一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法，通過在CRM197A中加入萬能表位肽P30，并采用基因重組大腸桿菌來生產(chǎn)含有該萬能表位肽的白喉毒素變異體CRM197的A鏈的蛋白載體(簡稱P30CRM197A)；然后將流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵連接至P30CRM197A蛋白載體上形成流行性嗜血桿菌b型多糖-P30CRM197A結合物；采用這種方法獲得的流行性嗜血桿菌b型-P30CRM197A結合物與不含有萬能表位肽的對應蛋白載體CRM197A獲得的流行性嗜血桿菌b型多糖-CRM197A結合物相比較，其免疫原性比對照提高了3-5倍。
【專利說明】一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的 方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法。 【背景技術】
[0002] 當多糖以共價鍵連接至蛋白載體上時，能將半抗原的多糖轉變成全抗原，使得多 糖的免疫原性得到增強。以此方法合成的多糖蛋白結合疫苗已被廣泛地應用于小兒，成功 地預防了包括肺炎球菌，流行性腦膜炎球菌以及流行性嗜血桿菌b型等細菌的感染。
[0003] 用于合成多糖蛋白結合物的蛋白載體有多種，如破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉 毒素變異體CRM197,以及基因重組技術生產(chǎn)的流行性嗜血桿菌表面蛋白D等；但是，由于不 同蛋白的免疫特性，以不同蛋白載體合成的多糖蛋白結合物的免疫原性有差異，動物體免 疫后，對于由不同蛋白載體與同一種多糖合成形成的多糖蛋白結合物，所顯現(xiàn)的多糖免疫 原性也不同。由此可見，采用不同技術生產(chǎn)的蛋白載體，合成出來的多糖蛋白結合物的免疫 原性有差異。
[0004] 進入動物機體內(nèi)后，抗原經(jīng)抗原處理細胞（Antigen Process Cell, APC)處理 后產(chǎn)生表位肽（Epitope) [1]，在和主要組織相容性復合物（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子結合后，進而呈現(xiàn)在APC細胞表面，能夠被T淋巴細胞識別，這是免疫學 通過實驗已經(jīng)得出的結論。現(xiàn)在知道，一個已知表位肽的免疫原性取決于三個因素：
[0005] 第一、適當表位肽的產(chǎn)生；
[0006] 第二，和表位肽結合的主要組織相容性復合物分子的呈現(xiàn)；
[0007] 第三，識別表位肽與主要組織相容性復合物形成的結合物的Τ細胞的呈現(xiàn)。
[0008] 其中，任何一個環(huán)節(jié)的缺少都將導致免疫應答缺失。
[0009] 用小鼠進行的試驗表明，缺乏適當?shù)谋砦浑呐c主要組織相容性復合物形成的結合 物分子是最常導致動物體免疫響應缺失的原因。主要組織相容性復合物具有高度的多形態(tài) 性，已知的表位肽僅通過一個或者幾個等位基因（Alleles)就可結合至主要組織相容性復 合物，而不是全部表位肽片段。另外，有實驗結果顯示，由于抗原處理不適當，或者T細胞耐 受性空缺,也會導致免疫響應的缺失。
[0010] 有實驗表明，破傷風毒素的表位肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (稱為P30)，可和大量 不同的主要組織相容性復合物Class II結合，顯示其能夠被T細胞識別，具有萬能免疫原 性的特性，被稱之萬能表位肽。
[〇〇11] 萬能免疫原性表位肽具有和多個人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子 的同型和異型體結合。這種萬能表位肽和人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子 隨機的結合可用于開發(fā)合成疫苗，因為其能夠激活人群中的大部分個體的獲得性免疫系統(tǒng) 的應答。
[0012] 研究表明，P30表位肽由破傷風毒素的947-967氨基酸序列組成 (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)。在含有該表位肽的蛋白進入機體后，蛋白將被攝入至APC細胞 內(nèi)，被消化降解。但是，這些表位肽將保存完整，在和主要組織相容性復合物結合后，被呈現(xiàn) 在APC細胞表面，并被T細胞識別，這表明萬能表位肽以相同的方式和多種DR分子作用。
[0013] MHC分子是加工后抗原的雜性受體，其功能是在胸腺中的免疫耐受誘導和周邊免 疫響應外來抗原的過程中，來呈現(xiàn)其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必須在呈現(xiàn)大量的表 位肽（容許更好的抗原識別，但更多的消耗T細胞儲備），和少許表位肽（大量的T細胞儲 備，但是少許有效地呈現(xiàn)外來抗原）中達到平衡。也就是說，如果抗原中含有在APC細胞處 理后能夠保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC結合后，就能夠刺激一定量的 T細胞，來建立免疫記憶效應，而這一過程不會消耗過量的T細胞，以避免消耗大量的T細 胞，造成免疫耐受。含有這種表位肽的抗原具有更強的免疫原性，這也就解釋了為什么破傷 風類毒素具有很強的免疫原性的原因。
[0014] 現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的大部分T細胞的刺激表位肽對于不同MHC Class II單體（haplotype) 作用有限，不同動物保存和呈現(xiàn)不同的抗原多肽區(qū)域（印Hopes)來刺激其T細胞。這種T 細胞刺激活性的基因限制阻礙了以合成方法來開發(fā)疫苗，而這種方法對于基因上不同的人 群的應用，應該是非常有效的方法。那些被發(fā)現(xiàn)具有刺激多重小鼠個體和/或與大多數(shù)人 體MHC Class II分子相關聯(lián)的T細胞刺激表位肽，提供了一個設計萬能活化T細胞的有效 途徑。在普通的蛋白抗原中加入萬能表位肽（也稱為萬能T細胞抗原簇）P30,能夠被大多 數(shù)動物的MHC Class II分子識別。這種T細胞抗原簇能夠用于直接誘導T細胞，或提供幫 助B細胞生產(chǎn)針對于弱免疫原的抗體，增強機體獲得性免疫應答的效應。
[0015] 致病性細菌通常能夠表達高分子量，包裹在細菌表面的是莢膜多糖，簡稱多糖。對 于成人來說，莢膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制備疫苗；但是，對于小兒，即2 歲以下的嬰幼兒，莢膜多糖被認為是非依賴于T細胞抗原。實驗顯示，當用作為抗原時，莢 膜多糖可誘導野株或者T細胞缺失小鼠生產(chǎn)多糖特異性IgM抗體的響應；但是，并不誘導 IgM抗體向IgG抗體的轉化。人體實驗也顯示，作為疫苗，多糖可以誘導成人生產(chǎn)保護性抗 體，但無法誘導嬰幼兒的免疫應答；也就是說，在小兒重復免疫莢膜多糖抗原后，無第二次 抗體增強響應，也無法誘導持續(xù)的T細胞記憶。
[0016] 現(xiàn)代免疫學實驗證實，多糖蛋白結合疫苗和純多糖疫苗比較的優(yōu)勢在于，前者能 夠誘導免疫響應。當非依賴T細胞的莢膜多糖共價鍵地連接至載體蛋白而形成的多糖蛋白 結合物，在免疫了哺乳動物后，可誘導T細胞來幫助B細胞產(chǎn)生針對于結合物中的多糖部分 的IgG抗體。因此，多糖蛋白結合物誘導多糖特異性抗體IgM轉化為IgG，記憶B細胞的分 化，以及長期存在的T細胞記憶。
[0017] 流行性嗜血桿菌是一種微小的革蘭氏陰性球菌，目前共有六個在抗原性和生化 特性上不同的莢膜多糖菌株被發(fā)現(xiàn)，分別是a、b、c、d、e、和f ;其中b型（Haemophilus influenzae type b，Hib)在臨床上和免疫學上最重要，是引起兒童患侵襲性細菌疾病，包 括腦膜炎、菌血癥、會厭炎、肺炎、化膿性關節(jié)炎、心包炎和蜂窩炎的主要菌株中，占全部分 離出來菌株的95%。研究表明細菌的致病性主要由菌體表面的幾個結構成分所決定，其中， 最具有致病性的是莢膜多糖。
[0018] 據(jù)免疫前的記錄，在每年5歲以下患有嚴重疾病兒童的中，已確證有300多萬例與 Hib有關，并導致全球大約40萬人死亡。在美國，Hib感染是引起兒童細菌性腦膜炎的首要 原因，資料顯示，每年至少有20, 000個侵襲性細菌疾病病例；據(jù)估計，每200個兒童中，有1 個兒童會在他的5歲以下年紀時患1次由于Hib感染導致的疾病。在流行的高峰年，發(fā)病 率可和和脊髓灰質(zhì)炎發(fā)病率相同，如美國在1951年-1955年間，有10, 000到21，000個病 例被報告，其中死亡為1，〇〇〇到31，00,超過了腦膜炎球菌和肺炎球菌發(fā)病率的幾倍。
[0019] 當前臨床醫(yī)生在治療Hib感染患者時所面臨的可能難題之一就是耐藥性的出現(xiàn)， 氨芐青霉素一直是主要用于治療Hib感染的抗菌素，到上世紀70年代中期，第一例Hib耐 藥菌株出現(xiàn)后，開始廣泛地擴散，根據(jù)世界地區(qū)的不同，被分離到的耐藥菌株占5% -50%。 特別令人擔憂的是氯霉素抗藥株和氨芐青霉素-氯霉素抗藥株的出現(xiàn)，現(xiàn)有報道，在西班 牙臨床上分離到耐藥菌株中50%的有耐氨芐青霉素-氯霉素。由此可見，Hib對抗生素耐 藥性的增加突顯了預防的重要性，進行流行性嗜血桿菌b型疫苗的開發(fā)是對全世界兒童的 健康成長具有極大的意義。
[0020] 流行性嗜血桿菌b型多糖結合疫苗在預防嚴重的傳染病中，發(fā)揮了巨大的作用。 不過，不同品種的Hib多糖結合疫苗的免疫原性變異性較大，其原因除了是由于采用了不 同合成方法的結果外，不同蛋白載體的使用，也是導致其免疫原性差異的主要原因。在某些 高危人群中，比如小兒、老年人或免疫功能低下人，低免疫原性的Hib多糖結合疫苗的免疫 效果不佳，保護性受到限制。因此，開發(fā)出免疫原性更強的流行性嗜血桿菌b型多糖結合疫 苗，仍然是該領域努力的方向。
[0021] 將衍生后的莢膜多糖共價鍵連接到一種蛋白載體上的技術，是上世紀80年代開 發(fā)的制備Hib-蛋白結合疫苗的頂峰。在應用于2歲以下的兒童中，該疫苗能夠?qū)⒃诖碳C 體免疫系統(tǒng)應答的非依賴T-細胞莢膜多糖抗原，轉變成依賴性T-細胞多糖-蛋白結合物。 這種Hib-蛋白結合物的安全性和有效性已經(jīng)在臨床試驗中得到了印證，甚至在和其它疫 苗聯(lián)用時也得到了證明。
[0022] 目前臨床上使用的Hib多糖蛋白結合疫苗的生產(chǎn)是采用純化的Hib莢膜多糖和蛋 白載體進行共價鍵的結合來制備，常用的蛋白載體部分種類包括破傷風類毒素、白喉類毒 素、白喉毒素突變體CRM197。試驗證明，采用這些蛋白載體合成的Hib莢膜多糖蛋白結合物 的主要原因是，這些蛋白是在人體上長期使用的疫苗或者類似物，安全、無毒；并且，合成后 的結合物免疫原性好。
[0023] 本發(fā)明是將Hib莢膜多糖與基因重組技術表達的，帶有P30萬能表位肽的白 喉毒素變異體P30CRM197A以共價鍵的形式連接而形成的Hib-P30CRM197A結合物。該 方法合成的疫苗不同于傳統(tǒng)多糖蛋白結合疫苗在于，通過加入P30萬能表位肽來增強 Hib-P30CRM197A結合物的免疫原性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0024] 本發(fā)明的目的是提供一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原 性的方法，先在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (簡稱P30)，通過基因重組工程菌來生產(chǎn)含有P30的CRM197A 蛋白載體（簡稱P30CRM197A);然后將流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵形式連接到 P30CRM197A蛋白載體上形成流行性嗜血桿菌b型多糖-P30CRM197A結合物。所獲得的 Hib-P30CRM197A結合物與不帶萬能表位肽P30的蛋白載體合成的Hib-CRM197A結合物比 較，該結合物的Hib多糖抗體滴度提高了 3-5倍。
[0025] 本發(fā)明采取的技術方案如下：
[0026] 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (簡稱P30)，通過基因重組工程菌來生產(chǎn)含有P30的CRM197A蛋白 載體（簡稱 P30CRM197A);
[0027] 步驟二：將流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵形式連接到P30CRM197A蛋白載體 上形成流行性嗜血桿菌b型多糖-P30CRM197A結合物。
[0028] 進一步，在所述含有P30CRM197A的蛋白載體中含有X個P30，l彡X彡3。
[0029] 進一步，在P30CRM197A蛋白載體中，P30連結在CRM197A蛋白的N-末端或C-末 端，或者同時連接在N-末端和C-末端。
[0030] 進一步，在P30CRM197A蛋白載體中，所述P30與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG 氨基酸序列進行連接。
[0031] 進一步，所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
[0032] 進一步，所述流行性嗜血桿菌b型多糖是通過培養(yǎng)流行性嗜血桿菌b型菌獲得的 莢膜多糖。 【具體實施方式】
[0033] 下面舉例說明本發(fā)明的具體實施方法，但不局限于以下實例。
[〇〇34] 本發(fā)明的實施方法是用基因重組的方法，在大腸桿菌工程菌表達系統(tǒng)中， 對CRM197A蛋白載體和帶有萬能表位肽P30的CRM197A蛋白載體進行表達并純化；然 后，將流行性嗜血桿菌b型莢膜多糖（簡稱Hib)共價鍵地連接至P30CRM197A，制備出 Hib-P30CRM197A結合物；配制成疫苗后，免疫小白鼠，采血獲得免疫血清；用ELISA方法檢 測小白鼠血清中的多糖特異性抗體滴度，以評估多糖蛋白結合物的免疫原性。
[0035] 步驟一：蛋白載體和流行性嗜血桿菌b型莢膜多糖的制備
[0036] 為說明本發(fā)明的有效性，制備了兩種載體蛋白，即含有P30的蛋白載體 P30CRM197A和不含P30的蛋白載體CRM197A。其中，CRM197A蛋白載體是用于合成對照用 流行性嗜血桿菌b型多糖-CRM197A結合物樣品。
[0037] -、CRM197A蛋白載體和P30CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0038] 1、CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0039] 白喉毒素是由帶有白喉毒素基因的β噬菌體在白喉桿菌內(nèi)表達，在細菌胞漿中 存在形式為多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62, 000道爾頓。其氨基酸序列如下：
[0040] MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQG NYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTE EFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSS LSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAG ANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVD IGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPI AGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISS DSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0041] 當分泌至細菌體外前，多肽N-末端的25個引導氨基酸序列被切除掉，變成了由 535個氨基酸組成、分子量為58kD的單鏈多肽而分泌至細菌體外，其氨基酸序列如下：
[0042] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDffDVIRDKTKTKIESLKEH GPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKT TAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNR PAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNG RKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFF EIKS
[0043] 分泌至細菌體外的白喉毒素被酶切為A鏈和B鏈，其間由一個二硫鍵連接而形成 一個蛋白分子這兩個多肽鏈具有不同的功能，A鏈為白喉毒素蛋白分子的N-末端片段，分 子量為21kD，由193個氨基酸組成，是白喉毒素的毒性功能部分。它是通過在真核生物細 胞漿內(nèi)，將二磷酸三腺苷核糖（ADP-Ribosyl)的異檸檬酸脫氫酶（NAD+)部分轉移至延伸因 子2(Elongation Factor-2, EF-2)上，從而抑制細胞中的蛋白質(zhì)合成，進而抑制細胞生長， 造成細胞傷亡。B鏈為白喉毒素蛋白分子的C-末端片段，分子量大約為37kD，由342個氨 基酸組成。B鏈的功能是識別敏感細胞表面的特異性受體，將白喉毒素吸附在敏感細胞上， 幫助A鏈進入細胞內(nèi)。
[0044] 白喉毒素的A鏈具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下：
[0045] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0046] 研究發(fā)現(xiàn)[3]，由于β噬菌體上的毒素基因 tox的突變，對于噬菌體的復制沒有影 響，但是，合成出來的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突變體（Cross Reacting Material，CRM)，但是白喉毒素突變體的血清學免疫原性仍然和毒素相關聯(lián)。比 如，白喉毒素突變體CRM197,無白喉毒素的毒性，從氨基酸序列分析來看是由于A鏈中的第 52位氨基酸，由甘氨酸（Gly)突變成谷氨酸（Glu)，其氨基酸序列如下：
[0047] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0048] 試驗研究表明，與其它現(xiàn)在市場上用于肺炎球菌結合疫苗合成的蛋白載體比較， 白喉毒素變異體CRM197蛋白A鏈多肽具備以下一些優(yōu)勢，如其免疫原性和白喉毒素及白喉 內(nèi)毒素相關聯(lián)，分子量小，水溶性高，易于生產(chǎn)和進行大分子合成反應。長期的白喉類毒素 疫苗的臨床使用，已經(jīng)證明其安全性和有效性。
[0049] 2、含有P30萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0050] 將萬能表位肽P30連接至CRM197A蛋白載體上，構建出一種新的用于合成多糖蛋 白質(zhì)結合物的蛋白載體。所用的萬能表位肽P30可連接至CRM197A蛋白載體的N-末端或 C-末端；也可將兩個不同的萬能表位肽分別連接至CRM197A蛋白載體的N-末端或C-末 端；另一種方式是將兩個萬能表位肽自身連接，然后再連接至CRM197A蛋白載體N-末端或 者C-末端；還有一種方式是將一個萬能表位肽連接至C-末端或者N-末端，兩個自身連接 萬能表位肽連接至另一端。
[0051] 2-1、含有萬能表位肽P30的P30CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0052] 2-1-1、P30-N-末端CRM197A蛋白載體（稱為P30-CRM197A)氨基酸序列的設計
[0053] 通過將P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白載體的N-末 端，形成一個新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0054] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQ GNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0055] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N-末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為P30-CRM197A蛋白載體。
[0056] 2-1-2、CRM197AC-末端-P30蛋白載體（稱為CRM197A-P30)氨基酸序列的設計
[0057] 通過將P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白載體的C-末 端，形成另一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0058] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVD NENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF ⑶ GASRWLSLPFAEGSS SVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0059] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - P30蛋白載體。
[0060] 2-1-3、P30-N-末端 CRM197AC-末端-P30 蛋白載體（稱為 P30-CRM197A-P30)氨 基酸序列的設計
[0061] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE分別加入至CRM197A蛋白載 體的N-末端和C-末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0062] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQ GNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGT EEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGS GFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0063] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端和C -末端之間插入了 GSGSG 片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - CRM197A - P30蛋白載體。
[0064] 2-1-4、Ρ30-Ρ30-Ν-末端 CRM197A 蛋白載體（稱為 P30-P30-CRM197A)氨基酸序列 的設計
[0065] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的N-末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0066] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENF SSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLAL KVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRG KRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0067] 在兩個自身連接的P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的N-末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - P30 - CRM197A蛋白載體。
[0068] 2-l-5、CRM197AC-末端-P30-P30 蛋白載體（稱為 CRM197A-P30-P30)氨基酸序列 的設計
[0069] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的C-末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0070] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGS GFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0071] 在兩個自身連接的P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - P30 - P30蛋白載體。
[0072] 2 - 1 - 6、P30 - P30 - N -末端 CRM197AC -末端-P30 蛋白載體（稱為 P30 - P30 - CRM197A - P30)氨基酸序列的設計
[0073] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的N-末端；另外，將一個P30加入至CRM197A蛋白載體的C-末端，形成 另一種新的蛋白，其氣基酸序列如下：
[0074] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENF SSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLAL KVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRG KRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0075] 在兩個自身連接的P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - P30CRM197AP30蛋白載體。
[0076] 2 - 1 - 7、P30 - N -末端 CRM197AC -末端-P30 - P30 蛋白載體（稱為 P30 - CRM197A - P30 - P30)氨基酸序列的設計
[0077] 通過將一個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE連接至CRM197A蛋白載體的 N-末端；另外，將兩個P30進行自身連接，然后再加入至CRM197A蛋白載體的C-末端，形成 另一種新的蛋白，其氣基酸序列如下：
[0078] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQ GNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGS GFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0079] 在兩個自身連接的P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C-末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30-CRM197A-P30-P30蛋白載體。
[0080] 二、CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體表達質(zhì)粒的構建
[0081] UCRM197A蛋白載體表達質(zhì)粒的構建
[0082] 從GenBank獲取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，確定CRM197蛋白的A 鏈片段，CRM197的氨基酸1-193為CRM197的A鏈片段。以此為依據(jù)，對該片段的氨基酸的 核酸序列進行優(yōu)化，以便在大腸桿菌表達系統(tǒng)中高效表達。采用自制的表達質(zhì)粒，用Ndel 酶識別質(zhì)粒位點CATATG，BamHI酶識別位點GGATCC。經(jīng)過CRM197A的基因序列進行分析， 在序列內(nèi)，無 Ndel及BamHI酶切位點。CRM197A蛋白基因合成序列如下：
[0083] CATATG
[0084] GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0085] CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0086] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0087] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0088] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0089] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0090] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0091] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0092] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0093] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAAGGATCC
[0094] 向空白質(zhì)粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR產(chǎn)物中，分別加入Nde I酶和Bam HI酶進行雙酶切反應；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成后純化表達質(zhì) 粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。用BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將表達質(zhì)粒轉化 至細胞內(nèi)，篩選克隆。獲得陽性表達工程菌后，建立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存 于-20°C以下冰箱中。
[0095] 2、含有萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體表達質(zhì)粒的構建
[0096] 2-UP30-CRM197A蛋白載體表達質(zhì)粒的構建
[0097] 采用自制的空白表達質(zhì)粒，用Ndel酶識別質(zhì)粒位點CATATG，Bam HI酶識別位點 GGATCC。經(jīng)過P30CRM197A蛋白載體基因序列進行分析，在序列內(nèi)，無 Ndel及BamHI酶切位 點。P30-CRM197A基因合成全序列如下：
[0098] CATATG
[0099] TTCAATAATTTTACGGTGTCGTTTTGGCTGCGTGTCCCGAAAGTCTCTGCGAGTCATCTG
[0100] GAAGGTTCTGGTAGCGGTGGTGCGGATGACGTGGTTGATAGCTCTAAATCTTTCGTTATG
[0101] GAAAACTTCAGTTCCTATCATGGCACCAAACCGGGTTACGTCGATTCGATTCAGAAAGGC
[0102] ATCCAAAAACCGAAAAGCGGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAAGAATTCTAC
[0103] TCAACGGACAACAAATACGATGCGGCCGGCTACTCCGTGGACAACGAAAATCCGCTGAGC
[0104] GGTAAAGCGGGCGGTGTCGTGAAAGTTACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTGCTGGCTCTG
[0105] AAAGTTGATAATGCGGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGCCTGTCCCTGACCGAACCGCTG
[0106] ATGGAACAAGTGGGTACGGAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGACGGTGCCTCTCGCGTT
[0107] GTCCTGAGTCTGCCGTTTGCAGAAGGCTCATCGAGCGTCGAATACATTAACAATTGGGAA
[0108] CAAGCAAAAGCTCTGAGCGTGGAACTGGAAATCAACTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGT
[0109] CAGGATGCGATGTATGAATACATGGCGCAAGCCTGCGCAGGTAATCGTGTTCGTCGC
[0110] GGATCC
[0111] 向空白質(zhì)粒和合成的P30-CRM197A蛋白基因的PCR產(chǎn)物中，分別加入Nde I酶和 Bam HI酶進行雙酶切反應；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成后純化表 達質(zhì)粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。用BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將表達質(zhì)粒轉 化至細胞內(nèi)，篩選克隆，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。獲得陽性表達工程菌后， 建立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存于_2〇°C以下冰箱中。
[0112] 2-2、CRM197AP30、P30CRM197AP30、P30P30CRM197A、CRM197AP30P30、 P30P30CRM197AP30、以及 P30CRM197AP30P30 蛋白表達質(zhì)粒的構建：
[0113] 方法和上節(jié)"2-1、P30CRM197A蛋白表達質(zhì)粒的構建"相同。
[0114] 三、含有萬能表位肽P30CRM197A蛋白載體和CRM197A蛋白載體的制備
[0115] 本發(fā)明的實驗結果表明，CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載 體的特性相似，因此，這些蛋白載體的純化方法相似，以下以含有萬能表位肽的CRM197A蛋 白載體為例說明方法。
[0116] 1、表達含有萬能表位肽P30CRM197A蛋白載體工程菌的制備
[0117] 用分子生物學標準方法將各個表達蛋白載體的質(zhì)粒轉入至感受態(tài)細胞內(nèi)，并進行 表達檢定。篩選出蛋白表達量高，并且通過用抗血清檢定合格的克隆，建立主種子庫和工作 種子庫。
[0118] 2、含有萬能表位肽P30CRM197A蛋白載體表達工程菌的發(fā)酵
[0119] 從大腸桿菌工程菌工作種子庫低溫冰箱中，取出一支含有萬能表位肽P30CRM197A 蛋白載體的工作種子管，在室溫下解凍；將種子管中的菌液無菌轉移至50毫升的培養(yǎng)基 中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養(yǎng)至0D_ = 1. 0左右；將菌液無菌接種至1升培養(yǎng) 基中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養(yǎng)至0D_= 1.0左右；接種種子液至50升發(fā)酵罐 中的20升培養(yǎng)基中，在37°C下，240rpm條件下進行發(fā)酵；當0D_至7-8時，加入IPTG誘導 重組蛋白在細菌中合成；發(fā)酵至14小時后，停止發(fā)酵，離心，收集菌體待用。
[0120] 3、含有萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體的純化
[0121] 由于構建含有不同萬能表位肽的蛋白載體都是以CRM197A為主體，實驗表明，盡 管加入了萬能表位肽，但對蛋白純化的參數(shù)影響不大，只需要在純化CRM197A蛋白載體的 工藝參數(shù)上進行一些修飾，就可建立起其他含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載體的純化方 法。
[0122] 稱重50g濕菌體于2升離心杯中，加入300mllxPBS pH7. 0的緩沖液混懸菌體，在 磁力攪拌器上攪拌混勻30min ;在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清，收集菌體；重復該步 驟兩次；加入300mllxPBS pH7. 0至菌體離心管，在均質(zhì)機上進行破碎；在4°C下，lOOOOrpm， 離心20min，收集沉淀，棄上清液；加入300mllxPBS pH7. 0緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌 30min ;在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清液，收集包涵體；加入900ml變性緩沖液至洗 滌后的包涵體，在25°C下，lOOOOrpm離心30min，收集上清液，棄沉淀；將離心上清液轉移至 6-8KD透析袋中，封閉透析袋，置透析袋于10升復性緩沖液1中，室溫下，在磁力攪拌器上攪 拌透析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩沖液2中，室溫攪拌透析8-10小時；將透析袋 轉入10升復性緩沖液3中，室溫攪拌透析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩沖液4中， 室溫攪拌透析8-10小時；將透析袋轉入10升復性緩沖液5中，室溫攪拌透析過夜；次日將 透析袋轉入2升儲備緩沖液中，室溫攪拌透析8-10小時；更換儲備緩沖液二次，室溫透析過 夜；取lml透析液，室溫12000rpm離心10min,收集上清，測蛋白質(zhì)濃度；將蛋白溶液上樣至 預先平衡的DEAE膠柱，用等梯度洗脫，并收集目的蛋白峰；然后上樣至Phenyl疏水柱進一 步純化，收集洗脫峰；最后上樣SP膠柱，收集洗脫峰；將收集獲得的純化目的蛋白轉至透析 袋中，在0. 15M的氯化鈉中透析，完成后轉移至4°C下儲存待用。
[0123] 四、流行性嗜血桿菌b型菌莢膜多糖的制備
[0124] 1、種子庫的建立
[0125] 取出流行性嗜血桿菌b型菌株作為原始種子株，加入0. 5ml的培養(yǎng)基將菌種混勻， 取0.25ml菌液于5%兔血培養(yǎng)液中。接種后的5%兔血培養(yǎng)液管置于36°C ±1°C的培養(yǎng) 搖床上，搖速120印111，培養(yǎng)12-20小時。待006(|(|至1.0時，用接種環(huán)將5%羊血培養(yǎng)液接種 至培養(yǎng)基平皿上，置于36°C ±1°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12-20小時。用接種環(huán)將瓊脂平皿上的 1至數(shù)個菌落接種于l〇ml的培養(yǎng)液中，置于36°C ±1°C，在培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)12小時，搖速 150-200rpm。培養(yǎng)液中細菌0D6(?長到1. 0,取出5ml細菌培養(yǎng)液接種到200ml的新鮮培養(yǎng) 液中，置于36°C ±1°C的培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)12小時左右，搖速150-200rpm。0D6QQ至1. 0時， 將細菌培養(yǎng)液以lml分裝于200個小試管中，離心（4000rpm，lOmin)，去除上清培養(yǎng)液，然后 加入0. 5ml的新鮮培養(yǎng)液和0. 5ml的無菌脫脂牛奶，混勻，在乙醇干冰上快速冷凍。真空凍 干，編號，作為主種子批保存于4°C冰箱內(nèi)。取出主種子批建立，按照主種子建立方法，將細 菌培養(yǎng)液接種到另一個200ml的新鮮培養(yǎng)液中，置于36°C ±1°C的培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)12小時 左右，搖速150-200rpm。待0D6(?至1. 0時，將細菌培養(yǎng)液以lml分裝于200個小試管中，離 心（4000rpm，lOmin)，去除上清培養(yǎng)液，然后加入0. 6ml的新鮮AHC培養(yǎng)液和0. 4ml的40% 甘油溶液，混勻。速凍于干冰上，作為工作種子保存于_70°C低溫冰箱中。
[0126] 2、細菌發(fā)酵
[0127] 將流行性嗜血桿菌b型工作種子接種到平皿培養(yǎng)基上，在36. 5°C培養(yǎng)箱過夜。取 一個Hib菌斑，接種到5毫升的新鮮基本培養(yǎng)液中，在36. 5°C和300rpm細菌培養(yǎng)搖床培養(yǎng)。 當接種的培養(yǎng)液達到了指數(shù)生長中期，OD為0. 6-1. 0,將接種的培養(yǎng)液轉接到250毫升培養(yǎng) 瓶中，其中有45毫升的新鮮基本培養(yǎng)液，在36. 5°C和300rpm細菌培養(yǎng)搖床培養(yǎng)。當接種的 培養(yǎng)液達到了指數(shù)生長中期，OD為0. 6-1. 0,將接種的培養(yǎng)液轉接到4升培養(yǎng)瓶中，其中有 1升的新鮮基本培養(yǎng)液，在36. 5°C和300rpm細菌培養(yǎng)搖床培養(yǎng)。當接種的培養(yǎng)液達到了指 數(shù)生長中期（約16-18小時），OD為0. 6-1. 0,將接種的培養(yǎng)液轉接到發(fā)酵罐中，其中有20 升的新鮮基本培養(yǎng)液。當Hib細菌達到指數(shù)生長中期時，加入新鮮基本培養(yǎng)液和補充培養(yǎng) 液，最終培養(yǎng)液中的糖濃度為23g/l，所加入的新鮮補充培養(yǎng)液的總體積為25升。培養(yǎng)14. 5 小時停止發(fā)酵。
[0128] 3、多糖純化
[0129] 將Hib培養(yǎng)液離心沉淀的Hib菌體，懸浮在2升的蒸餾水中，用磁力攪拌器混勻。 加入200ml的12% Deoxycholate sodium溶液入細菌懸浮液中，攪拌混勻30分鐘，然后轉 入到10°C ±3°C冷柜中攪拌8-24小時，保證菌體完全裂解、多糖釋放出來。用50%的醋 酸調(diào)節(jié)細菌裂解液的pH值到6. 4 - 6. 8,溫度為20°C ±5°C，停止攪拌，靜置12 - 24小時。 以10, OOOrpm離心1小時，收集上清液，丟棄沉淀物，用0. 05M的磷酸鹽pH7. 0透析多糖上 清液。加入等體積的〇. 2% HB溶液，用磁力攪拌器混勻30分鐘，然后，轉入到4°C冷柜中靜 置過夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉淀，丟棄上清液，加入100ml的0. 5M氯化鈉溶液 溶解沉淀；加入680ml無水乙醇，混勻，然后，轉入到4°C冷柜中靜置過夜。以10, OOOrpm離 心30min，收集上清液，丟棄沉淀，加入5. 2升無水乙醇，混勻，然后，轉入到4°C冷柜中靜置 過夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉淀，丟棄上清液，加入500ml的蒸餾水溶解沉淀，透 析。凍干。
[0130] 步驟二：Hib-P30CRM197A結合物的制備及免疫原性的評估
[0131] 多糖蛋白結合物的合成包括含有萬能表位肽P30的Hib-P30CRM197A結合物和不 含萬能表位肽P30的Hib-CRM197A結合物的合成，兩種結合物的合成方法相同。含有P30 萬能表位肽的Hib-P30CRM197A結合物包括：
[0132] Hib-P30-CRM197A、Hib-CRM197A-P30、Hib-P30-CRM197A-P30、 Hib-P30-P30-CRM197A、Hib-CRM197A-P30-P30、Hib-P30-P30-CRM197A-P30 和 Hib-P30-CRM197A-P30-P30。
[0133] 1、多糖蛋白結合物的合成
[0134] 稱取5mg純化Hib莢膜多糖于反應瓶中，量取0. 5ml的lmol/L NaCl加入反應瓶 中，磁力攪拌使多糖完全溶解，記錄多糖溶液的初始pH。分別量取適量的CDAP溶液，加入反 應瓶中，室溫下攪拌反應1.5min，30s時測定溶液的pH。1.5min后，用0. 2mol/L NaOH調(diào)節(jié) 溶液的pH至9. 5,室溫下攪拌反應3min (用0· 2mol/L NaOH維持pH在9. 5)。3min后立即向 反應瓶中加入5mg的P30CRM197A蛋白，在室溫下（25°C )攪拌反應lh。量取37. 5 μ 12mol/L 賴氨酸加入反應瓶中，用〇. 1M的HC1調(diào)節(jié)溶液pH至9. 0,室溫下攪拌反應30min，將反應瓶 轉移到4°C下反應過夜。將反應混合物轉移至透析袋（MWC06-8000)中，在4°C下，用0. 85% NaCl溶液透析3次，6L/次。透析結束后將反應混合液lOOOOrpm，離心lOmin后取上清液， 采用Sepharose CL-4B凝膠柱純化透析后的多糖結合物，并收集結合物峰，取樣送檢。
[0135] 2、免疫用Hib-P30CRM197A結合疫苗的制備
[0136] 分別將Hib-CRM197A和Hib-P30CRM197A結合物純化液進行稀釋，至多糖濃度約為 25μ g/ml，用0. 22μπι膜除菌過濾，加入無菌磷酸鋁膠，最終鋁離子濃度為125mg/ml ;用緩 沖液定容至最終體積；灌裝，〇. 5ml/瓶。
[0137] 3、結合疫苗免疫及采血
[0138] 取5-6周的KM57系小鼠240只，每支小鼠免疫注射制備的7種Hib-P30CRM197A 結合疫苗，注射容量為〇. lml/支小鼠/次。每種結合疫苗設定為三組，即免疫注射一針、二 針和三針。
[0139] 采集小鼠血液至離心管，在室溫下靜置2小時，在lOOOOrpm條件下離心10分鐘， 用移液槍小心吸取離心上清血清，儲存于4°C冰箱中，待檢。
[0140] 4、ELISA法檢測小鼠血清中Hib多糖抗體IgG滴度及結合物免疫原性的評估
[0141] 配制Hib莢膜多糖儲備液lmg/ml (1XPBS溶液中），存儲于冰箱中。用包被緩沖液 稀釋至4 μ g/ml,加100 μ 1包被溶液到每一個孔中來包被ELISA板，在室溫下孵育過夜。用 洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1封閉緩沖液，在室溫下孵育2小時，用洗板緩沖液洗4次， 可在4°C下保存一周。
[0142] 將小鼠注射結合疫苗及對照樣品獲得的待測血清，以1:10稀釋成工作樣品血清， 稀釋適當倍數(shù)，加入到ELISA板第一排孔內(nèi)，總體積200 μ 1，從第一排開始向下進行二倍系 列稀釋，在室溫下孵育2小時。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1堿性磷酸酶標記羊抗鼠 抗體（1:2000稀釋），在室溫下孵育4小時。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1磷酸-4-硝 基苯酯二鈉鹽底物溶液，在405nm讀盤。
[0143] 下表為小鼠結合物免疫血清中多糖IgG抗體滴度結果表：
[0144]
【權利要求】
1. 一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于： 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (簡稱P30)，通過基因重組工程菌來生產(chǎn)含有P30的CRM197A蛋白 載體（簡稱 P30CRM197A); 步驟二：將流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵形式連接到P30CRM197A蛋白載體上形 成流行性嗜血桿菌b型多糖-P30CRM197A結合物。
2. 根據(jù)權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特征在于：在所述含有P30CRM197A的蛋白載體中含有X個P30,1彡X彡3。
3. 根據(jù)權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特征在于：在P30CRM197A蛋白載體中，P30連結在CRM197A蛋白的N-末端或C-末端，或 者同時連接在N-末端和C-末端。
4. 根據(jù)權利要求1、2或3所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的 方法，其特征在于：在P30CRM197A蛋白載體中，所述P30與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG 氨基酸序列進行連接。
5. 根據(jù)權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特征在于：所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
6. 根據(jù)權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特征在于：所述流行性嗜血桿菌b型多糖是通過培養(yǎng)流行性嗜血桿菌b型菌獲得的莢膜 多糖。
【文檔編號】A61K47/48GK104096224SQ201410198755
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年5月11日 優(yōu)先權日:2014年5月11日
【發(fā)明者】李建平 申請人:江蘇康泰生物醫(yī)學技術有限公司