex慢病毒載體同時(shí)進(jìn)行BamH I/ XhoI雙酶切，分別回收純化后的PCR產(chǎn)物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR 產(chǎn)物和pLEX載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a ；利用氨芐青霉素進(jìn)行平板篩選，并以PCR法、限制性酶切法鑒定，并送由上海生物工程有限公司測(cè)序鑒定，新載體命名為pLEX-noggin ；其細(xì)胞培養(yǎng)條件37°C，5%的CO2,培養(yǎng)基采用DMEM+10%的胎牛血清，每IOcm面積中鋪2-2. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞，保證第2天細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達(dá)到70-80% ；其Lipectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染加入1. 5ml預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例加入轉(zhuǎn)染載體(plex-noggin)12ug、包裝質(zhì)粒(pSPAX》9ug、包膜質(zhì)粒(pMD2G) 3. 5ug、輕輕混勻，同時(shí)將50ul的脂質(zhì)體加入到1. 5ml opti-MEM培養(yǎng)基，室溫放置5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，混合物置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養(yǎng)基清洗待轉(zhuǎn)染細(xì)胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物加入細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育， 2-4小時(shí)后，移去脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入IOml新鮮的培養(yǎng)液，重新將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后收集病毒；其收集病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將細(xì)胞上清用0. 45um過(guò)濾器過(guò)濾，收集過(guò)濾液，采用clontech公司的病毒滴度測(cè)定試劑盒(lenti-χ qrt-PCR Titration Kit)測(cè)定滴度，滴度大于106IFU/ml，超速低溫離心濃縮，將濃縮后的病毒分裝至1. 5ml的印pendorf中，置于液氮或者_(dá)70°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.依據(jù)權(quán)利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于轉(zhuǎn)基因羊的鑒定，采集臍帶和皮膚組織，利用酚-氯仿法提取基因組DNA，通過(guò)PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因羊；PCR 上游引物CACCAAAATCAACGGGACTT，下游引物CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTC GTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC ；PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) :PCR Mix 12. 5 μ L，引物(lOpmol/ μ L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 600ng, ddH20 補(bǔ)至 25 μ L ；PCR 反應(yīng)程序:95 V 5min ；95°C 30sec ； 60°C 30sec ；72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。
5.依據(jù)權(quán)利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于根據(jù) GenBank 已經(jīng)公布的人(ΝΜ_00Μ50)，小鼠(ΝΜ_008711)和牛(ΧΜ_582573)的 Noggin 基因編碼區(qū)的保守序列，利用01igo6. 0設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，其引物由上海生物工程公司合成。
6.依據(jù)權(quán)利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于選用的試劑盒、藥劑均為市售產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明的綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，確定綿羊Noggin基因編碼區(qū)的全序列；設(shè)計(jì)克隆Noggin基因全長(zhǎng)cDNA的PCR引物，上游引物N1ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG，下游引物N2CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC；其引物酶切位點(diǎn)外側(cè)含有保護(hù)堿基ATA和CGA；將目的基因克隆于pET41a原核表達(dá)載體中，獲得pET41a-Noggin重組載體；設(shè)計(jì)將目的基因定向克隆與慢病毒表達(dá)載體的引物上游引物P1ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG，下游引物P2CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC(包含HA抗體標(biāo)簽)；將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒載體中，獲得Noggin基因慢病毒載體，生產(chǎn)重組病毒，生產(chǎn)轉(zhuǎn)Noggin基因綿羊；通過(guò)PCR方法鑒定其轉(zhuǎn)基因羊。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102181447SQ20101058002
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者劉明軍, 張寧, 張雪梅, 李文蓉, 賀三剛 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心