鏈球菌性乳房炎致病菌可視化lamp檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒，發(fā)明人采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，并根據(jù)鏈球菌屬乳房炎致病菌共有的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物，由此獲得了本發(fā)明。應(yīng)用本發(fā)明的LAMP檢測(cè)試劑盒建立的鏈球菌性乳房炎致病菌檢測(cè)方法，無需昂貴的PCR儀、只需普通水浴鍋，操作方法簡(jiǎn)單且成本低，卻比PCR檢測(cè)有更高的靈敏度；檢測(cè)結(jié)果可視化，肉眼判定即可，不必通過凝膠電泳紫外線分析顯像觀察結(jié)果。本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)所需時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、易交叉污染、操作復(fù)雜等不足，具有比常規(guī)檢測(cè)方法更特異、敏感的特點(diǎn)，適合在基層獸醫(yī)站和奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中進(jìn)行快速檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于鏈球菌性乳房炎致病菌檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]乳房炎是奶牛場(chǎng)中最普遍也是造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一，制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)、乳品加工業(yè)的健康發(fā)展，危害公共衛(wèi)生安全及人類健康，如何有效預(yù)防和控制該病已成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌，這三種病原菌所引起的發(fā)病率占奶牛乳房炎總發(fā)病率的90%以上。奶牛乳房炎的常見鏈球菌屬致病菌(Streptococcus)主要包括無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳鏈球菌(streptococcusdysgalactiae)和乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)等,其中無乳鏈球菌具有高度傳染性，其余鏈球菌多為環(huán)境致病菌，均可引起不同類型、程度的乳房炎，造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估量。致病菌診斷檢測(cè)是乳房炎治療和控制方案的基礎(chǔ)，及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒別致病菌對(duì)治療有直接影響。如鏈球菌性乳房炎致病菌主要對(duì)青霉素、氨芐青霉素和紅霉素敏感，國(guó)外報(bào)道使用羥氨芐青霉素治療效果最好。因此，迫切需要建立一種快速敏感的鏈球菌性乳房炎致病菌檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)早期診斷，從而有助于及時(shí)采取合理有效的治療方案，為控制鏈球菌性乳房炎爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間，提高乳房炎的治愈率，避免因診斷耗時(shí)而造成的進(jìn)一步經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]然而在臨床實(shí)踐中，鏈球菌屬致病菌培養(yǎng)要求條件高、分離鑒定難度大，耗時(shí)長(zhǎng)，傳統(tǒng)病原微生物檢查結(jié)果易出現(xiàn)誤判。以分子生物學(xué)PCR為基礎(chǔ)的多項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)如普通PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、多重PCR，及以抗原檢測(cè)為主的免疫學(xué)檢測(cè)法，方法快捷、靈敏，準(zhǔn)確度較高。但是，這些現(xiàn)代檢測(cè)方法均需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和技術(shù)要求，成本高，不適合基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，難以推廣普及。
[0004]近年來，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(loopmediated isothermal amplification, LAMP)方法在微生物檢測(cè)中的作用日益受到關(guān)注。該方法是由日本學(xué)者Notomi等在2000年建立的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，因具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)時(shí)間短、判定結(jié)果方便、無需昂貴儀器等優(yōu)勢(shì)，已在諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前建立的多數(shù)LAMP反應(yīng)方法多采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像、或反應(yīng)完成后再加入熒光染料來判定結(jié)果，只能分析LAMP反應(yīng)的最終結(jié)果，且存在氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)室的危險(xiǎn)，由于缺乏對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控，很難排除這些干擾因素，因此不能對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出準(zhǔn)確的判定。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外均未見有建立鏈球菌性乳房炎致病菌LAMP可視化檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明建立的LAMP方法不僅敏感度高，特異性強(qiáng)，而且反應(yīng)完成后無需開蓋，直接肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果即可。避免氣溶膠污染，快速得出檢測(cè)結(jié)果，操作簡(jiǎn)便，只需按建立的體系加樣即可，為簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)鏈球菌屬菌帶來便利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、儀器要求低、操作快速簡(jiǎn)便且成本低的鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒，以滿足基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)鏈球菌性乳房炎致病菌的需要。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒，包括反應(yīng)液A，反應(yīng)液A含有IOXBst buffer (等溫反應(yīng)緩存液)、8U/μ IBst DNA聚合酶、IOmM dNTPsUOOniM MgS04、40 μ M的內(nèi)引物1、40 μ M的內(nèi)引物2、5 μ M的外弓丨物 1、5μΜ的外引物2、5Μ甜菜堿Betaine、625yM鈣黃綠素、12.5mM MnCl2 ；10XBst buffer含有 pH8.8200mM Tris-HClUOOmM KCl、IOOmM(NH4) 2S04、20mM MgS04U%Triton X-100 ；
[0008]內(nèi)引物I 序列為 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA，
[0009]內(nèi)引物2 序列為 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG，
[0010]外引物I 序列為 CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA，
[0011]外引物2 序列為 ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
[0012]反應(yīng)液A 每管 23 μ 1，其組成為:2.5 μ IlOXBst buffer、L O μ 18U/μ I Bst DNA聚合酶，3.0 μ IlOmM dNTPs、2y IlOOmM MgS04、0.75 μ 140 μ M 的內(nèi)引物 1、0.75 μ 140 μ M 的內(nèi)引物2、1μ 15μΜ的外引物1、1μ 15μΜ的外引物2、4μ 15Μ甜菜堿Betaine、ly 1625μΜ鈣黃綠素、I μ 112.5mM MnCl2和5 μ I超純水。
[0013]鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒的引物組，包括內(nèi)引物1、內(nèi)引物
2、外引物I和外引物2 ;
[0014]內(nèi)引物I 序列為 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA，
[0015]內(nèi)引物2 序 列為 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG，
[0016]外引物I 序列為 CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA,
[0017]外引物2 序列為 ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
[0018]本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)鏈球菌屬乳房炎致病菌共有的基因保守區(qū)(序列表SEQ.1D.N0.1)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物，由此發(fā)明了用于快速檢測(cè)鏈球菌性乳房炎致病菌的可視化LAMP檢測(cè)試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的LAMP檢測(cè)試劑盒建立的鏈球菌性乳房炎致病菌檢測(cè)方法，僅需通過對(duì)樣本肉湯增菌后水煮法提取DNA，并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，即可檢測(cè)出鏈球菌性乳房炎致病菌。該法無需昂貴的PCR儀、只需普通水浴鍋，操作方法簡(jiǎn)單且成本低，卻比PCR檢測(cè)有更高的靈敏度；檢測(cè)結(jié)果可視化，肉眼判定即可，不必通過凝膠電泳紫外線分析顯像觀察結(jié)果。
[0019]另外,常規(guī)的LAMP方法,需在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行開蓋操作,加入SYBR Green I等突光染料來顯色，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，原因有二 =LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物極易形成氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，從而造成假陽(yáng)性；SYBR Green I等染料同樣會(huì)與引物二聚體結(jié)合顯色，造成結(jié)果誤判。而本發(fā)明使用內(nèi)加鈣黃綠素+氯化錳來替代外加的SYBR Green I等染料，即在配制LAMP反應(yīng)液時(shí)就加入鈣黃綠素和氯化錳，無需在LAMP反應(yīng)完成后再開蓋加入；并且，鈣黃綠素+氯化錳僅僅在發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)才會(huì)出現(xiàn)綠色，故避免了 SYBR Green I等染料所帶來的假陽(yáng)性干擾，具有更好的特異性，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便。
[0020]本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)所需時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、易交叉污染、操作復(fù)雜等不足，具有比常規(guī)檢測(cè)方法更特異、敏感的特點(diǎn)，適合在基層獸醫(yī)站和奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中進(jìn)行快速檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用前景?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0021]圖1是應(yīng)用本發(fā)明鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果圖，圖中:I無乳鏈球菌，2停乳鏈球菌，3乳房鏈球菌，4金黃色葡萄球菌，5大腸埃希氏菌，6蠟樣芽胞桿菌，7枯草芽孢桿菌，8沙門氏菌，9白色念珠菌，N陰性對(duì)照(水)。
[0022]圖2是應(yīng)用本發(fā)明鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)(以無乳鏈球菌DNA為模板)的結(jié)果圖，圖中:1-10分別為不同濃度的無乳鏈球菌 DNA,依次為 526ng/ μ 1、52.6ng/ μ 1、5.26ng/ μ l、526pg/ μ 1、52.6pg/ μ 1、5.26pg/ μ 1、526fg/y 1,52.6fg/y 1,5.26fg/y I 和 0.526fg/μ 1，N 為陰性對(duì)照(水)。
[0023]圖3是PCR方法檢測(cè)鏈球菌性乳房炎致病菌敏感性試驗(yàn)(以無乳鏈球菌DNA為模板)結(jié)果圖，圖中:M為IOObp DNA Marker, 2-10別為不同濃度的無乳鏈球菌DNA，依次為 52.6ng/μ 1、5.26ng/μ l、526pg/μ 1、52.6pg/μ 1、5.26pg/μ l、526fg/μ 1、52.6fg/μ 1、
5.26fg/ μ I 和 0.526fg/ μ I, N 為陰性對(duì)照(水)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下述實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025]Bst DNA聚合酶(大片段)購(gòu)自New England Biolabs公司；PCR試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0026]一、鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒的配制
[0027]反應(yīng)液A 每管 23 μ 1，其組成為:2.5 μ IlOXBst bufferU.0μ I Bst DNA 聚合酶(8U/y 1),3.0μ IlOmM dNTPs、2y IlOOmM MgS04、0.75 μ 140 μ M 的內(nèi)引物 1、0.75 μ 140 μ M的內(nèi)引物2、I μ 15 μ M的外引物1、I μ 15 μ M的外引物2、4μ 15Μ甜菜堿Betaine、I μ 1625 μ M 鈣黃綠素、I μ 112.5mM MnCl2 和 5μ I 超純水。
[0028]其中，IOXBstbuffer 含有 200mM Tris_HCl(pH8.8)、IOOmM KClUOOmM (NH4)2SO4,20mM MgS04、l%Triton X-100 ；
[0029]內(nèi)引物I 序列為 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA (序列表 SEQ.1D.N0.2),
[0030]內(nèi)引物2 序列為 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG (序列表SEQ.1D.N0.3),
[0031]外引物I 序列為 CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA (序列表 SEQ.1D.N0.4),
[0032]外引物2 序列為 ACCATTTCTGTTCCTGCTG (序列表 SEQ.1D.N0.5)。
[0033]二、應(yīng)用本發(fā)明LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鏈球菌性乳房炎致病菌的方法(簡(jiǎn)稱LAMP檢測(cè)法)
[0034]1.核酸的提取
[0035]A.取0.1ml奶樣加入2ml肉湯培養(yǎng)基中，37°C搖床恒溫培養(yǎng)5_8h ；
[0036]B.取Iml增菌液，10000轉(zhuǎn)離心lOmin，棄上清，將殘余液滴吸取干凈；
[0037]C.加入 ΙΟΟμΙ TE 溶液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ρΗ8.0)重懸菌塊，沸水浴20min, 10000r/min離心IOmin,取上清液即可，_20°C保存以備用。
[0038]2.鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP反應(yīng)[0039]以水煮法提取的鏈球菌DNA為模板，在裝有23 μ I反應(yīng)液A的管中加入2 μ I DNA模板，構(gòu)成25 μ I反應(yīng)體系；LAMP反應(yīng)程序如下:63°C反應(yīng)60min，80°C作用5min滅活。直接用肉眼觀察反應(yīng)管顏色變化，若顏色變?yōu)榫G色(翠綠色)，則說明樣品中含有鏈球菌性乳房炎致病菌；如果顏色不變，仍呈桔紅色，說明樣品中不含有鏈球菌性乳房炎致病菌。
[0040]三、LAMP檢測(cè)法的特異性和敏感性試驗(yàn)
[0041]1.特異性試驗(yàn)
[0042]分別以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和白色念珠菌的核酸為模板，以超純水為陰性對(duì)照，按照前述鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。
[0043]結(jié)果見圖1，對(duì)無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(顯示翠綠色)，而對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和白色念珠菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性(顯示桔紅色)。
[0044]2.敏感性試驗(yàn)
[0045]以無乳鏈球菌為例，將無乳鏈球菌DNA按10倍倍比稀釋為526ng/μ 1、52.6ng/μ 1、5.26ng/μ l、526pg/μ 1、52.6pg/μ 1、5.26pg/μ l、526fg/μ 1、52.6fg/μ 1、5.26fg/μ l 和 0.526fg/y l。
[0046]鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)體系和條件按前述進(jìn)行。
[0047]鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)方法檢出限與PCR方法對(duì)比，鏈球菌PCR反應(yīng)組成如下:25μ I反應(yīng)體系中，PCR Mixl2.5μ 1，上游引物 5-ATGGTAGTTAAAGTTGGTATTAACG-3 (序列表 SEQ.1D.N0.6)和下游引物5-TTATTTAGCGATTTTTGCAAAGTAC-3 (序列表 SEQ.1D.N0.7)各 2 μ I (引物濃度為 5 μ Μ)，無乳鏈球菌DNA模板2 μ 1，超純水6.5 μ I。擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再經(jīng)72°C延伸lOmin。
[0048]鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)方法通過肉眼直接觀察結(jié)果，結(jié)果見圖
2。將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖3。鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)限為52.6fg/ μ 1，常規(guī)PCR的檢測(cè)限為526fg/ μ I。LAMP方法敏感性比常規(guī)PCR高10倍。
【權(quán)利要求】
1.一種鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括反應(yīng)液A，所述反應(yīng)液 A 含有 IOXBst buffer、8U/yl Bst DNA 聚合酶、IOmM dNTPs UOOmM MgS04、40yM的內(nèi)引物1、40μΜ的內(nèi)引物2、5μΜ的外引物1、5μΜ的外引物2、5M甜菜堿Betaine、625yM鈣黃綠素、12.5mM MnCl2 ;所述 IOXBst buffer 含有 pH8.8200mM Tris-HClUOOmM KCl,IOOmM(NH4) 2S04、20mM MgS04U%Triton X-100 ； 所述內(nèi)引物 I 序列為 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA， 所述內(nèi)引物 2 序列為 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG， 所述外引物I序列為CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA， 所述外引物2序列為ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述反應(yīng)液 A 每管 23 μ 1，其組成為:2.5μ IlOXBst buffer、1.0 μ 18U/μ I Bst DNA 聚合酶，3.0 μ IlOmM dNTPs、2y IlOOmM MgS04、0.75 μ 140 μ M 的內(nèi)引物 1、0.75 μ 140 μ M 的內(nèi)引物2、1μ 15μΜ的外引物1、1μ 15μΜ的外引物2、4μ 15Μ甜菜堿Betaine、ly 1625μΜ鈣黃綠素、I μ 112.5mM MnCl2和5 μ I超純水。
3.鏈球菌性乳房炎致病菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒的引物組，其特征在于包括內(nèi)引物`1、內(nèi)引物2、外引物I和外引物2 ； 所述內(nèi)引物 I 序列為 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA， 所述內(nèi)引物 2 序列為 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG， 所述外引物I序列為CGTGG`TCAAGTTCTTGCTAA， 所述外引物2序列為ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789410SQ201310673974
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】杜玉蘭, 賀婷, 何寶祥 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)