多價肺炎球菌?b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種多價肺炎球菌?B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，其中每劑量含肺炎球菌莢膜糖50～500μg/ml，B型流感嗜血桿菌莢膜糖10～60μg/ml；肺炎球菌的血清型為以下血清型中的一種或多種：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F或23F。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗安全可靠，穩(wěn)定性好，其應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利說明】
多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及疫苗，具體說，是涉及一種聯(lián)合疫苗，尤其是一種多價肺炎球菌-B型流 感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] -、細(xì)菌性肺炎
[0003] 細(xì)菌性肺炎(BP)是最常見的肺炎，也是最常見的感染性疾病之一。引起B(yǎng)P的病原 菌種類較多，常見的有肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、流感嗜血桿菌、銅綠 假單胞菌等，對兒童及老年人的健康威脅極大。這類疾病的診斷主要依賴于病史及影像學(xué) 檢查，病原分離培養(yǎng)有助于知道選擇抗生素但不夠及時。
[0004] 總體上來說，BP患者通常出現(xiàn)咳嗽、咳痰、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、胸痛等癥狀。肺炎大部分在 影像學(xué)檢查(X線片、CT等)都能發(fā)現(xiàn)如斑片狀浸潤的特征性改變，綠膿桿菌、金黃色葡萄球 菌及馬洪球菌(常表現(xiàn)為單側(cè)肺葉受累）?？梢鸾Y(jié)核樣的空洞樣改變。值得一提的是，流 感嗜血桿菌感染時透視檢查常發(fā)現(xiàn)類似PCP的表現(xiàn)(雙肺彌漫性浸潤），需要通過其他檢查 加以鑒別。目前尚無特異性的血清學(xué)指標(biāo)來診斷相關(guān)性BP，更多的仍是依賴于臨床病史、查 體、影像及纖維支氣管灌洗活檢等方法。其中纖維支氣管灌洗可以直接獲取深部痰液進(jìn)行 細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，從而指導(dǎo)臨床用藥，但由于培養(yǎng)時間過長(患者常已開始經(jīng)驗(yàn)治療）， 其應(yīng)用并不廣泛。其他如分子生物學(xué)檢測技術(shù)檢測感染病原靈敏度較高，而且這類檢驗(yàn)花 費(fèi)較高，在經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)難以推廣。故在患者被感染前進(jìn)行預(yù)防，不失為一種好的應(yīng)對措 施。
[0005] 二、現(xiàn)有技術(shù)的局限性
[0006] 疫苗是人類目前可以徹底消滅某一疾病的唯一武器，接種疫苗被認(rèn)為是最有效、 最經(jīng)濟(jì)的疾病預(yù)防手段。疫苗是指用各類病原微生物制作的用于預(yù)防接種的生物制品。其 中用細(xì)菌或螺旋體制作的疫苗亦稱為菌苗。疫苗分為活疫苗和死疫苗兩種。常用的活疫苗 有卡介苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、鼠疫菌苗等。常用的死疫苗有百日咳菌苗、傷寒菌 苗、流腦菌苗、霍亂菌苗等。接種疫苗是預(yù)防和控制傳染病最經(jīng)濟(jì)、有效的公共衛(wèi)生干預(yù)措 施，對于家庭來說也是減少成員疾病發(fā)生、減少醫(yī)療費(fèi)用的有效手段。據(jù)估計，免疫接種每 年能避免200萬至300萬例因白喉、破傷風(fēng)、百日咳和麻疹導(dǎo)致的死亡。隨著疫苗的種類不斷 增加，為減少接種次數(shù)以及減輕痛苦，人類又開發(fā)出了聯(lián)合疫苗。聯(lián)合疫苗是指由兩種或兩 種以上獨(dú)立的抗原通過物理方法混合后制成的單一疫苗制劑，包括多聯(lián)疫苗和多價疫苗兩 種，這是通過1次接種預(yù)防多種傳染病或同種但不同血清型傳染病的免疫策略，其中多聯(lián)疫 苗可預(yù)防不同的疾病，而多價疫苗可預(yù)防不同亞型或血清型的同種疾病。聯(lián)合疫苗的制備 并不是各種不同抗原成分的簡單混合，聯(lián)合疫苗中各種成分之間所發(fā)生的化學(xué)或物理相互 作用會導(dǎo)致各類抗原免疫原性發(fā)生變化，因此在制備過程中需要解決以下問題：（1)是否會 影響各種抗原的免疫原應(yīng)答效果；（2)不同抗原間是否存在不相容性或相互干擾；（3)不同 抗原成分之間是否會發(fā)生拮抗效應(yīng)；（4)疫苗其他成分(如佐劑等）與各種抗原的混合比例 是否恰當(dāng)。將多種抗原聯(lián)合于同一劑疫苗中，需要在臨床試驗(yàn)中證實(shí)各種組成成分疫苗的 安全性和免疫原性不會明顯降低，而且在一些情況下，必須維持其效力。
[0007] 旁觀者干擾效應(yīng)是指多種多糖結(jié)合疫苗同時免疫，會影響未結(jié)合的抗原或結(jié)合其 他載體蛋白的結(jié)合疫苗的免疫作用?？赡艿臋C(jī)理包括對淋巴結(jié)中有限資源(例如抗原的獲 得途徑、趨化因子、活化信號、濾泡樹突細(xì)胞和濾泡T輔助細(xì)胞等)的競爭，Thl/Th2/Th0平衡 的改變和/或T細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的誘導(dǎo)。不同的疫苗所受到旁觀者干擾效應(yīng)的影響不一樣，乙 肝病毒和Hib的免疫反應(yīng)對此作用最敏感。最可能的假設(shè)就是對T細(xì)胞平衡的要求更嚴(yán)格。 英國自1992年引入Hib結(jié)合疫苗以來，幾乎消滅了Hib感染所引起的疾病。但從1999年起， Hib結(jié)合疫苗在1歲以上兒童中免疫失敗的案例逐年增多。在2000年至2002年間，英國以 DTaP-Hib代替DTwPHib，同時增加 MenC-CRM197，這種干擾效應(yīng)越來越顯著。但在免疫程序中 增加 IPV，能夠增強(qiáng)Hib和HBV的免疫原性。臨床研究結(jié)果顯示，DTaPIPV-HBV/Hib-TT免疫接 種后，Hib 和 HBV 的血清陽轉(zhuǎn)率比 DTaP-IPV/Hib-TT+HBV 低。DTaP-HBV-IPV/Hib-TT 與 PCV7-CRM197同時接種，比DTaP-HBV-IPV/Hib-TT單獨(dú)接種的HBV和Hib-TT的血清陽轉(zhuǎn)率和GMC均略 有降低，這是因?yàn)槭艿搅送瑫r免疫的CRM 197結(jié)合物的影響。對13價肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗的 臨床研究結(jié)果顯示，與DTaP-IPV/Hib (2、3和4個月）+MenC (2和4個月）一起免疫，PCV13-CRM197 組的Hib血清陽轉(zhuǎn)率比PCV7-CRM197組低。對10價肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗(PHiD-CV)的臨床研 究結(jié)果顯示，DTaP-HBV-IPV/Hib-TT+PCV7_CRMi97接種的嬰兒中，HBV的血清陽轉(zhuǎn)率和GMC普 遍高于 DTaP-HBV-IPV/Hib-TT+PHiD-CV。
[0008] 傳統(tǒng)疫苗多數(shù)采用油乳制劑，一般需要加入佐劑以發(fā)揮其免疫效果。但是這些疫 苗在體內(nèi)活性濃度維持的時間比較短，不能夠?qū)崿F(xiàn)可控緩釋的目的，一般需要重復(fù)注射?，F(xiàn) 代疫苗是一種利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，使用抗原通過誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)以預(yù) 防和治療疾病或達(dá)到某種特定的醫(yī)學(xué)目的生物制劑?，F(xiàn)代疫苗比傳統(tǒng)疫苗更安全，但是其 缺少免疫原性。因此，急需發(fā)展有效和安全的免疫佐劑及疫苗黏膜遞送系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于 新一代疫苗中。利用滅活或減毒病原體、細(xì)胞組分(如莢膜多糖)或非活性細(xì)菌毒素組成的 傳統(tǒng)疫苗通?？梢哉T導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體來預(yù)防感染，免疫佐劑在此過程中發(fā)揮著重要的 作用。佐劑是指能增強(qiáng)機(jī)體抗原免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。它主要通過免疫調(diào) 節(jié)(細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的修飾）、抗原遞呈(抗原構(gòu)象的維持）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)、抗 原靶向和儲存等方式誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長期、高效的免疫反應(yīng)，提高機(jī)體保護(hù)能力，同時又減少 免疫物質(zhì)的用量，降低疫苗生產(chǎn)成本。傳統(tǒng)疫苗多為病原體或其裂解物，免疫原性強(qiáng)。但隨 著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗等新型疫苗抗原的純 度越來越高，免疫原性卻通常較弱，需要使用佐劑來提高對抗原的保護(hù)作用。然而目前獲準(zhǔn) 用于人體試驗(yàn)的疫苗佐劑并不多，經(jīng)典的鋁鹽佐劑就是其中之一。鋁鹽佐劑在提高抗體水 平和安全方面已獲得長期的實(shí)踐證實(shí)，但其與許多重組或合成的多肽疫苗抗原共同免疫時 未能激發(fā)有效的免疫應(yīng)答，使之很難滿足新型疫苗發(fā)展的需要。因此，對適用于臨床應(yīng)用的 新佐劑的研究與開發(fā)勢在必行。
[0009] 現(xiàn)有的佐劑主要有兩種類型，即疫苗遞送系統(tǒng)(免疫刺激復(fù)合物、脂質(zhì)體、可生物 降解的聚酯類微球/納米粒)和免疫刺激佐劑(脂多糖、單磷酰質(zhì)體、胞壁酰肽）。目前，抗原 載體遞送系統(tǒng)中研究最多、最成功的是可生物降解的聚酯類納米粒。緩釋微球包裹技術(shù)開 始于20世紀(jì)50年代，首先應(yīng)用于藥物釋放系統(tǒng)的研究。直到1979年，Morris等才首次將這項 技術(shù)應(yīng)用在免疫學(xué)研究，在制備微球疫苗免疫小鼠時發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)可以持續(xù)釋放抗原，刺激 抗體產(chǎn)生，而不會誘發(fā)免疫耐受，微球佐劑也才開始引起人們極大的關(guān)注。由于制備的納米 粒和病原體大小相當(dāng)，能穿過組織間隙，可通過機(jī)體最小的毛細(xì)血管，且納米粒具有生物相 容性、可生物降解性、低毒性、靶向性、藥物定位傳遞以及能使藥物或疫苗抗原長效釋放和 表達(dá)等特點(diǎn)，這不僅可引起全身的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，還可以產(chǎn)生強(qiáng)的局部黏膜免疫反應(yīng)，因 此，可生物降解納米粒已被廣泛應(yīng)用于藥物或疫苗遞送系統(tǒng)和基因治療研究中。微球佐劑 作為抗原的一個穩(wěn)定的隔離載體，發(fā)揮著保護(hù)抗原蛋白的作用，使抗原在體內(nèi)免受溫度、酸 堿、滲透強(qiáng)度、消化液等因素的破壞，而且微球抗原還能避免母源抗體的中和作用，實(shí)現(xiàn)抗 原可控制釋放，產(chǎn)生相當(dāng)于常規(guī)疫苗多次接種激發(fā)的免疫效果，從而延長疫苗免疫期，減少 免疫次數(shù)。目前，常用的可作為納米載體的高分子材料主要有殼聚糖、透明質(zhì)酸以及海藻酸 鈉等。其中，殼聚糖來源廣泛、價格低廉，體內(nèi)不積蓄，無抗原免疫性，生物相容性優(yōu)良等特 點(diǎn)，使其成為一種理想的疫苗佐劑載體。國內(nèi)外已有不少用殼聚糖吸附包裹蛋白、酶和質(zhì)粒 DNA等的報道，許多抗腫瘤藥物和抗炎藥物都已被制成殼聚糖微球/納米粒。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚 糖/質(zhì)粒DNA包裹顆粒通過小鼠皮下注射可引起熒光素標(biāo)記基因的局部表達(dá)，且產(chǎn)生長達(dá)二 十多天的較高的抗體滴度;據(jù)報道，殼聚糖納米粒作為疫苗的載體可以使給藥方法更為簡 便，更容易得到廣泛應(yīng)用;Chew等利用復(fù)凝聚法制備殼聚糖DNA納米?？诜呙?研究表明， 殼聚糖納米粒能促進(jìn)殼聚糖和DNA之間的相互作用，有助于納米粒進(jìn)行基因疫苗的黏膜免 疫;顏承云等采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了 N-琥珀酰殼聚糖納米粒。
[0010] 但由于免疫佐劑是指與抗原同時或預(yù)先應(yīng)用，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對抗 原的特異性免疫應(yīng)答，以增強(qiáng)相應(yīng)抗原的免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型，而本身無抗原性 的物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，如果免疫佐劑不同合適的疫苗配合應(yīng)用，那它們將不能發(fā)揮作用。因此， 選擇合適的疫苗，包括抗原組分、免疫反應(yīng)類型、免疫接種途徑等，可避免負(fù)面作用，并可提 高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種免疫原性比現(xiàn)有技術(shù)更 好的聯(lián)合疫苗，使患者一次可接種肺炎球菌和B型流感嗜血桿菌疫苗，以達(dá)到一次接種，多 次免疫的效果。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0013] 多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，其含有肺炎球菌莢膜糖、B型流感嗜血 桿菌莢膜糖和載體蛋白，載體蛋白用于與莢膜糖共價結(jié)合。
[0014] 優(yōu)選地，肺炎球菌莢膜糖、B型流感嗜血桿菌莢膜糖和載體蛋白的質(zhì)量比為（5~ 25):(1~5):1。
[0015] 優(yōu)選地，肺炎球菌莢膜糖含量為50~500μg/ml。
[0016] 更優(yōu)選地，肺炎球菌莢膜糖含量為100~350μg/ml。
[0017] 更優(yōu)選地，肺炎球菌莢膜糖含量為200μg/ml。
[0018]優(yōu)選地，B型流感嗜血桿菌莢膜糖含量為10~60μg/ml。
[0019] 更優(yōu)選地，B型流感嗜血桿菌莢膜糖含量為15~40μg/ml。
[0020] 更優(yōu)選地，B型流感嗜血桿菌莢膜糖含量為25μg/ml。
[0021] 優(yōu)選地，肺炎球菌的血清型為以下血清型中的一種或多種：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、 9N、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22FS23F。
[0022] 優(yōu)選地，上述聯(lián)合疫苗中與莢膜糖共價結(jié)合的載體蛋白選自破傷風(fēng)類毒素(TT)、 白喉類毒素(DT)、白喉毒素突變體交叉反應(yīng)物質(zhì)197(CRM 197)、肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)、 B群腦膜炎球菌外膜蛋白（MenB-OMP)、流感嗜血桿菌D蛋白（HiD)、綠膿桿菌外毒素 A(PEA)、 大腸桿菌熱敏感腸毒素、肺炎球菌溶血素、百日咳毒素、綠膿桿菌菌毛、淋球菌P-3-2菌毛或 乙型肝炎病毒表面抗原。
[0023] 由于重復(fù)使用載體蛋白在機(jī)體內(nèi)可能會引起干擾作用或產(chǎn)生競爭抑制作用，將直 接影響疫苗對接種人群的免疫效果，發(fā)明人在對現(xiàn)有的載體蛋白進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng) 使用特定的載體蛋白時，將有效避免上述競爭抑制情況的發(fā)生。
[0024]作為一種優(yōu)選實(shí)施方案，上述疫苗的載體為肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)。
[0025]作為本發(fā)明的另一目的是在于提供上述聯(lián)合疫苗的制備方法，包括如下步驟： [0026]步驟al)制備并分離提純載體蛋白；
[0027]步驟bl)向步驟al所得載體蛋白中加入精制B型流感嗜血桿菌莢膜糖；
[0028]步驟cl)向步驟bl所得混合物中加入精制肺炎球菌莢膜糖，其中6B型莢膜糖的加 入質(zhì)量是其余莢膜糖加入質(zhì)量的2倍；
[0029]步驟dl)分離純化步驟cl所得莢膜糖-載體蛋白，得多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿 菌聯(lián)合疫苗原液。
[0030] 本發(fā)明的另一目的，是提供一種多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，其含 有肺炎球菌莢膜糖、B型流感嗜血桿菌莢膜糖、載體蛋白和輔料，載體蛋白用于與莢膜糖共 價結(jié)合。
[0031] 優(yōu)選地，上述疫苗的輔料選自殼聚糖和/或脂質(zhì)體。
[0032]更優(yōu)選地，殼聚糖的脫乙酰度為50%~60%。
[0033] 更優(yōu)選地，脂質(zhì)體粒徑范圍為50nm~lOOOnm。
[0034] 更優(yōu)選地，殼聚糖或脂質(zhì)體與莢膜糖的質(zhì)量比介于5:1和1:5之間。
[0035] 本發(fā)明的另一目的在于提供制備上述疫苗的方法，包括如下步驟：
[0036] 步驟a2)分別精制B型流感嗜血桿菌莢膜糖和肺炎球菌莢膜糖；
[0037]步驟b2)制備并分離提純載體蛋白；
[0038]步驟c2)依次將多糖-殼聚糖偶聯(lián)體與步驟b2所得載體蛋白偶聯(lián)結(jié)合；
[0039]步驟d2)分離純化步驟c2所得偶聯(lián)體，得多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫 苗原液。
[0040]本發(fā)明的另一目的在于提供上述聯(lián)合疫苗的凍干保護(hù)劑，所述保護(hù)劑為單一成分 的蔗糖，且作為疫苗的凍干骨架，換言之，該保護(hù)劑中不含有明膠和/或海藻酸鹽。
[0041 ]更優(yōu)選地，蔗糖的初始濃度不小于60%，優(yōu)選為大于70%。
[0042]更優(yōu)選地，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為不大于20%;較佳地，為4~ 20% ;作為一種較佳的實(shí)施方式，根據(jù)所需制備的疫苗的不同為7~10%、8~10%、10~ 15%或 12~15%;最佳為7%、8%、10%或 12%。
[0043] 更優(yōu)選地，蔗糖選用工業(yè)級分析純或藥用級。
[0044] 作為本發(fā)明的另一目的，是提供疫苗凍干保護(hù)劑的制備方法，包括如下步驟：
[0045] 步驟a3)無菌環(huán)境下，配制高溫滅菌處理的蔗糖母液，將制備完成的疫苗原液加入 蔗糖母液中，混勻制備成含有蔗糖保護(hù)劑的疫苗原液半成品；
[0046] 步驟b3)將步驟a3所得半成品進(jìn)行預(yù)凍；
[0047] 步驟c3)將步驟b3所得預(yù)凍后半成品進(jìn)行干燥，即得凍干疫苗。
[0048] 更優(yōu)選地，步驟b3中預(yù)凍時快速降溫至-55°C~_50°C，維持4h~8h或15h~20h。
[0049] 更優(yōu)選地，步驟c3包括第一階段干燥和第二階段干燥。
[0050] 進(jìn)一步，步驟C3中第一階段干燥時升溫至-45 °C~-33 °C維持40h~96h和/或升溫 至-40 °C ~-30 °C 維持 12h ~22h。
[0051] 相應(yīng)地，作為一種較佳實(shí)施方式，根據(jù)所需制備的疫苗的不同，步驟c23中第一階 段干燥時升溫至-45°C~_40°C，維持50h，再升溫至-40°C~-33°C，維持22h;或升溫至-42°C ~-33°C，維持96h;或升溫至-42°C~_38°C，維持42h，再升溫至-35°C~_33°C，維持16h;或 升溫至-40 °C~-38 °C，維持44h，再升溫至-35 °C~-30 °C，維持14h;亦或升溫至-40 °C~-38 。(：，維持40h，再升溫至-35°C~_30°C，維持12h。
[0052] 更優(yōu)選地，步驟c3中第二階段干燥時設(shè)定不同時間內(nèi)升溫至(TC~30°C，不同升溫 階段繼續(xù)維持18h~32h(根據(jù)水的三相性:壓強(qiáng)，沸點(diǎn)或熔點(diǎn)，溫度是一個相互作用的過程， 不同的升溫速率下，熱輻射速率不同，最后所得到的劑品外觀及水分含量也不相同；同時結(jié) 合蔗糖跟不同病毒會產(chǎn)生不同的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度;通過調(diào)節(jié)審問速率來實(shí)現(xiàn)最優(yōu)值；因此 此處可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)，下同）。
[0053]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：
[0054] 1.該聯(lián)合疫苗是含B型流感嗜血桿菌多糖與多價肺炎球菌多糖的免疫綴合物，其 免疫原性與現(xiàn)有的B型流感嗜血桿菌疫苗或肺炎球菌疫苗相當(dāng)，誘發(fā)的多糖抗體水平為單 獨(dú)的疫苗抗體水平之和，可以在更廣闊的人群中引起免疫應(yīng)答；
[0055] 2.由于采用一種載體蛋白，有效地避免在注射過程中出現(xiàn)的副反應(yīng)；
[0056] 3.脂質(zhì)體可有效保護(hù)抗原直達(dá)靶細(xì)胞，而疫苗原液在被脂質(zhì)體包覆后，改性后的 多糖-殼聚糖偶聯(lián)體上的-CHO可防止脂質(zhì)體在體內(nèi)氧化，有效降低疫苗緩釋率。
[0057] 4.對本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗的凍干劑型的研制不僅有利于增加疫苗保存時間，也 便于疫苗運(yùn)輸，更為適用于其它聯(lián)合疫苗的凍干；
[0058] 5.本發(fā)明提供的技術(shù)方案避免凍干劑型疫苗中含動物源性明膠高分子、食源性海 藻酸鹽組分保護(hù)劑免疫接種引發(fā)過敏反應(yīng)，提供的凍干疫苗易溶性良好、成本低廉、制備容 易、保存方便，凍干后疫苗的穩(wěn)定性、復(fù)溶性均明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)同類產(chǎn)品；
[0059] 6.以蔗糖為疫苗凍干制劑唯一保護(hù)劑和成型劑骨架，可利用工業(yè)級分析純或藥用 級蔗糖殘留雜質(zhì)，成分可控，完全排除過敏源性；
[0060] 7.疫苗制備方法簡單，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要。
[0061] 綜上，本發(fā)明提供的多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗安全可靠，穩(wěn)定性 好，其應(yīng)用前景十分廣闊。
【具體實(shí)施方式】
[0062] 下面結(jié)合實(shí)施例和對比例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。實(shí)施例中出現(xiàn)的 試劑或儀器在【具體實(shí)施方式】中無如特殊說明，均為市售，且按照其說明書進(jìn)行操作，在此不 作贅述。
[0063] 實(shí)施例1-1
[0064] 一、制備B型流感嗜血桿菌莢膜糖
[0065] 1.采用CY培養(yǎng)基對Hib菌株37 °C進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)甲醛滅活，離心取上清后，利 用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)進(jìn)行沉淀。然后用0.5~IM的NaCl對復(fù)合物沉淀進(jìn)行解離， 添加冰乙醇至終濃度25% (v/v)，沉淀核酸，然后加冰乙醇至終濃度75% (v/v)，沉淀得到粗 糖。
[0066] 2.上述粗糖用醋酸鈉溶液溶解，冷酚抽提5-6次，最后超濾濃縮去除苯酚殘留，經(jīng) 75% (v/v)乙醇沉淀得到精糖，置-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0067] 二、制備肺炎球菌多糖
[0068] 1.選取7種血清型(4、68、叭、14、18(：、19?、23?)的肺炎球菌培養(yǎng)；
[0069] 2.分別提純以上各種血清型肺炎球菌中抗原性強(qiáng)的莢膜糖:肺炎球菌滅活后離心 收集上清液，經(jīng)超濾濃縮，根據(jù)各肺炎球菌血清型特性分別加入適量(體積分?jǐn)?shù)為70 %的） 預(yù)冷乙醇，離心收集，得粗糖;將粗制多糖溶于乙酸鈉溶液中，然后按1:2比例以冷酚混勻， 離心去除蛋白，反復(fù)酚提5-6次，收集上清，用蒸餾水透析，透析后液體加2mol/L氯化鈣溶 液，加入乙醇攪拌，離心去除核酸，收集上清，補(bǔ)加乙醇(終濃度80 %攪拌），離心收集沉淀， 用乙醇、丙酮洗滌沉淀，脫水干燥后得精制莢膜糖，置-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0070] 三、制備肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)
[0071 ]將PspA蛋白克隆至大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)并分離純化，具體包括：
[0072] 1.目的基因的優(yōu)化和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0073] 在GenBank中獲取PspA基因序列并進(jìn)行優(yōu)化，加上Hi s標(biāo)簽后進(jìn)行全基因合成，將 合成的序列經(jīng)SacI和NdeI雙酶切后，定向克隆至同樣雙酶切的表達(dá)載體pET_30a( + )中，轉(zhuǎn) 化感受態(tài)大腸桿菌BL2 IStar (DE3)，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取 質(zhì)粒，用NdeI和SacI雙酶切鑒定，并送測序，將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-30a_ rPspA〇
[0074] 2.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
[0075] 復(fù)蘇工程菌以1:100的比例接種2 X LB培養(yǎng)基，在37 °C，237r/min下擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌 體值約為12時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C誘導(dǎo)4h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析離心收 集誘導(dǎo)菌體，加入生理鹽水重懸洗滌2次，以1:10(g/mL)的比例加入05mol/LNaC15mmol/L咪 唑20mmol/LPB(pH7.4)的緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，8000 X g離心40min，收集上清， 于鎳離子層析柱中進(jìn)行純化，按說明書操作純化產(chǎn)物的及分析將載體pET-30a( + )轉(zhuǎn)化的大 腸桿菌BL21Star(DE3)全菌體(對照)和將上步純化樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖 維素膜上，用5%脫脂奶粉搖床輕微振蕩封閉2h;加入His鼠源單抗（1:800稀釋），4°C過夜； TBST清洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG( 1:2000稀釋），室溫孵育Ih;洗滌3次，DAB顯色。
[0076] 四、制備多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗
[0077] 1.制備B型流感嗜血桿菌莢膜糖-載體蛋白綴合物
[0078]將步驟一所得精制B型流感嗜血桿菌莢膜糖以質(zhì)量比5:1的比例加入步驟三所得 肺炎球菌表面蛋白A中。
[0079] 2.制備多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗原液
[0080]將精制肺炎球菌莢膜糖以質(zhì)量比5:1的比例加入上述B型流感嗜血桿菌莢膜糖-載 體蛋白綴合物中，肺炎球菌莢膜糖加入質(zhì)量:B型流感嗜血桿菌莢膜糖加入質(zhì)量為1.5:1。 [0081 ] 3.多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗的分離純化
[0082] 用Superdex200凝膠過濾柱（2.6cmX 60cm)進(jìn)行分離純化，洗脫液為20mM的磷酸緩 沖液(PH7.4)，流速為3mL/min。
[0083] 以制備511^疫苗原液為例，加入莢膜多糖4、9￥、14、19?及23?各4(^，寡糖180 2(^ 及多糖6B 80yg，Hib莢膜糖200yg;PspA蛋白40yg。經(jīng)過凝膠層析柱純化后進(jìn)行高效液相色 譜分析該聯(lián)合疫苗，結(jié)果顯示所有血清型均有明顯的色譜峰，相鄰兩峰之間分離度R> 1.5， 拖尾因子T的范圍為0.95~1.05,并且莢膜糖含量達(dá)到《中華人民共和國藥典》2010版及本 申請
【發(fā)明內(nèi)容】
中的最低要求含量。
[0084] 需要指出的是，由于肺炎球菌蛋白與肺炎球菌莢膜糖是同源的，因此二者之間具 有協(xié)同作用，但本發(fā)明中的蛋白與莢膜糖之間的綴合不僅限于上述氨基還原法，只要是能 實(shí)現(xiàn)該偶聯(lián)結(jié)果的方法均應(yīng)包括在本申請的發(fā)明范圍中。
[0085] 實(shí)施例1-2
[0086] 本實(shí)施例與實(shí)施例1-1的差別僅在于，本實(shí)施例中的多糖添加順序?yàn)橥瑫r添加肺 炎球菌莢膜糖和B型流感嗜血桿菌莢膜糖。順序調(diào)換后B型流感嗜血桿菌莢膜糖無色譜峰， 證明按原比例同時加入肺炎球菌莢膜糖和B型流感嗜血桿菌莢膜糖會形成競爭關(guān)系，影響B(tài) 型流感嗜血桿菌莢膜糖的正常綴合過程，因此無法實(shí)現(xiàn)本技術(shù)方案。
[0087] 實(shí)施例1-3
[0088] 本實(shí)施例與實(shí)施例1-1的差別僅在于，本實(shí)施例中的多糖添加順序?yàn)橄忍砑臃窝?球菌莢膜糖，后添加 B型流感嗜血桿菌莢膜糖。順序調(diào)換后B型流感嗜血桿菌莢膜糖無色譜 峰，證明按原比例先加入肺炎球菌莢膜糖和后加入B型流感嗜血桿菌莢膜糖會形成競爭關(guān) 系，影響B(tài)型流感嗜血桿菌莢膜糖的正常綴合過程，因此無法實(shí)現(xiàn)本技術(shù)方案。
[0089] 實(shí)施例1-4
[0090] 本實(shí)施例與實(shí)施例1-1的差別僅在于，還包括將制備的多價肺炎球菌-B型流感嗜 血桿菌聯(lián)合疫苗進(jìn)行凍干的步驟：
[0091] 五、制備凍干疫苗保護(hù)劑
[0092] 1.配制濃度為70%、經(jīng)121°C滅菌處理15min的蔗糖母液；
[0093] 2.將實(shí)施例1-1所得分離純化的多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗置于無 菌容器內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖母液，使蔗糖濃度至10%，得混勻制備成含有蔗糖保護(hù) 劑的疫苗原液半成品，再分別以1.0ml/瓶的規(guī)格灌裝于西林瓶內(nèi)以進(jìn)行后續(xù)的凍干工藝； [0094] 3.將步驟2所得半成品進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時快速降溫至-55°C，維持15h-20h;
[0095] 4.將步驟4所得預(yù)凍后半成品進(jìn)行第一階段干燥:升溫至-45°C~_40°C維持50h， 升溫至-40°C~_33°C維持22h;
[0096] 5.將步驟4所得第一階段干燥后半成品進(jìn)行第二階段干燥:設(shè)定不同時間內(nèi)升溫 至(TC~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持28h;再制備凍干原液中蔗糖濃度為10%的多價肺炎 球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，凍干疫苗的制備方法可參考現(xiàn)有技術(shù)制備，在此不做贅 述。
[0097] 實(shí)施例1-5
[0098] 本實(shí)施例與實(shí)施例1-1的差別僅在于，制備的肺炎球菌莢膜糖的血清型為：1、5、 68、7卩、利、14、18(：、19卩和23卩。
[0099] 實(shí)施例2-1
[0100] 本實(shí)施例與實(shí)施例1 -1的差別僅在于，步驟四的具體操作為：
[0101] 1.殼聚糖制備
[0102]制備脫乙酰度為55%的殼聚糖，步驟可參考現(xiàn)有技術(shù)，在此不做贅述。
[0103] 2.莢膜糖與殼聚糖共偶聯(lián)
[0104] 0.1 MTBS溶液緩沖液下，4°C、pH8.55-8.60下，將制備的肺炎球菌莢膜糖與B型流感 嗜血桿菌莢膜糖分別與脫乙酰度55%的殼聚糖共反應(yīng)20小時，為保證疫苗有效性，莢膜糖 與殼聚糖質(zhì)量比為1:1 )，反應(yīng)結(jié)束后用透析袋充分透析，除去未反應(yīng)殼聚糖，收集多價肺炎 球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗原液。
[0105] 3.偶聯(lián)體改性
[0106]取步驟2莢膜糖-殼聚糖偶聯(lián)體30mL，攪拌條件下緩慢滴加2mL25%戊二酸，200r/ min攪拌反應(yīng)6小時;反應(yīng)完畢后，用0.0IMPBS洗三次后，定容至30mL，使莢膜糖-殼聚糖偶聯(lián) 體表面未與莢膜糖反應(yīng)的-OH改性為-CHO; N2、4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0107] 4.與PspA載體蛋白共偶聯(lián)
[0108] 0.1 MTBS溶液緩沖液下，4 °C、pH4.0-9.0下，將步驟3所得多價肺炎球菌莢膜糖-殼 聚糖偶聯(lián)體與B型流感嗜血桿菌莢膜糖-殼聚糖偶聯(lián)體與PspA蛋白共反應(yīng)24小時，其中多價 肺炎球菌莢膜糖-殼聚糖偶聯(lián)體:B型流感嗜血桿菌莢膜糖-殼聚糖偶聯(lián)體:PspA蛋白質(zhì)量比 為5:5:2〇
[0109] 5.多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗的分離純化
[0? ?0] 用Superdex200凝膠過濾柱(2.6cmX 60cm)進(jìn)行分離純化，洗脫液為20mM的磷酸緩 沖液(PH7.4)，流速為3mL/min。
[0111] 經(jīng)過凝膠層析柱純化后進(jìn)行高效液相色譜分析該聯(lián)合疫苗，結(jié)果顯示所有血清型 均有明顯的色譜峰，相鄰兩峰之間分離度R> 1.5，拖尾因子T的范圍為0.95~1.05，并且莢 膜糖含量達(dá)到《中華人民共和國藥典》2010版及本申請
【發(fā)明內(nèi)容】
中的最低要求含量。
[0112] 實(shí)施例2-2
[0113] 本實(shí)施例與實(shí)施例2-1的差別僅在于，還包括將制備的多價肺炎球菌-B型流感嗜 血桿菌聯(lián)合疫苗進(jìn)行凍干。
[0114] 實(shí)施例2-3
[0115] 本實(shí)施例與實(shí)施例2-1的差別僅在于，制備的肺炎球菌莢膜糖的血清型為：1、5、 68、7卩、利、14、18(：、19卩和23卩。
[0116] 實(shí)施例3-1
[0117] 本實(shí)施例與實(shí)施例2-1的差別僅在于，步驟四還制備脂質(zhì)體，具體操作可參考現(xiàn)有 技術(shù)，在此不做贅述。使用前取IOOyg脂質(zhì)體與多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗原 液混合均勻后皮下注射。
[0118] 實(shí)施例3-2
[0119] 本實(shí)施例與實(shí)施例3-1的差別僅在于，制備的肺炎球菌莢膜糖的血清型為：1、5、 68、7?、利、14、18(：、19?和23?。使用前取10(^8脂質(zhì)體與多價肺炎球菌-8型流感嗜血桿菌聯(lián) 合疫苗原液混合均勻后皮下注射。
[0120] 保護(hù)及免疫原性試驗(yàn)
[0121] 將上述實(shí)施例制備的聯(lián)合疫苗(凍干疫苗冷藏保存12個月后）以人用劑量稀釋100 倍免疫14-18g的NIH小鼠，每組10只，每一試驗(yàn)疫苗用兩組，皮下注射結(jié)聯(lián)合疫苗，陰性對照 組注射0.5ml無菌生理鹽水，每2周免疫1次，每次0.5ml，共3次。初次免疫后，按照中國藥典 2005版，采用杯法測定平均累計釋放度（％ )，結(jié)果如表1所示;第4周采血，采用ELISA方法檢 測血清抗上述所有莢膜糖的免疫原性;第8周以肺炎球菌和B型流感嗜血桿菌灌胃攻擊，計 算疫苗保護(hù)率，疫苗保護(hù)率（％ )=(對照組發(fā)病率-免疫組發(fā)病率）X 100%。所得陽轉(zhuǎn)率結(jié) 果見表2，滴度見表3，疫苗保護(hù)率見表4。
[0122] 表1


[0130] 注:實(shí)施例1-4和實(shí)施例2-2分別與實(shí)施例1-1和實(shí)施例2-1數(shù)據(jù)無顯著性差異(P> 0.05)，在此不做贅述。
[0131] 弄4
LUIJJ」 ？示上卩」知，I僅明坭識tfJ狀甘墳田NH、」共畝歲W饑保，Ι?摶半邁到j(luò) 以上，d 此采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案得到的聯(lián)合疫苗可顯著誘導(dǎo)B型嗜血桿菌莢膜糖、肺炎球菌 莢膜糖抗體的產(chǎn)生，保護(hù)率高，免疫應(yīng)答效果好。且實(shí)施例3提供的聯(lián)合疫苗的抗原釋放度 明顯慢于其他實(shí)施例，具有較好的緩釋效果。
【主權(quán)項】
1. 多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，其特征在于:含有肺炎球菌莢膜糖、B型 流感嗜血桿菌莢膜糖和載體蛋白，載體蛋白用于與莢膜糖共價結(jié)合。2. 權(quán)利要求1所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于:肺炎球菌莢膜糖、B型流感嗜血桿菌莢膜糖 和載體蛋白的質(zhì)量比為(5~25): (1~5): 1。3. 權(quán)利要求1所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于:肺炎球菌的血清型為以下血清型中的一種 或多種：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22FS23F。4. 權(quán)利要求1所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于:所述疫苗中與莢膜糖共價結(jié)合的載體蛋白 選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、白喉毒素突變體交叉反應(yīng)物質(zhì)197、肺炎球菌表面蛋白A、B 群腦膜炎球菌外膜蛋白、流感嗜血桿菌D蛋白、綠膿桿菌外毒素 A、革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋 白、大腸桿菌熱敏感腸毒素、肺炎球菌溶血素、百日咳毒素、綠膿桿菌菌毛、淋球菌P-3-2菌 毛或乙型肝炎病毒表面抗原。5. 權(quán)利要求4所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于:疫苗的載體為肺炎球菌表面蛋白A。6. -種制備權(quán)利要求1~5任一所述的聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟al)制備并分離提純載體蛋白； 步驟bl)向步驟al所得載體蛋白中加入精制B型流感嗜血桿菌莢膜糖； 步驟c 1)向步驟b 1所得混合物中加入精制肺炎球菌莢膜糖，其中6B型莢膜糖的加入質(zhì) 量是其余莢膜糖加入質(zhì)量的2倍； 步驟dl)分離純化步驟cl所得莢膜糖-載體蛋白，得多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián) 合疫苗原液。7. 多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，其特征在于:含有肺炎球菌莢膜糖、B型 流感嗜血桿菌莢膜糖、載體蛋白和輔料，載體蛋白用于與莢膜糖共價結(jié)合。8. 權(quán)利要求7所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于:輔料選自殼聚糖和/或脂質(zhì)體。9. 權(quán)利要求7所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于:殼聚糖或脂質(zhì)體與莢膜糖的質(zhì)量比介于5: 1和1:5之間。10. -種制備權(quán)利要求7~9任一所述的聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟a2)分別精制B型流感嗜血桿菌莢膜糖和肺炎球菌莢膜糖； 步驟b2)制備并分離提純載體蛋白； 步驟c2)依次將莢膜糖-殼聚糖偶聯(lián)體與步驟b2所得載體蛋白偶聯(lián)結(jié)合； 步驟d2)分離純化步驟c2所得偶聯(lián)體，得多價肺炎球菌-B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗原 液。
【文檔編號】A61K47/26GK106075420SQ201610511433
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】吳克, 艾智武, 劉昊智, 袁軍
【申請人】武漢博沃生物科技有限公司