專(zhuān)利名稱(chēng)：一種中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系ctsc-1及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及ー種中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I及其建立方法。
背景技術(shù)：
I. I舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)病與預(yù)后舌癌是最常見(jiàn)的口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌，常發(fā)生在舌前2/3處。舌癌高發(fā)于東南亞，以印度為最高，年發(fā)生率達(dá)到9. 4/100萬(wàn)。近年來(lái)研究顯示，世界范圍內(nèi)舌癌總發(fā)生率逐步提高，而且有年輕化的趨勢(shì)。由于其發(fā)生部位的組織學(xué)特點(diǎn)以及舌癌的生物學(xué)特性，舌癌使患者舌部運(yùn)動(dòng)受限，導(dǎo)致吞咽、說(shuō)話(huà)、進(jìn)食困難。另外，舌癌易轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。I. 2腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展I. 2. I腫瘤干細(xì)胞理論的提出與發(fā)展傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，腫瘤是一群由體細(xì)胞突變，獲得無(wú)限増殖能力的細(xì)胞組成，但是小鼠致瘤實(shí)驗(yàn)和體外克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，并非所有的腫瘤細(xì)胞都可以増殖。說(shuō)明腫瘤不是ー個(gè)均質(zhì)的個(gè)體，它具有異質(zhì)性，在組織中存在不同的細(xì)胞亞群。腫瘤組織中可能有一部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，這類(lèi)型細(xì)胞被稱(chēng)為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)。腫瘤干細(xì)胞理論最早在白血病中被證實(shí)，1994年Lapidot等通過(guò)FACS利用細(xì)胞表面標(biāo)志⑶34+⑶38-和小鼠致瘤模型中分離出人急性粒細(xì)胞白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)干細(xì)胞，隨后，Bonnet等發(fā)現(xiàn)只有⑶34+/⑶38-白血病細(xì)胞能在非糖尿病重度聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeflcient, N0D/SCID)小鼠體內(nèi)致瘤。2003年，Clarke等第一次將腫瘤干細(xì)胞理論運(yùn)用到實(shí)體瘤中，他們?cè)谌橄侔┲凶C實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)，⑶44+⑶24-/low細(xì)胞只需要100個(gè)便可以致瘤。之后，研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腦腫瘤、肝癌、肺癌等癌癥中也能分離出腫瘤干細(xì)胞，支持了這個(gè)學(xué)說(shuō)。2006年，AACR(American As sociation for Cancer Research)對(duì)腫瘤干細(xì)胞做出了定義腫瘤中具有自我更新能力，井能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。它具有三大特性I、分化能力腫瘤干細(xì)胞在腫瘤中擔(dān)任形成和分化各類(lèi)型腫瘤細(xì)胞的角色，在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，不斷補(bǔ)充所需的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞。2、自我更新能力生成一部分與自己相同的，具有増殖、擴(kuò)張和分化潛能的細(xì)胞，從而維持干細(xì)胞的衡定。3、穩(wěn)態(tài)控制能力調(diào)節(jié)和平衡腫瘤的分化，根據(jù)環(huán)境的刺激對(duì)腫瘤做出調(diào)控。I. 2. 2腫瘤干細(xì)胞在口腔癌中的研究及其應(yīng)用口腔癌同一癌灶組織內(nèi)包含有不同分化程度、不同階段的癌細(xì)胞。有研究證實(shí)，頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌中存在一群具有自我更新、多向分化潛能和有致瘤能力的癌細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞大多處于休眠狀態(tài)，對(duì)放、化療不敏感，是導(dǎo)致手術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)、耐藥強(qiáng)、難治愈的根源，腫瘤干細(xì)胞理論的提出可以使治療的目標(biāo)從腫瘤整體轉(zhuǎn)移至腫瘤干細(xì)胞，提出針對(duì)癌細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞相結(jié)合的綜合性治療策略。腫瘤干細(xì)胞的研究也為腫瘤的研究帶來(lái)了一個(gè)新的思路。I. 3細(xì)胞系的建立建立腫瘤細(xì)胞系是研究腫瘤致關(guān)重要的環(huán)節(jié)。細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域。它是指直接從生物體的組織中分離培養(yǎng)出細(xì)胞，為后續(xù)研究提供穩(wěn)定細(xì)胞系的ー種方法。細(xì)胞系是研究特定細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、調(diào)控特性，細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用，細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用等有效的研究材料。人類(lèi)的第一株連續(xù)細(xì)胞系是1951年由George Otto Gey實(shí)驗(yàn)室建立的子宮頸癌細(xì)胞系(Hela)，這株細(xì)胞系的建立是人體細(xì)胞體外培養(yǎng)的里程碑，Hela細(xì)胞推進(jìn)了細(xì)胞、基因、病毒、疫苗等許多研究領(lǐng)域的進(jìn)程，也加深了人們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的各種特性、研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因和過(guò)程、篩選抗癌藥物等。除了研究細(xì)胞本身的特性和癌癥的發(fā)生發(fā)展外，還應(yīng)用于遺傳、免疫、分化、發(fā)育的研究領(lǐng)域。此外，國(guó)內(nèi)外不少企業(yè)還可以利用細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)各種因子、蛋白等。細(xì)胞的廣泛應(yīng)用推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)的蓬勃發(fā)展。原代培養(yǎng)主要有機(jī)械法和酶消化法。機(jī)械法主要是利用物理剪切，直接將組織剪碎，然后將這些組織小塊貼壁培養(yǎng)的方法。酶消化法是應(yīng)用適當(dāng)?shù)拿噶呀饨M織從而分離出單細(xì)胞，直接懸浮或貼壁培養(yǎng)的方法。用于消化的酶主要有胰蛋白酶、膠原酶、鏈酶蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系的鑒定有以下幾個(gè)方面1、病理切片鑒定世界衛(wèi)生組織(WH0，2005)根據(jù)細(xì)胞和細(xì)胞核的多形性、細(xì)胞分裂狀態(tài)、角化程度等將其分為高、中、低三級(jí)。高分化鱗癌與正常鱗狀上皮類(lèi)似、角化明顯、核分裂相少、細(xì)胞和細(xì)胞核多形性不明顯；中分化鱗癌角化較少見(jiàn)，核分裂相多、細(xì)胞多形性明顯；低分化鱗癌有大量的核分裂相、細(xì)胞多形性明顯、角化非常少見(jiàn)；2、細(xì)胞形態(tài)一般為多角形上皮樣，核質(zhì)比高，核仁清晰個(gè)數(shù)較多，細(xì)胞排列緊密后呈鋪路石樣；3、細(xì)胞間橋粒連接相鄰細(xì)胞之間的膜上有ー塊圓形區(qū)域，負(fù)責(zé)細(xì)胞間的連接、通訊、抵抗外力拉扯，橋粒多見(jiàn)于上皮，皮膚、口腔、食管等處的復(fù)層扁平上皮細(xì)胞間較多，能被膜蛋白酶、膠原酶及透明質(zhì)酸酶所破壞，電鏡下可見(jiàn)致密斑和中間纖絲，上皮細(xì)胞中多是角蛋白絲；4、分子標(biāo)志主要是細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)，特異地表達(dá)于上皮細(xì)胞，是構(gòu)成上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的中間纖絲類(lèi)蛋白質(zhì)，共有20種，CKI-9是偏堿性或中性的II型角蛋白，CK10-20是偏酸性的I型角蛋白，這些角蛋白一般表達(dá)于特定的器官或組織，CK8、CK18、CK19常表達(dá)于單層上皮。鱗狀上皮細(xì)胞癌的上述特征為分析新建立的舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系的生物學(xué)特性提供了理論依據(jù)。第一株舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系建立于1981年，是由日本報(bào)道的，這ー株細(xì)胞系未能使小鼠致瘤。而后1983年在我國(guó)上海報(bào)道建立了一株舌癌Tca8113,1995在我國(guó)香港報(bào)道建立了一株舌癌細(xì)胞系PWH-S1?，F(xiàn)存在American type culture colIection(ATCC)中的舌癌細(xì)胞系共有5株，分別為SCC-15、SCC-4、SCC-25、SCC-9、CAL27，均是20世紀(jì)80年代的，之后鮮有報(bào)道。不同舌癌細(xì)胞的生物學(xué)特性會(huì)存在差異，這種差異源于患者本身和接受治療的方法。有些舌癌的分化度低，惡性程度高；有些舌癌的分化度高，惡性程度低。有些患者在術(shù)前接受化療，因此術(shù)后所得到的細(xì)胞有較高的耐藥性。正是這種差異的存在，使我們對(duì)舌癌的多祥性和復(fù)雜性有了更多的認(rèn)識(shí)，而存在差異的舌癌細(xì)胞系便成為研究舌癌發(fā)生發(fā)展的有效體外模型。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明提供了ー種中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I及其建立方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I的建立方法， 包括如下具體步驟A)采用組織塊貼壁法進(jìn)行舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)；B)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%的時(shí)候進(jìn)行傳代培養(yǎng)；C)將傳代穩(wěn)定的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測(cè)表明細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18、19 ；D)經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)貼壁細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8U8蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-1。所述的中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I的建立方法，步驟A的具體方法為I) I型膠原包被培養(yǎng)皿室溫靜止I小時(shí)以上，IXPBS洗皿一次，待用；2)準(zhǔn)備培養(yǎng)液，放于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘；3)在超凈臺(tái)中取出舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌組織，在酒精中消毒不超過(guò)10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養(yǎng)液中；4)將組織剪成小碎塊，均勻分種入培養(yǎng)皿中，加入適量培養(yǎng)液，使組織一半浸于培養(yǎng)液中；5)置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6)第二天補(bǔ)充適量培養(yǎng)液至稍稍浸沒(méi)組織塊；7)視細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行適當(dāng)換液。所述的中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I的建立方法，步驟B的具體方法為I)棄培養(yǎng)液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；2)加入血清終止消化；3)吹打細(xì)胞，置于離心管中，加入適量的培養(yǎng)液吹打；4)離心 IOOOrpm, 5 分鐘；5)棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打散；6)將細(xì)胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，得到所述中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I。中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I在研究治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。所述的中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I在治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。所述中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I已經(jīng)在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)進(jìn)行保藏。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明建立了中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-1，并用該細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的富集，為研究人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的特性及其治療藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。


圖I、細(xì)胞來(lái)源患者組織切片H&E染色，光鏡下觀察原代細(xì)胞和CTSC-I傳代細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)。圖2、透射電鏡下觀察CTSC-I細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖。圖3、瓊脂糖凝膠檢測(cè)正常頰粘膜細(xì)胞、CAL27舌癌細(xì)胞系、CTSC-I細(xì)胞的CK8、18、19的mRNA的表達(dá)情況；圖4、Western免疫印跡方法檢測(cè)CAL27舌癌細(xì)胞系、CTSC-I細(xì)胞的CK8、18和E-cadherin的蛋白表達(dá)情況。圖5、CTSC-I細(xì)胞染色體顯示；圖6、隨機(jī)選擇計(jì)算了 100個(gè)分散均勻的CTSC-I細(xì)胞染色體后用SSCP統(tǒng)計(jì)所得結(jié)果;圖7、CTSC-I細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)；圖8、CTSC-I細(xì)胞的克隆形成；圖9、CTSC-I細(xì)胞小鼠移植瘤組織切片H&E染色；圖10、免疫熒光檢測(cè) CTSC-I 細(xì)胞系對(duì) CD133，Sox2, Nanog, 0ct4, SSEA-1, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81 的表達(dá)；圖11、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)富集CTSC-I細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞及其形態(tài)學(xué)觀察；圖12、H&E染色CTSC-I球囊細(xì)胞；圖13、CTSC-I球囊細(xì)胞和貼壁細(xì)胞對(duì)CK8、CK18、CK19的表達(dá)；圖14、CTSC-I貼壁細(xì)胞和球囊細(xì)胞在BME中的克隆形成統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖15、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTSC-I球囊細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的干細(xì)胞分子標(biāo)志物表達(dá)的對(duì)比；圖16、用脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法檢測(cè)CTSC-I球囊細(xì)胞的分化能力結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述中國(guó)人舌癌細(xì)胞系CTSC-I的建立方法進(jìn)ー步說(shuō)明。一、舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I的建立以及特性鑒定材料說(shuō)明I臨床標(biāo)本本實(shí)驗(yàn)所用的口腔組織均取自中山大學(xué)附屬光華口腔醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本。2細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)所用的舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞株購(gòu)自ATCC3主要儀器
權(quán)利要求
1.中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I的建立方法,其特征在于,包括如下具體步驟 A)采用組織塊貼壁法進(jìn)行舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)； B)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%的時(shí)候進(jìn)行傳代培養(yǎng)； C)將傳代穩(wěn)定的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測(cè)表明細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子 CK8、18、19 ； D)經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)貼壁細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-1。
2.如權(quán)利要求I所述的中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I的建立方法，其特征在于，步驟A的具體方法為 O I型膠原包被培養(yǎng)皿室溫靜止I小時(shí)以上，IXPBS洗皿一次，待用； 2)準(zhǔn)備培養(yǎng)液，放于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘； 3)在超凈臺(tái)中取出舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌組織，在酒精中消毒不超過(guò)10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養(yǎng)液中； 4)將組織剪成小碎塊,均勻分種入培養(yǎng)皿中，加入適量培養(yǎng)液，使組織一半浸于培養(yǎng)液中； 5)置于370C, 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 6)第二天補(bǔ)充適量培養(yǎng)液至稍稍浸沒(méi)組織塊； 7)視細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行適當(dāng)換液。
3.如權(quán)利要求I所述的中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I的建立方法，其特征在于，步驟B的具體方法為 O棄培養(yǎng)液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化； 2)加入血清終止消化； 3)吹打細(xì)胞，置于離心管中，加入適量的培養(yǎng)液吹打； 4)離心IOOOrpm,5分鐘； 5)棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打散； 6)將細(xì)胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，得到所述中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I。
4.如權(quán)利要求I所述的中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I在研究治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。
5.如權(quán)利要求I所述的中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-I在治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系的建立方法，為研究人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的特性及其治療藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。該建立方法包括如下具體步驟采用組織塊貼壁法進(jìn)行舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%的時(shí)候進(jìn)行傳代培養(yǎng)；將傳代穩(wěn)定的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測(cè)表明細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18、19；經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)貼壁細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國(guó)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-1。
文檔編號(hào)C12N5/095GK102911915SQ20121030687
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者張雁, 賀姮, 張海霞, 汪華 申請(qǐng)人:中山大學(xué)