專利名稱：通過抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原的表達(dá)而治療牛皮癬、鱗狀上皮細(xì)胞癌和/或角化不全的方 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了通過抑制細(xì)胞的鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(Squamous CellCarcinoma Antigen,下文中稱為“SCCA” )的表達(dá)而治療和/或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的 疾病的方法、藥物組合物。本發(fā)明還提供了以抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原-I(SCCA-I)所具有 的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的候選物質(zhì)的活性為指標(biāo)，篩選抑制表皮角化不全的物質(zhì)的方 法；提供了通過所述方法篩選到的抑制表皮角化不全的物質(zhì)；進(jìn)一步地提供了通過抑制表 皮細(xì)胞中SCCA-I的胱天蛋白酶(caspase) 14抑制活性而謀求表皮細(xì)胞角化的正?；?、抑制 表皮角化不全的方法。
背景技術(shù)：
SCCA為自鱗狀上皮癌細(xì)胞提取的抗原，其在子宮頸部、肺、食道、皮膚的鱗狀上皮 細(xì)胞癌中顯示出高的血液濃度，常用于鱗狀上皮細(xì)胞癌的診斷(H. Kato等人，Cancer 40: 1621-1628(1977) ；N. Mino 等人，Cancer 62:730-734(1988))。特別是，由于 SCCA 的血液中 水平與鱗狀上皮細(xì)胞癌的進(jìn)展階段、惡性程度、腫瘤的大小等呈良好的相關(guān)性，其除了用于 癌癥的早期發(fā)現(xiàn)之外，在癌癥治療效果的評價以及診斷所擔(dān)心的復(fù)發(fā)等中也是特別有效 的癌標(biāo)志物。還知道SCCA在牛皮癬表皮的上層中表達(dá)增強(qiáng)(Takeda A.等人，J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1),147-154).牛皮癬是皮膚病中的一種，是以表皮細(xì)胞的增殖/ 分化異常和炎癥細(xì)胞浸潤為特征的慢性、再發(fā)性的炎癥性角化不全癥的牛皮癬。認(rèn)為牛 皮癬除遺傳因素之外還因多種環(huán)境因子而發(fā)病(Hopso-Havu等人，British Journal of Dermatology(1983) 109，77-85)。SCCA是由染色體18q21.3上串聯(lián)排列的兩個基因SCCA-I和SCCA-2編碼的。認(rèn) 為由這兩個基因編碼的蛋白質(zhì)SCCA-I和SCCA-2均為分子量約45，000的蛋白質(zhì)，同源性非 常高，但是二者反應(yīng)部位的氨基酸序列不同，具有不同的功能(khick等人，J. Biol. Chem. (1997)27213,1849-55)。雖然已知在鱗狀包皮細(xì)胞癌和牛皮癬等疾病中存在SCCA-I和 SCCA-2高表達(dá)，但是，對它們在疾病細(xì)胞中發(fā)揮什么樣的功能尚不清楚。一方面，已知角質(zhì)形成細(xì)胞通過終末分化，具有形成抵御有害環(huán)境的被稱作“角質(zhì) 層”的保護(hù)屏障的功能。終末分化過程在分化程序中受到正確調(diào)控，從增殖型基底細(xì)胞開 始經(jīng)有棘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞，最后到角質(zhì)細(xì)胞。從顆粒細(xì)胞向角化細(xì)胞的過渡期中，角質(zhì)形成 細(xì)胞的內(nèi)側(cè)和外側(cè)發(fā)生劇烈變化。角質(zhì)形成細(xì)胞的核與細(xì)胞器消失，另一方面，生成周圍脂 質(zhì)層、被稱作角化外皮的強(qiáng)化了的細(xì)胞膜以及角蛋白構(gòu)型(keratin pattern) 0角蛋白構(gòu)型內(nèi)部結(jié)構(gòu)柔軟，且維持緊張狀態(tài)。以往的報告稱，分化中的角質(zhì)形成細(xì)胞存在DNA片段化 和TUNEL陽性細(xì)胞等，顯示出程序性細(xì)胞死亡(apoptosis)特征(Haake A. R.，J. Invest. Dermatol. 101，107-12 (199 )。人角化細(xì)胞提取物中檢測到了胱天蛋白酶樣活性，然后發(fā) 現(xiàn)在人角質(zhì)形成細(xì)胞中存在若干種胱天蛋白酶。但是，另有報告稱，典型的促進(jìn)程序性細(xì)胞 死亡的胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶-3、-6和-7，終末分化時不被活化。分化異常往往導(dǎo) 致被稱作“角化不全”的角化層中的核持久存在。角化不全嚴(yán)重破壞皮膚的屏障功能。但 是，何種因子參與脫核過程，另外在角質(zhì)形成細(xì)胞分化中如何調(diào)控該過程，直至今日尚不十 分明確。胱天蛋白酶是已熟知的程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死實行因子，它們是進(jìn)化過程中 保守的半胱氨酸蛋白酶，在天冬氨酸殘基的后方切割底物。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能將哺乳動物 的胱天蛋白酶分為三個亞群，即開始胱天蛋白酶、實行胱天蛋白酶和炎癥性胱天蛋白酶。實 行胱天蛋白酶的重要作用是分解CAD(胱天蛋白酶活化型DNA酶)抑制物ICAD，結(jié)果是使 CAD作為活性核酸酶游離出來(Enari M.等人，Nature 391，43-50 (1998))。胱天蛋白酶活 性受多種分子調(diào)節(jié)。特別是三組與若干種胱天蛋白酶直接復(fù)合的抑制性蛋白質(zhì)。桿狀病毒 抗程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)P35除作用于絲氨酸和其它半胱氨酸蛋白酶12之外，還抑制胱天 蛋白酶 1，-3，-6，-7，-8 和-10 (Zhou Q.等人，Biochemistry 37,10757-65 (1998)) 桿狀 病毒還合成其它抗程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)、程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)抑制物(IAP)。發(fā)現(xiàn)IAP 同源體也存在于哺乳動物中(Verhagen A.M.等人，GenomeBiol. 2，REVIEWS 3009 (2001)) 哺乳動物IAP通過抑制胱天蛋白酶14、或者通過拮抗促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的促進(jìn)因子例如 DIABLO/Smac而阻斷程序性細(xì)胞死亡(Wu G. Nature 408，1008-12 (2000))。細(xì)胞因子應(yīng)答 修飾因子A(Crm Α)為牛痘病毒基因產(chǎn)物，能夠抑制程序性細(xì)胞死亡胱天蛋白酶和炎癥性胱 天蛋白酶(Garcia-Calvo M 等人，J. Biol. Chem. 273，3洸08_13 (1998))。令人感興趣的是， 已教導(dǎo)了 Crm A屬于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族，作為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的一部分， 例如PI-9和PAI-I通過分別與胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶3的相互作用能夠抑制程序性 細(xì)胞死亡(Annand R. R.等人，Biochem. J. 342Pt3，655-65 (1999))。角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分 化是否是程序性細(xì)胞死亡現(xiàn)象的一部分，另外，在此過程中是否有任意的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)參與 等令人感興趣。胱天蛋白酶14是胱天蛋白酶家族的最新成員，發(fā)現(xiàn)存在于專門分化的角質(zhì)形 成細(xì)胞中。胱天蛋白酶14在胱天蛋白酶家族成員間作為同源的EST而鑒定。最新的研 究顯示，角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14經(jīng)加工形成異二聚體，進(jìn)而對胱天蛋白酶1對應(yīng)的 合成底物 Trp-Glu-His-Asp-AFC 顯示酶活性(Mikolajczyk J.等人，Biochemistry 43， 10560-9(2004))。此水解活性對于蛋白質(zhì)分解切割和cosmotropic鹽的存在是必要的。教 導(dǎo)了雖然胱天蛋白酶14的一級結(jié)構(gòu)與炎癥性胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶1、_4和-5極為 相似，但是限定于分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中的胱天蛋白酶14的表達(dá)以其它方式參與角質(zhì)形 成細(xì)胞終末分化(Lippens S.等人，Cell Death Differ. 7，1218-24(2000))。但是，尚不清 楚胱天蛋白酶14的活化機(jī)制、天然底物和調(diào)節(jié)因子。發(fā)明的公開本發(fā)明人以闡明SCCA所參與的表皮生理學(xué)機(jī)制為目的進(jìn)行研究之際有令人驚奇 的發(fā)現(xiàn)，SCCA為具有抑制細(xì)胞程序性死亡作用的抗程序性細(xì)胞死亡因子。
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簡而言之，本發(fā)明人進(jìn)行了皮膚UV防御機(jī)制的研究，明確了由于對人皮膚的UV照 射，棘層和顆粒層中SCCA的表達(dá)有力地增強(qiáng)。然后，在沒有發(fā)現(xiàn)SCCA表達(dá)的3T3細(xì)胞中導(dǎo) 入人SCCA-I和SCCA-2基因，建立穩(wěn)定的表達(dá)體系。在調(diào)查SCCA穩(wěn)定表達(dá)系細(xì)胞由于UV 照射所致程序性細(xì)胞死亡時，發(fā)現(xiàn)在任一 SCCA穩(wěn)定表達(dá)體系中，均顯著減少由UV照射引起 的程序性細(xì)胞死亡。進(jìn)而，通過以pSilencer載體使siRNA在高表達(dá)SCCA的HaCat細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的 RNA干擾法，建立了 SCCA-I和SCCA-2的敲低(siSCCA)細(xì)胞株，細(xì)胞株經(jīng)UV照射后，與對照 株相比，SCCA敲低(knock down)細(xì)胞株的程序性細(xì)胞死亡率顯著增高。根據(jù)以上結(jié)果，本 發(fā)明人可以得出如下結(jié)論，SCCA是具有抑制程序性細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。對于癌癥和牛皮癬等伴隨細(xì)胞增殖和分化異常的疾病，認(rèn)為是由于抑制了癌細(xì)胞 等的程序性細(xì)胞死亡，避免了細(xì)胞死亡，而繼續(xù)異常增殖。因此，在顯示SCCA表達(dá)增強(qiáng)的細(xì) 胞中，具有抗程序性細(xì)胞死亡作用的SCCA抑制該細(xì)胞死亡，作為結(jié)果就是該細(xì)胞的異常增 殖。因此，明確了如果具有程序性細(xì)胞死亡抑制作用的SCCA的表達(dá)受到抑制，就能夠治療 和預(yù)防鱗狀上皮細(xì)胞癌和牛皮癬等伴隨細(xì)胞增殖異常等的疾病。本發(fā)明借鑒上述觀點，以提供治療和預(yù)防伴隨SCCA高表達(dá)細(xì)胞的增殖異常的疾 病，例如癌癥、特別是鱗狀上皮細(xì)胞癌、進(jìn)一步地是牛皮癬等的方法、藥物組合物作為課題。進(jìn)一步地，本發(fā)明闡明了表皮角化不全的機(jī)制，以開發(fā)與現(xiàn)有技術(shù)不同的全新方 法來抑制和治療表皮角化不全的手段作為課題?？紤]到對于伴隨角化不全的特應(yīng)性皮炎、 牛皮癬等皮膚病尚無特效藥物，本發(fā)明對于皮膚科學(xué)、化妝品學(xué)領(lǐng)域的影響巨大。在第一觀點中，本發(fā)明提供了通過抑制細(xì)胞的鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCCA)的表 達(dá)而治療和/或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的疾病的方法。優(yōu)選地，通過對編碼 SCCA的基因?qū)嵤㏑NA干擾而抑制細(xì)胞的SCCA表達(dá)。在更合適的方案中，RNA干擾利用了這 樣的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA由含有序列號1的寡核苷酸或其變體的有義寡核苷酸鏈和含有 序列號2的寡核苷酸或其變體的反義寡核苷酸鏈組成。本文中，上述序列號1的寡核苷酸 的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷酸雜交的序列，而上述 序列號2的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷 酸之互補(bǔ)鏈雜交的序列。在上述觀點的其他方案中，本發(fā)明提供了通過抑制細(xì)胞的SCCA的表達(dá)而治療和/ 或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的疾病的藥物組合物。優(yōu)選地，藥物組合物含有這樣 的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA提供對編碼SCCA的基因進(jìn)行RNA干擾的短鏈RNA。在更為合適的 方案中，上述藥物組合物含有這樣的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA由含有序列號1的寡核苷酸或 其變體的有義寡核苷酸鏈和含有序列號2的寡核苷酸或其變體的反義寡核苷酸鏈組成。本 文中，上述序列號1的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因中第46 66位核苷酸雜交的序列，而上述序列號2的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼 SCCA的基因中第46 66位核苷酸之互補(bǔ)鏈雜交的序列。在合適的方案中，上述雙鏈RNA為在載體中例如在pSilencer載體中含有的形態(tài)。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了 SCCA表達(dá)受到抑制的細(xì)胞的制備方法。優(yōu)選地，通過對編 碼SCCA的基因進(jìn)行RNA干擾而抑制SCCA的表達(dá)。在更合適的方案中，RNA干擾利用了這 樣的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA由含有序列號1的寡核苷酸或其變體的有義寡核苷酸鏈和含有序列號2的寡核苷酸或其變體的反義寡核苷酸鏈組成。本文中，上述序列號1的寡核苷酸 的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷酸雜交的序列，而上述 序列號2的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因第46 66位核苷酸 之互補(bǔ)鏈雜交的序列。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了通過上述方法使SCCA的表達(dá)受到抑制的細(xì) 胞和含有該細(xì)胞的哺乳動物。因此，本發(fā)明提供了用于治療和預(yù)防選自鱗狀上皮細(xì)胞癌和牛皮癬的疾病的方 法、藥物組合物。進(jìn)一步地，在其他觀點中，本申請還包含以下的發(fā)明方案。[1]抑制表皮角化不全的物質(zhì)的篩選方法，所述方法的特征在于以抑制鱗狀上 皮細(xì)胞癌抗原-I(SCCA-I)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的候選物質(zhì)的活性作為指 標(biāo)。[2] [1]的方法，其包括以下測試體系⑴、(2)、(3)(1)測定半胱氨酸蛋白酶的活性，得到其測定值[χ]；(2) i)將候選物質(zhì)與酶活性同等量的前述(1)所述半胱氨酸蛋白酶混合，孵育；然 后ii)在與前述(1)相同的條件下測定該的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶活 性，得出其測定值[y]；以及(3) i)將SCCA-I與等量的( i)中所使用的前述候選物質(zhì)混合，孵育；ii)將該C3)i)孵育混合物與酶活性同等量的前述(1)所述的半胱氨酸蛋白酶混 合，在與前述相同的條件下孵育；然后iii)在與前述(1)相同的條件下測定該(3)ii)的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶 活性，得出其測定值[ζ]；其中，如果滿足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} >0，則確定前述候選物質(zhì) 具有抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的活性，從而選定為抑制表皮角化不 全的物質(zhì)。[3] [2]的方法，以滿足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} > 3 為條件。[4] [3]的方法，以滿足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} > 16 為條件。[5] [1]至W]中任意一項所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是胱天蛋白酶 14。[6] [1]至W]中任意一項所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶。[7]抑制表皮角化不全的皮膚外用組合物，特別是美容學(xué)的皮膚外用組合物，其特 征在于含有選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗 提取物中的1種或幾種生藥作為活性成分。[8] [7]的皮膚外用組合物，其特征在于含有水燭提取物。[9] [7]或[8]的組合物，其中前述表皮角化不全是由牛皮癬引起的。[10] [7]或[8]的組合物，其中前述表皮角化不全是由特應(yīng)性皮炎引起的。[11]通過抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I的胱天蛋白酶14抑制活性而謀求表皮細(xì)胞角化 的正?；?、抑制表皮角化不全的方法。[12] [11]的方法，其通過向表皮涂抹含有選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的1種或幾種生藥作為活性成分的皮膚外 用組合物，抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I的胱天蛋白酶14抑制活性。[13] [12]的方法，其特征在于前述皮膚外用組合物含有水燭提取物。因此，通過本發(fā)明，提供與現(xiàn)有技術(shù)不同的全新方法作為抑制和治療表皮角化不 全的手段成為可能。[14]以選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和 大棗提取物中的一種或幾種生藥作為活性成分的用途，用于制備抑制表皮角化不全的皮膚 外用組合物，特別是美容學(xué)或化妝學(xué)的皮膚外用組合物。[15] [7]的用途，其中前述生藥是水燭提取物。[16] [14]或[15]的用途，其中前述表皮角化不全是由牛皮癬引起的。[17] [14]或[15]的用途，其中前述表皮角化不全是由特應(yīng)性皮炎引起的。附圖簡述

圖1顯示了在露光和非露光部位的表皮中SCCA的表達(dá)。圖2顯示了由UV照射引起的表皮中SCCA表達(dá)的變化。圖3顯示了培養(yǎng)的人角化細(xì)胞中UV照射對SCCA表達(dá)的影響。圖4顯示了對SCCA高表達(dá)細(xì)胞與不表達(dá)SCCA的細(xì)胞，比較由UV照射誘導(dǎo)的程序 性細(xì)胞死亡率。圖5顯示了 SCCA敲低細(xì)胞株的建立。圖6顯示了比較SCCA敲低細(xì)胞和對照細(xì)胞由UV照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡率。圖7顯示了皮膚提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。通過使用H-99抗體和hl4D146抗體，利 用免疫印跡法對酶原和活性胱天蛋白酶-14的存在進(jìn)行分析。應(yīng)用于10 μ g(泳道1，2和 4)和1 μ g(泳道；3)的全皮膚提取物、皮膚等價提取物和角化細(xì)胞提取物。圖8顯示了純化胱天蛋白酶-14的分析。(A)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將自 Superdex 75層析得到的級分第25號轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后考馬斯亮蘭染色。顯示17Kda和 IlKda兩條蛋白質(zhì)條帶。(B)使用H-99、hl4D146和C20抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析。17KDa 條帶對H99抗體和hl4D146抗體二者顯陽性，而IlKDa條帶顯示可被C20抗體識別。圖9顯示了若干種合成抑制物對純化胱天蛋白酶-14的的效果。胱天蛋白酶的肽 抑制物(YVAD，VDVAD, DEVD, VEID，IETD，LEHD, DNLD)、以及半胱氨酸蛋白酶(IAA)和絲氨酸 蛋白酶(AEBSF)的類特異性抑制物與胱天蛋白酶-14進(jìn)行孵育。在1.3M檸檬酸鈉和5mM DTT的存在下，使用WEHD-MCA作為底物，測定殘留的酶活性。進(jìn)行試驗的酶濃度分別為5、 2. 5和1. 25 μ Μ。數(shù)值以重復(fù)測試的平均值表示。圖10 (A)顯示了純化胱天蛋白酶-14對ICAD的切割活性。(B)顯示了使用FL331 抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。顯示3!3Kda和27Kda的切割產(chǎn)物。通過使用10 μ M SCCA-I進(jìn)行 前孵育，ICAD的切割被完全抑制。只有在cosmotrophic鹽存在的情況下，可觀察到ICAD被 分解。使用針對氨基末端的特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與胱天蛋白酶14進(jìn)行延 長的孵育，完整的ICAD分子消失。向混合物中加入SCCA-I，也已經(jīng)檢測不到ICAD分解，經(jīng) 16小時孵育后，仍絲毫未受影響(B)。(C)顯示了在cosmotropic鹽存在的情況下，對合成 的胱天蛋白酶底物的水解活性的調(diào)查結(jié)果。圖11顯示了活性胱天蛋白酶-14和TUNEL陽性細(xì)胞的定位。用H_99抗體㈧、hl4D146抗體(B)和TUNEL(C)對正常人皮膚的薄切片進(jìn)行染色。使用Texas-Red用于檢測 熒光(B)。FITC用于TUNEL，Texas Red用于免疫染色，對TUNEL和胱天蛋白酶實施雙重染 色。圖12顯示了 ICAD和角化不全核的共定位(co-localization)。用抗ICAD抗體 FL331對正常人皮膚的薄切片進(jìn)行染色。下表皮的幾乎所有核對該抗體顯陽性。來自AD患 者皮膚的角化細(xì)胞表在層上的ICAD用抗體進(jìn)行染色時，顯示出不同大小的陽性部位(B)。 通過顯示核簇的碘化丙啶(PI)常常觀察到核染色(C)。相同部位的明視野顯示出表面上的 重疊范圍(D)。重疊圖像明確了 ICAD僅存在于角化不全部位(E)。在明視野中也顯示了核 染色的重疊圖像(F)。圖13顯示了 SCCA-I和角化不全核的共定位。正常的皮膚切片內(nèi)幾乎不可能檢出 SCCA-1。在AD患者皮膚的表在層，顯示了 SCCA-I陽性部位(H)。僅在這些部位上可觀察到 核簇(I)。明視野如(J)所示。顯示了重疊圖像是SCCA-I陽性部位與優(yōu)選地未消化核存在 部位的重疊(K)。還顯示了與SCCA-I染色和明視野相應(yīng)的其他重疊圖像(L)。 用于實施發(fā)明的最佳方式^^^mm / mmt hm^mmmw^本發(fā)明人闡明了 SCCA是具有抑制程序性細(xì)胞死亡作用的蛋白質(zhì)。因此，明確了通 過抑制SCCA的表達(dá)，能夠治療和預(yù)防癌和牛皮癬等伴隨鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原表達(dá)的細(xì)胞 的增殖和分化異常的疾病。鱗狀上皮細(xì)胞癌是位于例如子宮頸、肺、食道、上顎、皮膚等器官 的鱗狀上皮細(xì)胞癌。SCCA是在上述鱗狀上皮癌細(xì)胞和牛皮癬表皮中存在的分子量約45，000的蛋白 質(zhì)。SCCA-I和SCCA-2的氨基酸序列以及編碼它們的核酸序列如Takeda A等人J. Invest. Dermatol. 118，147-154(2002)(見上文)所述。通過多種遺傳學(xué)技術(shù)，例如RNA干擾法、反義RNA *DNA法、肽及RNA *DNA適配子、位 點特異性刪除、同源重組、顯性失活等位基因、胞內(nèi)抗體等多種技術(shù)，可達(dá)到抑制細(xì)胞SCCA 的表達(dá)，特別優(yōu)選地是通過RNA干擾法。RNA干擾法是通過向細(xì)胞導(dǎo)入這樣的雙鏈RNA從而抑制目的基因表達(dá)的方法，所 述雙鏈RNA由包含與編碼部分目的基因的部分mRNA互補(bǔ)的約21至23個堿基對的有義寡 核苷酸鏈和包含與上述部分mRNA同源的約21至23個堿基對的反義寡核苷酸鏈構(gòu)成。由 于該方法是基于源自基因編碼區(qū)的雙鏈RNA的干擾特性，已在線蟲的遺傳學(xué)研究中證明了 具有極好的有用性(Fire等，Nature (1998) 391 :806-811)，也能夠用于在果蠅和哺乳動物 中產(chǎn)生功能缺損表現(xiàn)型。在本方法中體外合成這樣的雙鏈RNA(dsRNA)，所述雙鏈RNA由與SCCA基因適當(dāng) 的目的區(qū)域優(yōu)選地長度約18至23個核苷酸的區(qū)域互補(bǔ)的序列(有義寡核苷酸)和與該有 義序列互補(bǔ)的長度約18至23個核苷酸的序列(反義寡核苷酸)組成。優(yōu)選地，雙鏈RNA 由含有與SCCA基因的第46 66位核苷酸序列之互補(bǔ)序列(ACATGAACTTGGTGTTGGCT T 序 列號1)的有義寡核苷酸和含有與上述第46 66位核苷酸序列同源的序列(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T ；序列號幻的反義寡核苷酸組成。對于所有有義及反義寡核苷酸的長度無特 別限定，例如25個核苷酸或以上至100個核苷酸以下，優(yōu)選地40個核苷酸或以上至80個 核苷酸以下，更加優(yōu)選地50個核苷酸或以上至70個核苷酸以下。
有義寡核苷酸也可以是含有序列號1的寡核苷酸的變體的寡核苷酸。該變體優(yōu)選 地具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷酸雜交的序列。另外，反義 寡核苷酸也可以是含有序列號2的寡核苷酸的變體的寡核苷酸。該變體優(yōu)選地具有在高嚴(yán) 格條件下與編碼SCCA的基因第46 66位核苷酸之互補(bǔ)鏈雜交的序列。文中所述的高嚴(yán) 格雜交條件包括，例如鈉濃度約10至40mM、優(yōu)選地約20mM、溫度約50至70°C、優(yōu)選地約60 至65 °C的條件。獲得的雙鏈RNA可以直接導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞，或者也可以預(yù)先將dsRNA與攜帶啟動子、 終止子等轉(zhuǎn)錄元件的載體連接后導(dǎo)入細(xì)胞。作為載體，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各 種載體，優(yōu)選PSilencer載體(Ambion)。通過向細(xì)胞導(dǎo)入含有上述雙鏈RNA的載體，通過細(xì) 胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生了序列號1(或其變體)的有義鏈和序列號2 (或其變體)的反義鏈以及其 有義鏈和反義鏈連結(jié)的短發(fā)夾RNA(shRNA)。shRNA隨后被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶-切丁酶切割成 約21至23個堿基對的短鏈RNA(short interfering RNA)，復(fù)合體RISC形成后，引起切割 SCCA mRNA的RNA干擾，結(jié)果是通過導(dǎo)入細(xì)胞抑制了 SCCA的表達(dá)。合適地，本發(fā)明中使用SCCA表達(dá)抑制基因例如上述雙鏈RNA和其他抑制SCCA表 達(dá)的基因如反義DNA或RNA、適配子RNA或DNA等(以下簡稱為“SCCA表達(dá)抑制基因”)作 為用于抑制SCCA表達(dá)，結(jié)果預(yù)防和治療牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物組合物的活性成 分。上述SCCA表達(dá)抑制基因通過注射直接施與，也可以通過施與整合有所述基因的載體或 質(zhì)粒的方法而施與患部。作為上述載體可例舉有腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載 體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，通過使用這些病毒載體，能夠更有效地施與SCCA表達(dá)抑制基因。另 外，可以采用向脂質(zhì)體等磷脂小泡內(nèi)導(dǎo)入SCCA表達(dá)抑制基因，施與該脂質(zhì)體的方法。由于 脂質(zhì)體是含有生物分解性材料的閉鎖小泡，通過脂質(zhì)體和基因的混合，使基因保留在脂質(zhì) 體內(nèi)部的水層和脂質(zhì)雙分子層中(脂質(zhì)體-基因復(fù)合體)。然后，該復(fù)合體與細(xì)胞共同培 養(yǎng)，復(fù)合體中的基因攝入至細(xì)胞內(nèi)(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法)。然后，將得到的細(xì)胞按照以下的施與方 法進(jìn)行施與。作為上述藥物組合物的施與方式，除常規(guī)的靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)等全身施與之外，還可 以對存在腫瘤和牛皮癬的各組織進(jìn)行局部施與。進(jìn)一步地，還可采用導(dǎo)管技術(shù)、外科手術(shù)等 組合的施與方式。本發(fā)明的藥物組合物的施與量根據(jù)年齡、性別、癥狀、施與途徑、施與次 數(shù)、劑型不同，由醫(yī)師等決定合適方式。將質(zhì)粒DNA直接向靜脈內(nèi)施與，由于DNA被血液中的DNase等立即分解，使基因表 達(dá)是困難的。因此，使用質(zhì)粒DNA的情況下，優(yōu)選地采用質(zhì)粒的直接注射法。該方法與使用 病毒性載體的方法相比較，由于載體純化簡單，能夠在短時間內(nèi)大量制備、對于導(dǎo)入基因的 大小和注入時的濃度無限制，具備很多優(yōu)勢(Verma I M等人，Nature 389 :239_242，1997)。DNA直接注射法是將經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA在生理鹽水等中溶解，僅將其直接進(jìn)行 肌肉內(nèi)注射即可。其結(jié)果是質(zhì)粒DNA被攝入至注射部位周邊的細(xì)胞中，整合至質(zhì)粒上的 真核生物表達(dá)單元的基因產(chǎn)生表達(dá)，產(chǎn)生該基因產(chǎn)物。關(guān)于DNA直接注射法，現(xiàn)今肌肉 內(nèi)注射正成為主流，也可以向腫瘤內(nèi)(Yang J P等人，Gene. Ther. 3力42巧48，1996)、皮 內(nèi)(HenggeUR 等人，J. Clin. Invest. 97 :2911-2916,1996 ；Choate K A 等人，Hum. Gene. Ther. 8 1659-1665，1997)等直接注射質(zhì)粒 DNA。
肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒DNA為例如將1 μ g至lmg，優(yōu)選地25 μ g至100 μ g的DNA溶解于 50 μ 1的生理鹽水，進(jìn)行注射。由此4至7日后得到表達(dá)的最高值。確認(rèn)SCCA的表達(dá)抑制可通過例如直接測定細(xì)胞中的SCCA的量進(jìn)行。優(yōu)選地，通 過從細(xì)胞中提取RNA，測定編碼SCCA的mRNA的量而確定。本領(lǐng)域公知mRNA提取、其量的測 定，例如通過定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行RNA的定量。另外，可利用SCCA特異性抗體進(jìn) 行SCCA的測定，可通過本領(lǐng)域公知的例如利用熒光物質(zhì)、色素、酶等的免疫染色法，蛋白質(zhì) 印跡法，免疫測定法，例如ELISA法、RIA等多種方法進(jìn)行SCCA的測定。除上述之外，還可 以通過測定SCCA已知的生物活性，測定SCCA的表達(dá)量。除此之外，SCCA的表達(dá)可以通過 原位雜交法和測定其生物活性來確定。通過本發(fā)明抑制SCCA表達(dá)的細(xì)胞優(yōu)選地為表皮細(xì)胞，例如顆粒細(xì)胞、有棘細(xì)胞等 也行。另外，作為具有該細(xì)胞的哺乳動物，除了人之外還有小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、狗、 貓、馬、牛、綿羊、豬、山羊、猿猴等非人哺乳動物。本發(fā)明的動物和細(xì)胞還可以作為如下用途 的模型動物和細(xì)胞，用于例如闡明表皮的UV防御機(jī)能、預(yù)防或抑制UV對皮膚傷害的藥物的 研究/開發(fā)以及篩選。抑制角化不全的物質(zhì)的篩詵方法、通過該方法篩詵到的物質(zhì)和角化不全的抑制方 法牛皮癬是皮膚病中的一種，是以表皮細(xì)胞的增殖/分化異常和炎癥細(xì)胞浸潤為特 征的慢性、再發(fā)性的炎癥性角化不全癥。認(rèn)為牛皮癬除遺傳因素之外還因多種環(huán)境因子而 發(fā)病(Hopso-Havu 等人，British Journal ofDermatology (1983) 109，77-85)。SCCA 是由 染色體18q21. 3上串聯(lián)排列的兩個基因SCCA-I基因和SCCA-2基因編碼。由它們編碼的蛋 白質(zhì)SCCA-I和SCCA-2均為分子量約45，000的蛋白質(zhì)，同源性非常高，但是二者反應(yīng)部位 的氨基酸序列不同，具有不同的功能Gchick等人，J.Biol. Chem. (1997) 27213，1849-55)。本發(fā)明的抑制表皮角化不全的物質(zhì)的篩選方法是以候選物質(zhì)的如下活性為指標(biāo)， 即抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。作為半胱氨酸蛋白酶，理想地是，使用 胱天蛋白酶14是最優(yōu)選的，也可以用其它胱天蛋白酶家族，或者從方便獲取的角度考慮可 以用公知的所有其它半胱氨酸蛋白酶例如木瓜蛋白酶，組織蛋白酶例如組織蛋白酶B、組織 蛋白酶L，菠蘿蛋白酶，無花果蛋白酶等替代。在合適的方案中，上述篩選方法由如下測試體系(1)、(2), (3)組成，其中測試體 系(1)為測試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系；測試體系(2)為僅有候選物質(zhì)存在下，測試半 胱氨酸蛋白酶的活性的體系；測試體系( 為將候選物質(zhì)和SCCA-I預(yù)先孵育，在該孵育混 合物存在下測試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系。由于包括測試體系O)，能知道候選物質(zhì)自 身對半胱氨酸蛋白酶的影響。再者，對測試體系(1)、(2)、(3)的實施順序無特別限制，只要 測試條件相同，也可以在相同日期或不同日期測試。測定半胱氨酸蛋白酶的酶活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，使用作 為半胱氨酸蛋白酶的底物習(xí)慣使用的例如N α -苯甲酰基-L-精氨酸4-硝基苯胺鹽酸鹽 (L-BAPNA)。在特別合適的方案中，該篩選方法可以按照以下的方式進(jìn)行。(1)測試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系在適當(dāng)?shù)臏y試用緩沖液，例如HEPES緩沖液中將半胱氨酸蛋白酶按照所設(shè)定的時間進(jìn)行孵育。然后，添加半胱氨酸蛋白酶的底物例如L-BAPNA，在所設(shè)定的溫度下按照所設(shè) 定的時間進(jìn)行孵育后，使顯色，測定半胱氨酸蛋白酶的酶活性[X]。(2)僅有候選物質(zhì)存在下，測試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系將上述測試用緩沖液和候選物質(zhì)按照所設(shè)定的時間進(jìn)行孵育后，添加半胱氨酸蛋 白酶，在與(1)相同的條件下測定半胱氨酸蛋白酶的活性[y]。求出該半胱氨酸蛋白酶酶 活性[y]相對于上述[χ]的％ {[y]/[χ] χ 100}ο{[y]/[χ] X 100}的值成為衡量上述試驗物質(zhì)具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的 指標(biāo)，即該值越接近100，則表示試驗物質(zhì)具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低。另外，求出 100與上述{[y]/[χ] X 100}值之間的差值{100-[y]/[x]X100}。這種情況下，該值越接近 0，則表示試驗物質(zhì)具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低。(3)測定含有SCCA-1、候選物質(zhì)和半胱氨酸蛋白酶的體系的酶活性將上述測試用緩沖液與SCCA-I混合，然后加入候選物質(zhì)，按照所設(shè)定的時間進(jìn)行 孵育。在與(1)或( 相同的條件下測定半胱氨酸蛋白酶的活性[Z]。求出該半胱氨酸蛋 白酶酶活性[ζ]相對于上述[χ]的％ {[ζ]/[χ] X 100}ο{[ζ]/[χ] X 100}值成為衡量SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性和試驗物 質(zhì)自身具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性總計的指標(biāo)，即該值越接近100，其總抑制活性越 低。最后，求出{[ζ]/[χ] X 100}與{100-[y]/[x]X100}的差值。該差值越大，則在含 有SCCA-1、候選物質(zhì)和半胱氨酸蛋白酶的體系中，SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活 性越低，即提示候選物質(zhì)顯著抑制SCCA-I的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。推定通過上述方法篩選的物質(zhì)具有抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活 性效果，進(jìn)而具有角化不全抑制功能，很有可能作為有效的角化不全抑制劑。這樣的物質(zhì)角化不全抑制功能的確認(rèn)，可應(yīng)于發(fā)生角化不全的皮膚例如模型動物 的皮膚，能夠簡便地觀察治療效果。因此，本發(fā)明的篩選方法作為從眾多候選物質(zhì)例如生藥 中一次篩選出表皮角化不全抑制物的方法是極為有用的。被認(rèn)為是角化不全的癥狀包括例 如牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、汗腔角化癥、日光角化癥、脂漏性角化癥、扁平鱗癬等皮膚疾病，因 此，通過本發(fā)明所述的篩選方法被選出的物質(zhì)對治療/預(yù)防上述皮膚病是有用的。本發(fā)明人通過上述篩選方法探討了各種生藥抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白 酶抑制活性的效果，發(fā)現(xiàn)水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物 和大棗提取物具有如上抑制效果。因此，在其它觀點中，本發(fā)明提供了抑制表皮角化不全的 皮膚外用組合物，其特征在于含有選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、 獼猴桃提取物和大棗提取物中的一種或幾種生藥作為活性成分。這些來自植物的提取物通過如下方式得到，即根據(jù)需要對植物原材料進(jìn)行干燥， 進(jìn)而根據(jù)需要進(jìn)行切細(xì)或粉碎后，通過水性提取劑或有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。作為水性提取 劑可使用例如冷水、溫水、沸水或較之低溫的熱水，另外，作為有機(jī)溶劑可使用例如甲醇、乙 醇、1，3- 丁二醇、醚等，可常溫下或加熱后使用。本發(fā)明所述的外用組合物可以任意選擇使用1種或2種以上的上述提取物。上 述提取物的含量優(yōu)選地為前述外用組合物總量的0. 001 20. 0質(zhì)量％，更為優(yōu)選地為 0.01 10.0質(zhì)量％。特別優(yōu)選地為0. 1 5.0質(zhì)量％。含量不滿0.001質(zhì)量％時，會出現(xiàn)本發(fā)明效果無法充分發(fā)揮的情形；另一方面，含量超過20.0質(zhì)量％時，會出現(xiàn)制劑化困難 而不優(yōu)選。本發(fā)明的外用組合物通過常規(guī)方法制備即可，另外，也可制備單獨的上述提取物， 但是除了上述提取物之外，通常用于化妝品和醫(yī)藥品等皮膚外用劑的成分例如油分、表面 活性劑、粉末、色材、水、保濕劑、增粘劑、醇類、各種皮膚營養(yǎng)劑、抗氧化劑、紫外線吸收齊U、 香料、防腐劑等可以根據(jù)需要適當(dāng)?shù)嘏浜?。此外，也可以適當(dāng)?shù)嘏浜弦叶匪囊宜岫c、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多磷 酸鈉、偏磷酸鈉、葡糖酸等金屬螯合劑，咖啡因、鞣酸、異搏定及其衍生物，甘草提取物、光甘 草定、火棘果實的熱水提取物、各種生藥、醋酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其鹽等的藥劑， 維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等的美白劑，葡萄糖、果糖、甘露 糖、蔗糖、海藻糖等的糖類，視黃醇、視黃酸、視黃醇醋酸酯、視黃醇棕櫚酸酯等的維生素A 類等。本發(fā)明的外用組合物可以作為化妝用品、準(zhǔn)藥品等，特別適合作為化妝用品用于 外表皮膚，其劑型可采用如下多種劑型，水溶液體系、可溶化體系、乳化體系、粉末體系、油 液體系、凝膠體系、軟膏體系、氣溶膠體系、水-油2層體系、水-油-粉末3層體系等。即 如果是基礎(chǔ)化妝品，可以洗面產(chǎn)品，化妝水，乳液，面霜，凝膠，香精(美容液)，面膜，敷面膏 等形式廣泛采用上述多種劑型。另外，如果是化妝用化妝品，可以以粉底等形式，作為洗護(hù) 用品，可以以沐浴液、肥皂等形式而廣泛應(yīng)用。進(jìn)一步地，如果是準(zhǔn)藥品，可以以各種軟膏劑 等形式廣泛應(yīng)用。因此，本發(fā)明的外用組合物采取的形式并不限定于上述劑型和形式。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了通過抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I所具有的胱天蛋白酶14抑制 活性而謀求表皮細(xì)胞角化的正常化，抑制表皮角化不全的方法。被認(rèn)為是角化不全的癥狀 如上所述，可例舉如牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、汗腔角化癥、日光角化癥、脂漏性角化癥、扁平鱗 癬等皮膚疾病。優(yōu)選地，將本發(fā)明的皮膚外用組合物應(yīng)用于皮膚，對其用法、用量無特別限 定，可根據(jù)皮膚外用組合物的劑型和所處置皮膚的角化不全狀態(tài)作出適宜的決定。下面，通過列舉具體實施例，更具體地說明本發(fā)明。并且，本發(fā)明并不受這些實施 例的限制。實施例(ι) m^rr^mm /(Ι-i)免疫組織化學(xué)檢查表皮活組織檢查按照AmeX步驟進(jìn)行(Sato Y等人，Am. J. Pathol.，1 25， 431-435(1986))，用冷丙酮固定后包埋于石蠟中。用二甲苯對切片進(jìn)行脫石蠟處理，用丙 酮，然后用PBS洗滌。然后，用10%正常兔血清(Histofine，Tokyo, Japan)封閉該切片的 非特異性結(jié)合部位。將表皮切片分別與抗SCCA-I單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(稀釋為 1 500)、抗 SCCA-2 單克隆抗體(Santa CruzBiotechnology, CA, USA) (稀釋為 1 500)或抗 SCCA 多克隆抗體(如 TakedaA.等人，J，Invest. Dermatol. 118， 147-154(2002)中記載的方式純化)孵育。用PBS洗滌后，將切片用蘇木精復(fù)染，用DAKO Envision System(DAKOCorp.，CA, USA)進(jìn)行觀察。圖1是收集自非露光部位的上臂部位(人M歲)，臀部(人46歲)，大腿部位(人
1275歲)獲得的表皮，以及自露光部位的頰部(人20歲，76歲)，眼瞼(人82歲)獲得的表 皮作為表皮樣本，使用與SCCA-I和SCCA-2 二者結(jié)合的抗SCCA多克隆抗體作為抗體，進(jìn)行 顯微鏡觀察的結(jié)果。根據(jù)圖1，表明了與非露光部位相比，露光部位的表皮上層中SCCA顯著 增強(qiáng)。但是，即使在露光部位，也沒有發(fā)現(xiàn)基底層中SCCA表達(dá)的增強(qiáng)。圖2是作為表皮樣本，對實施了 UV照射(透射儀T0REXFL205-E-30/DMR(Toshil^a Medical Supply)的人表皮和沒有實施照射的對照表皮中分別的SCCA-I和SCCA-2的表達(dá) 的顯微鏡觀察結(jié)果。分別使用抗SCCA-I單克隆抗體和抗SCCA-2單克隆抗體作為抗體。根 據(jù)圖2，清楚了通過對人表皮照射UV,使SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)均被增強(qiáng)。此外，在皮膚 有棘層和顆粒層中表達(dá)增強(qiáng)顯著。根據(jù)上述內(nèi)容，清楚了如果表皮受到UV照射，在表皮中，尤其是在其有棘層和顆 粒層中SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)被增強(qiáng)。α-ii)定量 PCR 實驗接著，進(jìn)行基因水平確認(rèn)表皮中SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)由于UV照射而被增強(qiáng)的實驗。在角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基(GIBCO，Invitrogen)中，在L-谷氨酰胺和上皮細(xì)胞 生長因子存在下，在高濕度，5% CO2環(huán)境下，于37°C培養(yǎng)人角化細(xì)胞，對集密度為60-70% 的細(xì)胞照射 UVB 0-48 小時。使用透射儀 TOREX FL 205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)，以50mJ/cm2的強(qiáng)度進(jìn)行UVB照射。對照細(xì)胞不進(jìn)行UVB照射。使用Isogen (Nippon Gene)，按照所附的說明書，從上述培養(yǎng)細(xì)胞中分離純化總 RNA。通過定量實時聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)確定SCCA-I和SCCA-2各自的表達(dá)水平。簡而 言之，用 Superscript II Qnvitrogen, Carlsbad，CA)使總 RNA 轉(zhuǎn)變?yōu)?cDNA。用 ABI PRISM 7900HT 測序檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City，CA)，進(jìn)行 40 個 2-步驟 PCR 循 環(huán)，使所述樣本擴(kuò)增。使用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。使用的引物如下所示。SCCA-I 正向引物5' -GTGCTATCTGGAGTCCT-3‘(序列號 3)反向引物5 ‘ -CTGTTGTTGCCAGCAA-3 ‘(序列號 4)Taq Man 探針5' -CATCACCTACTTCAACT-3‘(序列號 5)SCCA-2 正向引物5' -CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3‘(序列號 6)反向引物5 ‘ -TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3 ‘(序列號 7)Taq Man 探針5' -AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3‘(序列號 8)GAPDH
正向引物5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3‘(序列號 9)反向引物5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3‘(序列號 10)Taq Man 探針5 ‘ -AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ‘(序列號 11)使報告色素(6-羧基-熒光素)與Taq Man探針序列的5’末端結(jié)合，然后使淬 火色素(6-羧基-四甲基-羅丹明)整合入其3’末端。圖3中顯示了 UVB照射對培養(yǎng)的人角化細(xì)胞中SCCA表達(dá)的影響的結(jié)果。表明 SCCA-I, SCCA-2均由于UVB照射而增強(qiáng)表達(dá)。因此，清楚了表皮細(xì)胞由于UV照射，在基因 水平上SCCA-I，SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)。研究UV照射中SCCA的作用根據(jù)上述內(nèi)容，清楚了在表皮細(xì)胞中由于受到UV照射，SCCA-I和SCCA-2的表達(dá) 增強(qiáng)。然后，研究了 SCCA-I和SCCA-2在受UV照射的表皮細(xì)胞中起什么作用。(1-iii) SCCA-I和2高表達(dá)細(xì)胞的建立3T3細(xì)胞(由ATCC獲得)是不表達(dá)SCCA-I和2的小鼠胎兒來源的細(xì)胞。以如下 所述方式將編碼SCCA-I或2的基因?qū)氲竭@種細(xì)胞中。用Bam HI 和 Kpn I 雙重消化 SCCA-1 和 SCCA-2 的 cDNA (TakedaA 等人，J. Invest. Dermatol. 118,147-154(2002)) 將其亞克隆到 pTarget 載體中，然后用 Lipofectamine Plus (GIBCO, Invitrogen Corp.)導(dǎo)入到3T3細(xì)胞中。簡而言之，將675 μ 1無血清DMEM培 養(yǎng)基Qnvitrogen Corp.)中的20 μ g cDNA與75 μ 1的Plus試劑混合，于25°C放置15分 鐘。向650 μ 1無血清DMEM培養(yǎng)基中添加Lipofectamine (100 μ 1)，然后將其加入到上述 cDNA-Plus混合物中，然后于25°C放置15分鐘。將該cDNA混合物添加到IOml無血清DMEM 培養(yǎng)基中，然后于37°C，5%C02環(huán)境下在其中培養(yǎng)3T3細(xì)胞4小時。將該培養(yǎng)基換成含有 10% FCSdnvitrogen Corp.)的DMEM培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)過夜。第二天，以500 μ g/ml的終 濃度添加G418 (Calbiochem)。培養(yǎng)期間G418保持在該濃度。每2_3天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng) 4周后，可以分離出若干G418抗性克隆，建立SCCA-I和SCCA-2表達(dá)細(xì)胞系。確認(rèn)導(dǎo)入了編碼SCCA-I的cDNA的細(xì)胞(SCCA-1導(dǎo)入細(xì)胞)特異且穩(wěn)定地表達(dá) SCCA-I,并確認(rèn)導(dǎo)入了編碼SCCA-2的cDNA的細(xì)胞(SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞)特異且穩(wěn)定地表 達(dá)SCCA-2。此外，通過同樣的操作導(dǎo)入了非特異性序列的3T3細(xì)胞(對照細(xì)胞)既不表達(dá) SCCA-I，也不表達(dá) SCCA-2。采用上述SCCA-I導(dǎo)入細(xì)胞、SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞和對照細(xì)胞，對表皮細(xì)胞施與UV照 射時的SCCA-I、SCCA-2所產(chǎn)生的作用進(jìn)行研究。具體而言，研究了 SCCA-I、SCCA-2對于表 皮細(xì)胞中UV誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的作用。在含有10% FCS的DMEM培養(yǎng)基中，在高濕度、5% CO2環(huán)境下，于37°C培養(yǎng)上述各 種細(xì)胞。對集密度為60-70%的細(xì)胞照射UVB 0-48小時。使用透射儀TOREX FL205-E-30/ DMR(Toshiba Medical Supply)，以 50mJ/cm2 的強(qiáng)度進(jìn)行 UVB 照射。對于這些細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡評價，使用FACS COULTER(EPIXXL-MCL, Beckman Coulter)，通過以膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)雙重染色法(Armexin V-FITC試劑盒，Immunotech)作為指標(biāo)的FACS(熒光活性細(xì)胞分選儀)分析來進(jìn)行。結(jié)果如圖4所示。如圖4清楚所示，SCCA-I和SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)因UV照射 引起的程序性細(xì)胞死亡顯著減少。因此，推定SCCA-I和SCCA-2均能夠抑制由UV誘導(dǎo)的程 序性細(xì)胞死亡。為了確認(rèn)這一點，本發(fā)明人接下來通過RNA干擾法建立了 SCCA-I和SCCA-2敲低 的細(xì)胞株，進(jìn)而對于表皮細(xì)胞內(nèi)的SCCA-I和SCCA-2在UV照射中的作用進(jìn)行研究。(1-iv)建立SCCA敲低的細(xì)胞HaCat 細(xì)胞(H. Hans.等人，Experimental Cell Research 239,399-410(1998)) 是高表達(dá)SCCA的人角化細(xì)胞。通過按照RNA干擾法，以pSilencer載體(Ambion)使 siRNA(小干擾性RNA)在這種細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，建立SCCA-I和2敲低的細(xì)胞株。采用pSilencer載體，按照所附說明書構(gòu)建siRNA。詳細(xì)的是，將這樣的雙鏈寡核 苷酸克隆入pSilencer載體的HindIII部位和BamH I位點，所述雙鏈寡核苷酸由含有與編 碼SCCA的基因中第46-66位核苷酸互補(bǔ)的21mer寡核苷酸(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T 序 列號1)的65mer有義寡核苷酸(序列號1 和含有與第46-66位核苷酸同源的21mer寡 核苷酸(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T 序列號2)的65mer反義寡核苷酸(序列號13)組成。 使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，按照所附說明書進(jìn)行對HaCat細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。使用 這樣的雙鏈寡核苷酸制備對照細(xì)胞，所述雙鏈寡核苷酸由與哺乳動物的基因序列不具有顯 著同源性、互補(bǔ)性的兩條寡核苷酸組成。在潮霉素B選擇培養(yǎng)基中對轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)4-6周， 通過進(jìn)行選擇從而獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。為了確認(rèn)SCCA的表達(dá)是否受到抑制，以上述方式， 通過實時PCR測定SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)。有義寡核苷酸(序列號12)GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGAACATGAACTTGGTGTTGGCTTTTTTGGAAA(下劃線部分是同源區(qū)域)反義寡核苷酸(序列號13)AGCTTTTCCAAAAAAGCCAACACCAAGTTCATGTTCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG(下劃線部分是互補(bǔ)性區(qū)域)結(jié)果如圖5所示。確認(rèn)導(dǎo)入了上述siRNA的細(xì)胞中，與對照細(xì)胞相比，SCCA-I和2 的表達(dá)均被抑制(敲低)90%以上。使用上述敲低細(xì)胞和對照細(xì)胞，研究了 SCCA-I和2對表皮細(xì)胞中UV誘導(dǎo)的程序 性細(xì)胞死亡的作用。在角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基中(GIBCO，Invitrogen)，在L-谷氨酰胺和上皮細(xì) 胞生長因子存在下，在高濕度，5% CO2環(huán)境下，于37°C培養(yǎng)上述各種細(xì)胞。對集密度為 60-70%的細(xì)胞照射UVB。使用透射儀TOREX FL 205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply), 以50mJ/cm2的強(qiáng)度進(jìn)行UVB照射。使用FACS COULTER,通過以膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)雙重染色法作為指 標(biāo)的FACS (熒光活性細(xì)胞分選儀)分析來進(jìn)行對于這些細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡評價。結(jié)果如圖6所示。對敲低細(xì)胞進(jìn)行UV照射，結(jié)果表明與對照細(xì)胞中38%的細(xì)胞發(fā)
15生程序性細(xì)胞死亡相反，敲低細(xì)胞中約80%的細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。因此，認(rèn)為SCCA 顯著抑制由UV照射誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。因此，清楚了 SCCA承擔(dān)著表皮細(xì) 胞的UV防御機(jī)制，另外，SCCA是具有程序性細(xì)胞死亡抑制作用的蛋白質(zhì)。 (2)抑制角化不全的物質(zhì)的篩詵方法、通過該方法篩詵出的物質(zhì)和角化不全抑制 方法(2-i)材料和方法材料Ac-WEHD-MCA, Ac-YVAD-MCA, Ac-VDVAD-MCA, Ac-DEVD-MCA, Ac-VEID-MCA, Ac-IETD-MCA、Ac-LEHD-MCA 購自 P印tide Institute, Inc.(日本、大阪府)。芐氧羰基(Z)-YVAD-FMK、Z-VDVSD-FMK、Z-DEVD-FMK,Z-VEID-FMK、Z-IETD-FMK、 Z-LEHD-FMK 及 Z-VAD-FMK 購自 BioVision (Mountain View, CA)。重組胱天蛋白酶 10 購自 BIOMOLResearch Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA)。H-99抗體(SantaCruz Biotechnology, Inc)用于胱天蛋白酶14的酶原形和大亞 單位的檢測。H-99抗體是人胱天蛋白酶14中24-122位氨基酸所對應(yīng)肽產(chǎn)生的抗體，因此， 可與胱天蛋白酶14酶原和其經(jīng)加工的形態(tài)即其大亞單位反應(yīng)。C-20抗體(Santa Cruz)用于胱天蛋白酶14小亞單位的檢測。開裂部位特異性抗 體(hl4D146)為使用對應(yīng)于人胱天蛋白酶14的推測加工部位的合成五肽TVGGD，通過對兔實 施免疫而獲得的。(2-ii) WEHD-MCA水解活性的測定將Mikolajczyk J.等人，Biochemistry 43，10560-9 (2004)所述的方法進(jìn)行或多 或少的變更，以Ac-WEHD-MCA作為底物，測定胱天蛋白酶14的活性。簡而言之，以45 μ L的 0. IM HEPES 緩沖液(ρΗ 7. 5)、0· 06Μ NaCl, 0. 01% CHAPS,5mM DTT、1. 3M檸檬酸鈉和 10 μ M TOHD-MCA制作測試混合物(全部以最終濃度表示)。向該混合物中加入酶樣品(5μ 1)，孵育 10至30分鐘。加入150 μ 1的0. IM —氯代乙酸使反應(yīng)中止，然后，使用Fluoroskan Ascent FL (Thermo Electron Co.，WoIsam, ΜΑ)于355nm激發(fā)波長和460nm發(fā)射波長處進(jìn)行測定。 對抑制物進(jìn)行測試時，將胱天蛋白酶14和肽抑制物室溫下于測試緩沖液中孵育15分鐘，然 后加入5 μ 1的100 μ M WEHD-MCA開始測試。(2-iii)胱天蛋白酶14的純化從正常人的腳后跟部擦取的人角化細(xì)胞(約14g)于玻璃勻漿器中用含有0. 14M NaCl的0. IM Tris-HCKpH 8.0)進(jìn)行提取。15，OOOg離心60分鐘后，得上清液。用 Amicon Ultra (Millipore, ΜΑ)進(jìn)行濃縮，經(jīng)快速脫鹽柱 HR10/10 (Amersham Biosciences) 脫鹽后，將粗產(chǎn)物涂于HiPr印16/10QXL柱。用2 OmM Tris-HCl(pH 8.0)清洗柱子， 經(jīng)0至IM線性NaCl梯度洗脫。通過使用抗胱天蛋白酶14抗體(H-99) (Santa Cruz Biotechnology, CA)和hl4D146抗體的蛋白質(zhì)印跡分析對級分進(jìn)行追蹤。另外，測定各級分 對 Ac-Tyr-Glu-His-Asp-甲基-香豆酰胺(TOHD-MCA) (P印tide Institute, Inc.日本國大 阪)的水解活性。將顯陽性的級分上樣于經(jīng)同樣緩沖液平衡過的Mono Q柱，用最大IM的 NaCl梯度進(jìn)行洗脫。胱天蛋白酶14級分進(jìn)一步地通過Mono S陽離子交換層析分離。用 20mM醋酸緩沖液(pH4. 5)對柱進(jìn)行平衡，然后用0至IM的NaCl梯度進(jìn)行洗脫。將顯陽性 的級分進(jìn)行濃縮，然后將其上樣于經(jīng)25mM乙醇氨(ρΗ 8.3)平衡的層析聚焦MonoP柱。使用46ml Polybuffer (pH 5. 0)，一邊形成pH 8至5的pH梯度，一邊進(jìn)行洗脫。胱天蛋白 酶14使用Superdex 75凝膠層析進(jìn)行最終的純化。蛋白質(zhì)濃度由BioRad Protein Assay Kit(BioRad Lab, Hercules, CA)確定。(2-iv)重組胱天蛋白酶14和SCCA-I的制備

使用正向引物AAGGATCCAATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG(序列號14)和反向引物TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC (序列號 15)通過 PCR 將編 碼胱天蛋白酶14的cDNA從角質(zhì)形成細(xì)胞cDNA中分離并擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆入 PQE-IOODoubleTag 載體(Qiagen，Valencia，CA)中，隨后在大腸桿菌 JM109 中表達(dá)。從牛皮癬cDNA 文庫(Takeda A 等人，J. Invest. Dermatol.，118，147-54(2002)) 中分離 SSCAlcDNA，然后克隆入 pQE30 載體(Quiagen)。通過 Ni-NTA Agarose (Quiagen)和 Mono Q層析純化重組蛋白質(zhì)。(2-v)免疫組織化學(xué)經(jīng)患者同意后，通過外科整形手術(shù)取得人頭皮試驗片。將組織在磷酸緩沖液 (PH7.4)中的4%低聚甲醛(PFA)固定，石蠟包埋。制備薄切片，于4°C放置一晚后與適宜的 抗體一起孵育。使用連接有過氧化物酶的山羊抗兔IgG(Nichirei公司生產(chǎn))作為二次抗 體，與作為顯色試劑的D A B反應(yīng)。進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞和活性胱天蛋白酶的雙重免疫檢測時，使用連接有Texas Red(注冊商標(biāo))色素的抗兔IgG(驢)作為二次抗體。使用熒光素原位細(xì)胞死亡檢測試劑 盒(Roche Diagnostics)，按照制備商提供的說明書實施TUNEL反應(yīng)。進(jìn)行ICAD的蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)分析時，使用抗ICADIgG(FL331，Santa Cruz Biotechnology)禾口 DFF45/ICAD Ab_2(NeoMarkers, Fremont, CA)。有報道稱在活性特應(yīng)性皮炎(AD)患者的皮膚內(nèi)常常觀察到簇化的角化不全 (Sakurai K.等人，J. Dermatol. Sci. 30，37-42 (2002) ；Piloto Valdes, L.等人，Allergol. Immunopathol. (Madr) 18，321-4 (1990))。本實驗中使用非侵入方法研究角化不全皮膚中 ICAD和SCCA-I的定位。從AD或正常志愿者的皮膚收集表在性角化層，然后使用醫(yī)用粘著 劑Aron AlphaA(Sankyo Co.，Tokyo)使其附著于載玻片上。用3%低聚甲醛固定后，將樣 品用0. 1% Triton X-100浸透，之后該樣品用抗ICAD或抗SCCA-I抗體于4°C免疫染色過 夜。分別將Alexa Fluor 400接合型抗兔(ICAD)或抗小鼠IgG(SCCA-I)作為二次抗體，室 溫孵育1小時。為了便于對核進(jìn)行視覺化觀察，將樣品在0. 碘化苯基偶氮二氨基吡啶溶 液中浸潤5分鐘，之后用PBS清洗3次。使用Leica DMLA顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。(2-vi)蛋白質(zhì)印跡分析利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法，通過5至20%梯度的凝膠分離蛋白質(zhì)。電泳后， 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚乙烯賴氨酸二氟化物膜(Immobilon-P、Millipore，Bedford, ΜΑ)上，之 后與含有H-99，hl4D146或C20的抗胱天蛋白酶14抗體一起孵育。使用過氧化物酶標(biāo)記的 抗兔IgG(Sigma)或抗山羊IgG作為二次抗體，之后使用ECL_pIus (Amersham)通過化學(xué)發(fā) 光法使免疫反應(yīng)性蛋白可見。(2-vii)結(jié)果角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14為在Aspim處被加工通過蛋白質(zhì)印跡分析，H-99抗體只能檢測出角化細(xì)胞提取物中的17KDa條帶(圖8)。該結(jié)果與含有未經(jīng)加工的30Kda結(jié)構(gòu)的來自全皮膚或皮膚等價模型的提取物的結(jié)果不 一致。用hl4D146抗體也可識別該17KDa條帶(圖8B)，推測是活性胱天蛋白酶14(pl7)的大 亞單位。這提示在終末分化的最終階段中通過Asp146的開裂完成胱天蛋白酶14的成熟。進(jìn) 一步地，在皮膚等價模型中，也可通過H-99和hl4D146抗體識別30KDa條帶，這提示在Asp146 進(jìn)行了切割。(2-viii)自角 化細(xì)胞提取物制備胱天蛋白酶14角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14的大部分是經(jīng)加工過的結(jié)構(gòu)，因此，推測以活性 型存在(Eckhart L.等人，J. Invest. Dermatol. 115，1148-51 (2000) ；Lippens S.等 人，Cell Death Differ. 7,1218-24(2000) ；Mikolajczyk, J.等人，Biochemistry 43， 10560-9(2004))，從而認(rèn)為人角化細(xì)胞是極好的胱天蛋白酶14純化源。但是，還知道人角 化細(xì)胞含有胱天蛋白酶 1 樣酶(TakahashiT.，J. Invest. Dermatol. 111，367-72 (1998))。 胱天蛋白酶1的底物，例如WEHD-底物能夠被胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶14 二者水解。本 發(fā)明人首先在有無1. 3M檸檬酸鈉和5mM 二硫蘇糖醇存在下，試驗由胱天蛋白酶1引起的水 解TOHD-MCA。明確了在標(biāo)準(zhǔn)胱天蛋白酶測試緩沖液中，盡管WEHD-MCA是胱天蛋白酶1的 極好底物，但存在cosmotropic離子時，胱天蛋白酶1不能水解該底物(數(shù)據(jù)未顯示)。因 此，通過如下3種方法對各個級分進(jìn)行評價，即對TOHD-MCA的水解活性、對H-99的反應(yīng)性 和hl4D146抗體。表1表示連續(xù)層析的結(jié)果。使用HiPrep Q柱進(jìn)行最初的陰離子交換層析 后，收率增加170%，比活性增加約10倍。認(rèn)為以上增加大概是由于將胱天蛋白酶14自內(nèi) 源性抑制物隔離而造成的。蛋白質(zhì)印跡分析顯示級分No. 16至20是含有分子量為17Kda的 H-99且14D146均陽性的條帶。認(rèn)為這些級分也具有TOHD-MCA水解活性。后續(xù)的Mono Q陰離 子交換層析中，如根據(jù)17Kda大小且H-99和hl4D146均陽性的條帶進(jìn)行判斷，級分No. 25至 No. 29含有經(jīng)加工形式的胱天蛋白酶14。只有這些級分顯示有WEHD-MCA水解活性。Mono S 陽離子層析和Mono P層析聚焦對于去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)是有效的，從而使比活性分別增加3. 5 倍和7倍。另外，只有H-99且hl4D146均陽性的級分顯示TOHD-MCA水解活性。Superdex 75 層析最后階段分離出分子量30Kda的峰，該峰與TOHD-MCA水解活性峰一致。SDS聚丙烯酰 胺凝膠電泳法顯示該制備物含有17Kda和IlKDa片段。前者對H-99抗體和hl4D146抗體均 顯陽性，后者被C20抗體識別。以上提示人胱天蛋白酶14作為由大亞單位(17KDa)和小亞 單位(IlKDa)組成的異二聚體被純化。另外，Superdex 75凝膠層析顯示人角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14與其他胱天蛋白 酶不同，是像粒酶B活化型那樣作為單體存在的。表1匯總了胱天蛋白酶14的純化率。以 約IOOmg可溶性蛋白質(zhì)提取物為起始物，可得到11. 8μ g純化蛋白質(zhì)。比活性增加764倍， 收率為9. 1%。
權(quán)利要求
1.抑制表皮角化不全的物質(zhì)的篩選方法，所述方法的特征在于以抑制鱗狀上皮細(xì)胞 癌抗原-I(SCCA-I)的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的候選物質(zhì)的活性為指標(biāo)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其包括以下測試體系(1)、(2)、(3)(1)測定半胱氨酸蛋白酶的活性，得到其測定值[χ]；(2)i)將候選物質(zhì)與酶活性同等量的前述(1)所述半胱氨酸蛋白酶混合，孵育；然后 )在與前述(1)相同的條件下測定該的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶活性，得出其測定值[y]；以及(3)i)將SCCA-I與等量的中所使用的前述候選物質(zhì)混合，孵育； )將該C3)i)孵育混合物與酶活性同等量的前述(1)所述的半胱氨酸蛋白酶混合，在 與前述相同的條件下孵育；然后iii)在與前述(1)相同的條件下測定該(3)ii)的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶活性， 得出其測定值[ζ]；其中，如果滿足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} > 0，則確定前述候選物質(zhì)具有 抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的活性，從而選定為抑制表皮角化不全的 物質(zhì)。
3.權(quán)利要求2所述的方法，以滿足{[z]/[X]X100}-{100-[y]/[X]X100}>3為條件。
4.權(quán)利要求3所述的方法，以滿足{[z]/[X]X100}-{100-[y]/[X]X100}> 16為條件。
5.權(quán)利要求1至4中任意一項所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是胱天蛋白酶14。
6.權(quán)利要求1至4中任意一項所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶。
7.抑制表皮角化不全的皮膚外用組合物，其特征在于含有選自水燭提取物、葡萄提取 物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的1種或幾種生藥作為活性成 分。
8.權(quán)利要求7所述的皮膚外用組合物，其特征在于含有水燭提取物。
9.權(quán)利要求7或8所述的組合物，其中前述表皮角化不全是由牛皮癬引起的。
10.權(quán)利要求7或8所述的組合物，其中前述表皮角化不全是由特應(yīng)性皮炎引起的。
11.抑制表皮角化不全的美容方法，其通過向表皮涂抹含有選自水燭提取物、葡萄提取 物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的1種或幾種生藥作為活性成 分的皮膚外用組合物，抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I的胱天蛋白酶14抑制活性。
12.權(quán)利要求11所述的美容方法，其特征在于前述皮膚外用組合物含有水燭提取物。
全文摘要
在第一觀點中，本發(fā)明提供了通過抑制細(xì)胞的鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCCA)的表達(dá)，治療和/或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的疾病的方法。在其它觀點中，本發(fā)明提供了抑制表皮角化不全的物質(zhì)的篩選方法，所述方法的特征在于以候選物質(zhì)抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原-1(SCCA-1)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的活性為指標(biāo)。
文檔編號C12Q1/37GK102127589SQ20101057924
公開日2011年7月20日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者仲西城太郎, 日比野利彥, 片桐千華 申請人:株式會社資生堂